Questo sistema organoide del condotto biliare extraepatico murino può affrontare il limitato accesso ai modelli di colangiopatie precliniche e i limiti dei modelli organoidi di cellule staminali pluripotenti e corigiociti derivati dal fegato. Il nostro modello è specifico per i tessuti adulti, riduzionista, riproducibile ed efficiente in termini di tempo e costi. Sarà di particolare beneficio per i laboratori che non hanno accesso ai tessuti umani.
La nostra tecnica consente la coltivazione di un numero quasi illimitato di conlangiociti del condotto biliare extraepatico per studiare la rigenerazione dei tessuti e le interazioni cellula-cellula. A dimostrare la procedura sarà Junya Shiota, un post-doc del mio laboratorio. Per l'isolamento intraepatico del condotto biliare, posizionare il topo adulto in posizione supina e aprire la cavità addominale lungo la linea mediana.
Ritrarre il fegato per riposare sul diaframma e utilizzare un emostato per estrarre delicatamente il duodeno prossimale per rivelare il condotto biliare comune immediatamente sotto l'hilum epatico. Utilizzare un bisturi per separare il condotto biliare extraepatico dai tessuti circostanti. Tenendo l'estremità prossimale del condotto biliare comune con le forcep, sezionare il condotto distally appena sopra la sua congiuntura con il duodeno prima di sezionare l'estremità prossimale del condotto dal fegato.
Posizionare immediatamente il condotto biliare extraepatico isolato in una piastra di vetro contenente tampone di lavaggio freddo sul ghiaccio, quindi pulire il condotto biliare dal tessuto circostante e tritare in sezioni di 0,5 millimetri. Quando tutto il tessuto è stato tritato, trasferire le sezioni in un tubo contenente 500 microlitri di tampone di dissociazione per un'incubazione di 20 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della dissociazione, neutralizzare il tampone con 500 microlitri di terreno di coltura delle cellule ghiacciate e triturare la sospensione tissutale 20 volte attraverso un ago calibro 18 e quindi 20 volte attraverso un ago calibro 20.
Quindi filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micrometri in un tubo da 50 millilitri. Per stabilire una coltura organoide biliare, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimuovere con cura il supernatante. Rimorsi il pellet in un millilitro di PBS sterile e ghiacciato e trasferire le cellule in un tubo da 1,5 millilitri per una seconda centrifugazione.
Rimostrare il pellet lavato in 120 microlitri di matrice seminterrata liqueficata e ghiacciata e piastra 40 microlitri di cellule al centro di ciascuno dei tre pozzi di una piastra riscaldata a 37 gradi Celsius e 24 po ', quindi posizionare la piastra in un incubatore di coltura tissutale di 37 gradi Celsius per circa 15 minuti. Quando la matrice del seminterrato si è solidificata, aggiungere 600 microlitri di 37 gradi Celsius mezzo di semina ad ogni pozzo prima di restituire la piastra all'incubatore. Dopo tre giorni e tre giorni dopo, sostituire il mezzo di semina con 600 microlitri di mezzo di coltura organoide fresco, monitorando regolarmente la crescita organoide con un microscopio invertito.
Per passare le colture extraepatiche del condotto biliare, pipettare gli organoidi in ogni pozzo con 400 microlitri di PBS ghiacciato 10 volte per pozzo prima di trasferire il contenuto del pozzo su singoli tubi da 1,5 millilitri. Passare ogni miscela attraverso un ago calibro 25 quattro volte per dissociare gli organoidi e raccogliere le cellule per centrifugazione. Quindi rimospendare le celle nella matrice del seminterrato al rapporto appropriato per la ri-placcatura.
Per la conservazione organoide del condotto biliare extraepatico a lungo termine, lavare ogni pozzo di organoidi con PBS a temperatura ambiente senza disturbare le gocce della matrice del seminterrato e aggiungere 500 microlitri di mezzo gelido ghiacciato ad ogni pozzo. Rimostrare delicatamente gli organoidi e trasferire la miscela in singole fiale criogeniche, quindi posizionare le fiale a meno 80 gradi Celsius per 48 ore prima di trasferire gli organoidi in un serbatoio di azoto per lo stoccaggio a lungo termine in una fase di vapore. Per preparare gli organoidi per l'incorporamento della paraffina, sostituire il mezzo con 500 microlitri di quattro gradi Celsius PBS e trasferire la sospensione da ogni pozzo in singoli tubi da 1,5 millilitri contenenti matrice seminterrata liquefatta.
Raccogliere gli organoidi per centrifugazione e utilizzare una punta di pipetta P1000 modificata per rimuovere con cura i supernatanti senza disturbare il pellet. Quindi aggiungere un millilitro di ghiaccio freddo, paraformaldeide al 4% agli organoidi per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius. La mattina seguente, sostituire il fissatore con un millilitro di PBS a temperatura ambiente per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente e lavare gli organoidi con centrifugazione tre volte.
Dopo l'ultimo lavaggio, resuspend gli organoidi in un millilitro di 30% di etanolo per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente, seguita da un'incubazione di cinque minuti in un millilitro di 70% di etanolo a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione del 70% di etanolo, raccogliere gli organoidi mediante centrifugazione e rimosorne gli organoidi in un millilitro di etanolo al 100% per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione al 100% di etanolo, il gel di lavorazione del campione di calore in un forno a microonde per 20 secondi o fino a quando non viene liquefatto e aggiungere 50 microlitri del gel liquefatto a ciascun tubo di organoidi.
Posizionare i tubi sul ghiaccio fino a quando il gel di lavorazione del campione non viene solidificato e trasferire la goccia di organoidi da ciascun tubo a tra i cuscinetti di spugna blu in una cassetta per un'ulteriore lavorazione nell'incorporatore di paraffina. Posizionare la cassetta in un processore tissutale programmato per 15 minuti per passaggio, quindi sessare gli organoidi incorporati nella paraffina nel gel di lavorazione del campione a quattro micrometri per sezione per la colorazione e l'analisi immunoistochimica secondo protocolli standard. L'efficienza di placcatura organoide del condotto biliare extraepatico è di circa il 2% se isolata da topi neonatale o adulto.
Dopo il secondo passaggio, l'efficienza di placcatura degli organoidi del condotto biliare extraepatico derivati da topi adulti aumenta all'11% e rimane stabile. La maggior parte degli organoidi dimostra una morfologia cistica in tutti i passaggi con rari organoidi irregolari. Gli organoidi raggiungono un picco di crescita da cinque a sette giorni, dopo di che iniziano ad accumulare detriti intraluminali e si deteriorano.
Pertanto, per il mantenimento della coltura organoide, gli organoidi devono essere divisi ogni sette-10 giorni. Se analizzati con immunofluorescenza, gli organoidi del condotto biliare extraepatico consistono in una popolazione pura di cellule epiteliali marcate da E-cadherina. Le cellule organoidi dimostrano anche marcatori di cellule progenitrici biliari e marcatori di differenziazione biliare.
È importante sottolineare che un'alta percentuale di cellule organoidi possiede un cilio primario segnato da alfa tubulina acetilata, che è una caratteristica dei normali corilangiociti e suggerisce un'appropriata polarizzazione delle cellule organoidi. È necessaria una stretta aderenza alla condizione di temperatura descritta. La meticolosa dissezione del condotto biliare previene la contaminazione delle cellule del pancreas.
La perdita di materiale cellulare può essere evitata con un'attenta manipolazione dopo la centrifugazione. Questi organoidi possono essere usati come modelli preclinici, geneticamente e farmacologicamente manipolati, o utilizzati per testare farmaci e gli effetti degli agenti infettivi. Questo metodo può essere utilizzato da laboratori che vogliono sfruttare modelli di topi geneticamente modificati per studiare ulteriormente i meccanismi della biologia dei conlangiociti.
