Il DPP influenza il destino cellulare legando i recettori e inviando un segnale intracellulare per influenzare la trascrizione. Se DPP viene prodotto ma non rilasciato, non ha accesso ai recettori e quindi non può svolgere i suoi ruoli. Questa tecnica consente di visualizzare il rilascio di DPP consentendo ai ricercatori di esaminare quali fattori genetici e ambientali cambiano la dinamica di rilascio del DPP.
La via di segnalazione BMP è conservata dalle mosche agli esseri umani, quindi ci aspettiamo che il meccanismo che impone il rilascio di DPP sia rilevante anche per lo sviluppo e la rigenerazione umana. Inizia incrociando da 30 a 40 mosche DPP GAL4 femminili vergini con 10-15 mosche UAS DPP-GFP maschili. Incoraggiare la deposizione delle uova aggiungendo una piccola quantità di pasta di lievito a una fiala fresca di cibo.
Per raccogliere le uova, capovolgere le mosche incrociate nella fiala e consentire loro di deporre per tre o quattro ore prima di rimuoverle. Mantenere le fiale di raccolta delle uova a 25 gradi Celsius per circa 144 ore fino a quando le larve non sono al terzo stadio instar. Quindi selezionare le larve appropriate per la dissezione.
In primo luogo, scegli larve che non sono TB che saranno di lunghezza normale piuttosto che corte e grasse. Per selezionare le larve che esprimono il DPP-GFP, visualizzarle al microscopio stereo a fluorescenza. Tutte le larve non TB avranno una certa fluorescenza, ma la GFP è limitata ai dischi delle ali ed è meno luminosa sulle larve DPP-GFP.
Preparare supporti HL3 modificati secondo le indicazioni manoscritte che manterranno in vita i dischi delle ali per l'imaging. Regolare il pH a 7.1 con HEPES, quindi filtrarlo attraverso un filtro da 0,22 micrometri. Posizionare due pezzi di larghezza del nastro a doppia fronte incolore in modo saggio su uno scivolo del microscopio lasciando uno spazio di circa cinque millimetri tra di loro e assicurandosi che le estremità del nastro giacciono arrossate con i bordi della diapositiva.
Utilizzare un bordo piatto per premere saldamente il nastro nella diapositiva. Aggiungere 25 microlitri del supporto HL3 modificato tra i due pezzi di nastro. Quando il disco dell'ala è montato nel supporto, i pezzi di nastro impediranno che venga schiacciato dal coperchio.
Per sezionare la larva, posizionarla nel supporto HL3 modificato e strapparla delicatamente a metà usando due paia di forcep. Scartare la metà posteriore, quindi afferrare il centro della metà anteriore con un paio di forcep e utilizzare l'altra coppia per spingere i ganci della bocca nella larva fino a quando non è completamente invertita. Cerca le curve affilate nei due rami primari di colore più scuro della trachea che corrono su entrambi i lati della larva.
I dischi delle ali giacciono direttamente sotto. Rimuovere delicatamente i dischi e metterli nel supporto HL3 sulla diapositiva preparata assicurandosi che nessun pezzo di trachea sia ancora attaccato ai dischi. Disporre i dischi delle ali in modo che il lato peripodiale della borsa dell'ala sia rivolto verso l'alto con il disco piatto.
Coprire l'ala con un coverslip e sigillare con smalto per unghie. Una volta che lo smalto è asciutto, procedere immediatamente con l'imaging. Immagine del disco alare montato utilizzando un microscopio a scansione laser confocale con un obiettivo di olio 40X e un laser da 488 nanometri.
Raccogli immagini a una velocità di due hertz per due minuti. Per ottenere i migliori risultati, imposta la potenza del laser abbastanza forte da ottenere un'immagine chiara delle cellule che rilasciano DPP per evitare lo sbiancamento. Raccogli le immagini come serie temporali ed esportale come file AVI per ottenere un video della versione DPP.
Quando il protocollo ha successo, il DPP-GFP appare come una striscia verso il centro del disco alare con nuclei visibili come cerchi non fluorescenti. Il rilascio di DPP-GFP è visibile come puncta fluorescente che appare e scompare sia all'interno che lontano dai corpi cellulari. I puncta distinti sono probabili nei citotoni o nelle sinapsi dei citotoni.
I dischi delle ali sono montati in modo che l'imaging sia fatto dal lato peripodiale. Se il disco alare viene visualizzato dal retro, la fluorescenza DPP-GFP apparirà fuori fuoco e la risoluzione sarà scarsa. Quando la GFP non viene fusa al DPP, non si osserva no puncta al di fuori dei corpi cellulari.
Questo controllo dimostra che DPP-GFP si comporta in modo diverso rispetto alla sola GFP. Inoltre, non compaiono puncta fluorescenti quando il DPP-GFP non è espresso. Durante questa procedura, è importante che il disco dell'ala sia montato lateralmente peripodiale verso l'alto.
Se il disco dell'ala è orientato in modo improprio, DPP-GFP apparirà fuori fuoco. Questo metodo potrebbe essere usato per studiare il rilascio di altri ligandi di segnalazione dello sviluppo come ala o riccio. Possiamo esplorare tutti i diversi fattori ambientali e genetici che possono influenzare il rilascio di DPP.
Inoltre, possiamo adattare questo metodo per studiare il rilascio di BMP da altri tipi di cellule.
