Gli autori desiderano ringraziare Eleonora Fleming e Jessica Chen per le discussioni utili. Il finanziamento è stato fornito da Istituto Nazionale di allergie e malattie infettive (NIAID-NIH) e un Premio R15AI079685 Research Corporation Cottrell Award Science College. Sostegno degli studenti sono state fornite dal Howard Hughes Medical Institute e del fondo Staley.

1. Preparazione di grandi vescicole lipidiche unilamellari (luvs) <ol><li> Preparare luvs a servire come membrana cellulare imita per il dosaggio 19. </li><li> Mix fosfatidilcolina (POPC, 760,10 g / mol), fosfatidilglicerolo (POPG. 770,99 g / mol), 5-dimethylaminonaphthalene-1-sulfonil fosfatidiletanolammina (DNS-PAPA, 994,350 g / mol) (Avanti Polar Lipids) disciolto in cloroformio in un 50 : rapporto 45:5. Come ogni test richiede la gestione separata di luvs sia sperimentale e di controllo, due fiale torta dei lipidi deve essere preparato. 0,376 mg di lipidi totali (0,188 mg POPC, POPG 0,169 mg e 0,019 mg di DNS-PAPA) è solitamente sufficiente a rendere vescicole sufficiente per una prova traslocazione singolo. </li><li> Evaporare cloroformio utilizzando un flusso di gas N 2. </li><li> Asciutto la torta lipidi 9-14 ore in un essiccatore a vuoto. </li><li> Preparare uno stock 10 mM HEPES soluzione tampone (10 mM HEPES, 238,3 g / mol, 45 mM NaCl, 58,44 g / mol, 1 mM EDTA, 372,24 g / mol pH 7,4). Tampone HEPES è stOR a 4 ° C. </li><li> Preparare una soluzione madre di 0,4 mm suina tripsina (23,3 kg / mol) in 10 mM tampone HEPES preparato in precedenza. La tripsina è conservato a -20 ° C e, nella nostra pratica, di solito non subisce più di 2 cicli gelo-disgelo prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare una soluzione madre di 4,0 mm Bowman-Birk inibitore della tripsina (8 kg / mol) in 10 mM di soluzione tampone HEPES e conservare a -20 ° C. Nel nostro uso, questo stock è rifornito mensilmente e di solito non subisce più di 3 cicli di gelo / disgelo prima che sia reso di nuovo. </li><li> Ricostituire vescicole sperimentale multilamellari (MLV) in una soluzione 0,2 mM tripsina con l&#39;aggiunta di un uguale volume di magazzino tripsina 0,4 mM e 10 mM tampone HEPES soluzione alla torta secca lipidica. Per un singolo campione di 0,376 mg di lipidi totali, una miscela di 150 ml di soluzione di tripsina e 150 ml di tampone HEPES è sufficiente. </li><li> Controllo MLV ricostituire in una soluzione con tripsina 0,2 mm e 2,0 mm Bowman-Birk inibitore della tripsina con l&#39;aggiunta di un uguale volume di 0.4 mM magazzino tripsina e 4,0 mM inibitore della tripsina per i dolci secchi lipidi. Per un singolo campione di 0,376 mg di lipidi totali, una miscela di 150 ml di soluzione di tripsina e 150 ml di inibitore della tripsina è sufficiente. </li><li> Trasferire soluzioni MLV da fiale di vetro a 1,7 ml di tubo microcentrifuga. </li><li> Oggetto MLV soluzioni a 5 cicli gelo / disgelo in azoto liquido. </li><li> Preparare lipidi estrusore (Avanti Polar Lipids) inserendo due supporti filtro inumidito con tampone HEPES su ogni pezzo in teflon estrusore. Inserire una membrana nuclepore traccia incisa con 0,1 micron pori (Whatman, Regno Unito) tra i due pezzi di Teflon estrusore, e disporre i pezzi estrusore all&#39;interno del contenitore metallico estrusore. Posizionare il distanziale ciambella sopra i due pezzi estrusore prima di stringere la parte superiore in metallo del filtro estrusore e inserirlo nella porta. </li><li> Riempire il volume vuoto all&#39;interno della estrusore con 500 microlitri di buffer 10 mM HEPES usando una siringa da 250 microlitri di vetro per evitare la perdita di campione vescicole. &lt;/ Li&gt; <li> Caricare ogni campione MLV nel estrusore e spingere il campione attraverso la membrana almeno 21 volte per assicurare uniformi dimensioni unilamellari vescicola. Luvs sono ottenuti dalla estrusione seguente soluzione MLV. </li><li> Luvs conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 48 ore. </li></ol> 2. Quantificare LUV Concentrazione <ol><li> LUV concentrazione è stata quantificata mediante determinazione del contenuto di fosforo totale presente nel campione 20. </li><li> Preparare 8,9 NH 2 SO 4 in acqua Nanopure e conservare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare un 2,5% w / v di ammonio molibdato VI (588,04 g / mol), soluzione in acqua Nanopure. Preparare al 10% w / v acido ascorbico (176,1 g / mol) la soluzione in acqua Nanopure. Proteggere la soluzione di acido ascorbico da esposizione alla luce coprendo il tubo con un foglio. Conservare entrambe le soluzioni a 4 ° C per un massimo di 2 mesi. </li><li> Preparare 0,65 mM fosfato soluzione tampone (sodio fosfato monobasico anidro, 120 g / mol). </li><li> Preparare sei normale tubes. Gli standard dovrebbero contenere 0,0 microlitri, 50 microlitri (0,0325 μmoles), 100 l (0,065 μmoles), 175 microlitri (0,114 μmoles), 250 microlitri (0,163 μmoles), o 350 microlitri (0,228 μmoles) di soluzione di fosforo. </li><li> Preparare LUV provette in triplice copia. Ogni tubo campione dovrebbe contenere circa 0,1 μmoles di luvs. Sperimentale e di controllo LUV concentrazioni devono essere misurate separatamente. </li><li> Per correggere eventuali sali di fosforo asciugato in Bowman-Birk in polvere inibitore, un controllo LUV vuoto deve essere preparato. Il bianco deve contenere lo stesso volume del 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk soluzione inibitore come è stata posta nel controllo LUV provetta. </li><li> Mettere 450 ml di 8,9 NH 2 SO 4 in ciascuno dei campioni, standard, e tubi vuoti. </li><li> Campioni di calore, gli standard e gli spazi per 25 minuti a 175-210 ° C in un forno. </li><li> Rimuovere tutti i tubi e lasciare raffreddare. Aggiungere 150 ml di 30% di H 2 O 2 a ciascuno dei tubes. </li><li> Campioni di calore, gli standard e gli spazi per 30 minuti a 175-210 ° C. </li><li> Rimuovere i campioni, gli standard e gli spazi di calore. Se una delle soluzioni non sono ancora incolore, aggiungere 50 microlitri di H 2 O 2 a tutti i tubi e il calore per altri 15 minuti a 175-210 ° C. </li><li> Aggiungere 3,9 mL Nanopure H 2 O, 0,5 ml di soluzione di ammonio molibdato e 0,5 mL di soluzione di acido ascorbico ad ogni provetta. </li><li> Tutti i tubi di calore per 5-7 minuti in un bagno di acqua bollente. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza di ogni standard e campione a 820 nm utilizzando un Agilent 8453 spettrofotometro UV-Visibile. La provetta contenente 0,0 mmol fosforo dovrebbe essere usato come la protezione da tutti gli standard e sperimentali LUV campioni. Il tubo che contiene il 0,2 mM trypsin/2.0 mM Bowman-Birk soluzione inibitori dovrebbero essere usati come bianco per il controllo LUV campione. </li><li> Un lineare contenuto assorbanza vs fosforo curva standard può essere prodotto ed utilizzato per calcolare il totale phosphOrus LUV contenuto e la concentrazione dei campioni. </li></ol> 3. Preparazione Soluzioni Peptide <ol><li> Sciogliere peptide in Nanopure H 2 O. Peptidi utilizzati in questo test come descritto deve contenere un residuo di triptofano. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza della soluzione di peptidi a 282 nm in triplice copia. Calcolare la concentrazione del peptide utilizzando il coefficiente di estinzione molare per triptofano di 5700 M -1 cm -1. </li><li> Diluire in acqua peptide Nanopure ad una concentrazione finale di 30 micron. Conservare a -20 ° C </li></ol> 4. Traslocazione Quantificazione <ol><li> Preparazione di campioni sperimentali e di controllo in tubi da microcentrifuga 1,7 ml. Aggiungi luvs sufficiente per ogni soluzione per una concentrazione finale di 250 micron. Aggiungi sufficiente Bowman-Birk soluzione inibitore in modo che inibitore è una concentrazione finale 10 volte superiore alla concentrazione tripsina. Aggiungi abbastanza 10 mM tampone HEPES per portare il volume finale di soluzione a 450 microlitri. </li> &lt;li&gt; si pongono 50 microlitri soluzione peptide in un fluorimetro Starna micro cella di quarzo. Il rapporto tra luvs e peptide è sufficientemente alta da assicurare che praticamente tutti i peptidi intatti sono in stretta vicinanza ad un gruppo abbastanza dansyl per dare un segnale FRET, anche se nessuno ha traslocato nella vescicola. Ciò è coerente con l&#39;analogo FRET osservato in condizioni di controllo per i peptidi che fanno e non traslocare in vescicole. </li><li> Aggiungere il campione sperimentale o di controllo per la soluzione del peptide nella cuvetta. Questo dovrebbe portare la concentrazione del peptide finale a 3 micron. </li><li> Iniziare un esperimento di 25 minuti fluorescenti cinetica immediatamente dopo l&#39;aggiunta di sperimentale o di controllo LUV soluzione, prendendo una lettura fluorescenza almeno una volta al secondo. Impostare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione a 280 nm, la lunghezza d&#39;onda di emissione a 525 nm, e la temperatura a 25 ° C. Utilizzando un spettrofotometro Cary Eclipse a fluorescenza, abbiamo impostato la sensibilità PMT ad alta. </li></ol><html> 5. Generazione di un rapporto quantitativo Traslocazione <ol><li> Definire fluorescenza iniziale (F o) come la lettura a fluorescenza, dopo quindici secondi di raccolta dei dati. Nella nostra configurazione dello strumento, abbiamo trovato che i primi quindici secondi di fluorescenza dati raccolti sono inaffidabili a causa della miscelazione, la chiusura della camera campione, e le altre perturbazioni al sistema dopo l&#39;aggiunta del campione. Dividere ogni lettura successiva o F per ottenere la fluorescenza relativa (F / F 0) in ogni punto. </li><li> Media tutte le letture relative a fluorescenza da l&#39;ultimo minuto della sperimentazione per ottenere un finale fluorescenza relativa media <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> . </li><li> Dividere il <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> per i campioni di controllo da parte della <img alt="[F / Fo] avg" src="/files/ftp_upload/3571/3571eq1.jpg" /> per i campioni sperimentali per ottenere un corretto valore finale fluorescenza. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Risultati Rappresentante La Figura 2 mostra i risultati di questo test un peptide rappresentante che ha mostrato la traslocazione robusto. Il segnale in questo esperimento (traccia nera) mostra un netto calo della FRET segnale nel tempo. Tuttavia, è importante controllare per la potenziale perdita di segnale FRET a causa dell&#39;inibizione tripsina incomplete o altri fattori non correlati alla capacità di traslocazione. A tal fine, abbiamo sempre anche misurare il segnale FRET tra peptide e luvs contenenti sia tripsina e Bowman-Birk inibitore della tripsina (grigio traccia, Figura 2). Nelle nostre mani, è stato importante effettuare questo controllo per ogni peptide ogni volta che viene eseguito un esperimento. Questo ci permette di correggere in modo chiaro per eventuali variazioni del segnale a causa di eventuali differenze tra le preparazioni delle vescicole lipidiche o rumore dello strumento, che può essere significativo per i segnali relativamente deboli fluorescenti tipicamente osservati a queste concentrazioni. L&#39;importanza del controllo esperiment utilizzando luvs contenenti inibitori della tripsina è evidenziata dai dati mostrati in Figura 3. In questo caso, il segnale è diminuito peptide una quantità simile a quella in figura 2 nel campione sperimentale (traccia nera). Tuttavia, il campione di controllo mostra un calo più rapido di questo peptide, quindi la sua traslocazione netto è più basso. Sezione 5 del nostro protocollo descrive un metodo semplice per quantificare traslocazione da questo esperimento. Rapporti di traslocazione superiori sono indicativi di peptidi che traslocare in modo efficace; il rapporto di traslocazione per il peptide cellula penetrando mostrato nella Figura 2 è 1,16, mentre debolmente peptidi translocating hanno rapporti traslocazione più vicino a 1. Nella nostra esperienza, l&#39;errore standard di tre esperimenti indipendenti eseguiti con preparazioni diverse vescicola è nel range da 0,01 a 0,06. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica di translocatsaggio di ioni. Sperimentale LUV campioni (A) sono drogato con fluorescenti PAPA dansyl (barre nere) e contengono incapsulato tripsina (forbici). Inibitore della tripsina (cerchio rosso) è utilizzato per inibire la tripsina al di fuori del luvs. Il luvs sono esposti al peptide (viola). Peptide di associazione con i rendimenti LUV membrane uno FRET segnale (verde), che diminuisce man mano che i peptidi translocting incontro disinibita tripsina interno. Sia tripsina e inibitore della tripsina sono incapsulati in controllo LUV campioni (B) per misurare la diminuzione del segnale FRET estranei a traslocazione. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig2.jpg" /> Figura 2. Dati rappresentativi per una cella-peptide penetrante. Un rappresentante translocating pepide antimicrobica mostra un calo significativo FRET segnale rispetto al suo controllo. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3571/3571fig3.jpg" /> Figura3. Dati rappresentativi sottolineando l&#39;importanza del controllo. Incompleta inibizione della digestione trittico di un non-peptidico translocating porta ad un calo di FRET segnale nel tempo in entrambe le sperimentali e di controllo LUV soluzioni. Perché la differenza tra il controllo e le tracce sperimentale è relativamente piccola, questo mutante è caratterizzato come un peptide debolmente translocating.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il protocollo presentato qui può essere utilizzato per valutare la variazione relativa della concentrazione di peptidi all&#39;interno e all&#39;esterno delle vescicole lipidiche. Questi cambiamenti sono legati alla capacità di traslocazione. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare cellule penetrante peptidi con potenziale come vettori di consegna della droga. Come interesse nella cella-penetrante peptidi cresce, sarà interessante vedere come i metodi che misurano direttamente l&#39;evento traslocaz...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PG </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 840457C </td></tr><tr><td> 01:18 Dansyl PE </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 810330C </td></tr><tr><td> 16:00-18:01 PC </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 850457C </td></tr><tr><td> Suini tripsina </td><td> Sigma </td><td> T-0303 </td></tr><tr><td> Bowman-Birk tripsina / chimotripsina inibitore </td><td> Sigma </td><td> T-9777 </td></tr><tr><td> Mini-estrusore </td><td> Lipidi Avanti Polar </td><td> 610000 </td></tr><tr><td> Ammonio molibdato (para) </td><td> Alfa Aesar </td><td> 10811 </td></tr><tr><td> Acido L-ascorbico </td><td> Sigma </td><td> A1417 </td></tr><tr><td> Perossido di idrogeno, 30% di soluzione </td><td> Mallinckrodt prodotti chimici </td><td> 5240-05 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Sigma </td><td> H-3375 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S-9625 &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> S-0751 </td></tr></tbody></table>

measuring peptide translocation into large unilamellar vesicles

C&#39;è un interesse attivo nel peptidi che attraversano facilmente le membrane cellulari senza l&#39;ausilio di recettori di membrana delle cellule 1. Molti di questi sono indicati come cella penetrante peptidi, che sono spesso noti per il loro potenziale come vettori di consegna della droga 1-3. Inoltre, c&#39;è un interesse crescente in peptidi antimicrobici che operano attraverso meccanismi di membrana non-litica 4,5, in particolare quelli che attraversano le membrane batteriche senza causare la lisi cellulare e uccidere le cellule interferendo con i processi intracellulari 6,7. In realtà, gli autori hanno sempre sottolineato il rapporto tra peptidi cellula-penetrante e antimicrobico 1,8. Una solida conoscenza del processo di traslocazione della membrana e il rapporto tra struttura peptidica e la sua capacità di traslocare devono essere efficaci, i test riproducibili per traslocazione. Diversi gruppi hanno proposto metodi per misurare la traslocazione in unilamel grandeLAR vescicole lipidiche (luvs) 9-13. Luvs servire come modelli utili per le membrane delle cellule batteriche e eucariotiche e sono frequentemente utilizzati in studi peptide fluorescente 14,15. Qui, descriviamo la nostra applicazione del primo metodo sviluppato da Matsuzaki e collaboratori di prendere in considerazione peptidi antimicrobici, come magainin e buforin II 16,17. Oltre a fornire il nostro protocollo per questo metodo, abbiamo anche presentare un approccio diretto per l&#39;analisi dei dati che quantifica la capacità traslocazione da questo test. I vantaggi di questo test traslocazione rispetto ad altri che ha il potenziale per fornire informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e non richiede l&#39;aggiunta di un&#39;etichetta fluorescente, che possono alterare le proprietà del peptide 18, di triptofano contenenti peptidi. In breve, la capacità di traslocazione in vescicole lipidiche è misurata in funzione della Foster Resonance Energy Transfer (FRET) tra i residui di triptofano nativi e dansyl fosfatidiletanolamina quando le proteine ​​sono associate con l&#39;esterno LUV membrana (Figura 1). Cell-penetrante peptidi sono spaccati in quanto incontro tripsina disinibita incapsulato con il luvs, porta alla dissociazione dal LUV membrana e un calo del segnale FRET. Il calo FRET segnale osservato per un peptide translocating è significativamente maggiore di quello osservato per il peptide stesso quando il luvs contengono sia tripsina e inibitore della tripsina, o quando un peptide che non spontaneamente attraversare le membrane lipidiche è esposto a tripsina contenenti luvs. Questo cambiamento di fluorescenza fornisce una quantificazione diretta della traslocazione del peptide nel tempo.

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Measuring Peptide Translocation into Large Unilamellar Vesicles

Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.

Misurazione Traslocazione Peptide in grandi vescicole unilamellari

There is an active interest in peptides that readily cross cell membranes without the assistance of cell membrane receptors1.  Many of these are referred ...

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Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  Wellesley College. Questa dettagli del protocollo un metodo per la misura quantitativa della traslocazione peptidica in grandi vescicole lipidiche unilamellari. Questo metodo fornisce anche informazioni circa la velocità di traslocazione della membrana e può essere utilizzato per identificare i peptidi che in modo efficiente e spontaneamente croce doppi strati lipidici.

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Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation. Generating a streamlined procedure for creating and screening metagenomic libraries is therefore useful for efficient high-throughput investigations into the genetic and metabolic properties of uncultured microbial assemblages. Here, key protocols are presented on video, which we propose is the most useful format for accurately describing a long process that alternately depends on robotic instrumentation and (human) manual interventions. First, we employed robotics to spot library clones onto high-density macroarray membranes, each of which can contain duplicate colonies from twenty-four 384-well library plates. Automation is essential for this procedure not only for accuracy and speed, but also due to the miniaturization of scale required to fit the large number of library clones into highly dense spatial arrangements. Once generated, we next demonstrated how the macroarray membranes can be screened for genes of interest using modified versions of standard protocols for probe labeling, membrane hybridization, and signal detection. We complemented the visual demonstration of these procedures with detailed written descriptions of the steps involved and the materials required, all of which are available online alongside the video.

Su larga scala Schermi di librerie metagenomiche

Metagenomic libraries archive large fragments of contiguous genomic sequences from microorganisms without requiring prior cultivation.  Generating a ...

Ricerca

Biologia

Large Insert Environmental Genomic Library Production

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent environmental genomic (i.e. metagenomic) approaches have emerged, enabling researchers to bridge this cultivation gap by capturing the genetic content of indigenous microbial communities directly from the environment. To this end, genomic DNA libraries are constructed using standard albeit artful laboratory cloning techniques. Here we describe the construction of a large insert environmental genomic fosmid library with DNA derived from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord. This protocol is directly linked to a series of connected protocols including coastal marine water sampling [1], large volume filtration of microbial biomass [2] and a DNA extraction and purification protocol [3]. At the outset, high quality genomic DNA is end-repaired with the creation of 5 -phosphorylated blunt ends. End-repaired DNA is subjected to pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) for size selection and gel extraction is performed to recover DNA fragments between 30 and 60 thousand base pairs (Kb) in length. Size selected DNA is purified away from the PFGE gel matrix and ligated to the phosphatase-treated blunt-end fosmid CopyControl vector pCC1 (EPICENTRE <a href="http://www.epibio.com/item.asp?ID=385">http://www.epibio.com/item.asp?ID=385</a>). Linear concatemers of pCC1 and insert DNA are subsequently headfull packaged into phage particles by lambda terminase, with subsequent infection of phage-resistant E. coli cells. Successfully transduced clones are recovered on LB agar plates under antibiotic selection and archived in 384-well plate format using an automated colony picking robot (Qpix2, GENETIX). The current protocol draws from various sources including the CopyControl Fosmid Library Production Kit from EPICENTRE and the published works of multiple research groups [4-7]. Each step is presented with best practice in mind. Whenever possible we highlight subtleties in execution to improve overall quality and efficiency of library production. The whole process of fosmid library production and automated colony picking takes at least 7-10 days as there are many incubation steps included. However, there are several stopping points possible which are mentioned within the protocol.

Construction of a fosmid library with environmental genomic DNA isolated from the vertical depth continuum of a seasonally hypoxic fjord is described. The resulting clone library is picked into 384-well plates and archived for downstream sequencing and functional screening by the application of an automated colony picking system.

Inserire grande Ambientale Genomic Produzione Biblioteca

The vast majority of microbes in nature currently remain inaccessible to traditional cultivation methods. Over the past decade, culture-independent ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesi e Analisi funzionale dei canali ionici Heterologously Espresso in cellule di mammifero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

Misurazione quantitativa della traslocazione GLUT4 sulla membrana plasmatica mediante citometria di flusso

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic development 1, 2. One of the signaling pathways involved in this regulation is the Wnt pathway, which is used many times during embryogenesis and critical for human disease3, 4, 5. Multiple molecular components of this pathway coordinately regulate signaling in a spatially-restricted manner, but the underlying mechanisms are not fully understood. Xenopus embryonic epithelial cells is an excellent system to study subcellular localization of various signaling proteins. Fluorescent fusion proteins are expressed in Xenopus embryos by RNA microinjection, ectodermal explants are prepared and protein localization is evaluated by epifluorescence. In this experimental protocol we describe how subcellular localization of Diversin, a cytoplasmic protein that has been implicated in signaling and cell polarity determination6, 7 is visualized in Xenopus ectodermal cells to study Wnt signal transduction8. Coexpression of a Wnt ligand or a Frizzled receptor alters the distribution of Diversin fused with red fluorescent protein, RFP, and recruits it to the cell membrane in a polarized fashion 8, 9. This ex vivo protocol should be a useful addition to in vitro studies of cultured mammalian cells, in which spatial control of signaling differs from that of the intact tissue and is much more difficult to analyze.

Polarized Translocation of Fluorescent Proteins in Xenopus Ectoderm in Response to Wnt Signaling

Xenopus embryonic ectoderm has become an attractive model for studies of cell polarity. An assay is described, in which subcellular distribution of fluorescent proteins is assessed in ectoderm cells. This protocol will help address questions related to spatial control of signaling.

Traslocazione polarizzato di proteine ​​fluorescenti in Xenopus</emEctoderma> in risposta alla segnalazione Wnt

Cell polarity is a fundamental property of eukaryotic cells that is dynamically regulated by both intrinsic and extrinsic factors during embryonic ...

Examining BCL-2 Family Function with Large Unilamellar Vesicles

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate apoptosis1. Following cellular stress (e.g., DNA damage), the pro-apoptotic BCL-2 family effectors BAK (BCL-2 antagonistic killer 1) and/or BAX (BCL-2 associated X protein) become activated and compromise the integrity of the outer mitochondrial membrane (OMM), though the process referred to as mitochondrial outer membrane permeabilization (MOMP)1. After MOMP occurs, pro-apoptotic proteins (e.g., cytochrome c) gain access to the cytoplasm, promote caspase activation, and apoptosis rapidly ensues2.
In order for BAK/BAX to induce MOMP, they require transient interactions with members of another pro-apoptotic subset of the BCL-2 family, the BCL-2 homology domain 3 (BH3)-only proteins, such as BID (BH3-interacting domain agonist)3-6. Anti-apoptotic BCL-2 family proteins (e.g., BCL-2 related gene, long isoform, BCL-xL; myeloid cell leukemia 1, MCL-1) regulate cellular survival by tightly controlling the interactions between BAK/BAX and the BH3-only proteins capable of directly inducing BAK/BAX activation7,8. In addition, anti-apoptotic BCL-2 protein availability is also dictated by sensitizer/de-repressor BH3-only proteins, such as BAD (BCL-2 antagonist of cell death) or PUMA (p53 upregulated modulator of apoptosis), which bind and inhibit anti-apoptotic members7,9. As most of the anti-apoptotic BCL-2 repertoire is localized to the OMM, the cellular decision to maintain survival or induce MOMP is dictated by multiple BCL-2 family interactions at this membrane.
 Large unilamellar vesicles (LUVs) are a biochemical model to explore relationships between BCL-2 family interactions and membrane permeabilization10. LUVs are comprised of defined lipids that are assembled in ratios identified in lipid composition studies from solvent extracted Xenopus mitochondria (46.5% phosphatidylcholine, 28.5% phosphatidylethanoloamine, 9% phosphatidylinositol, 9% phosphatidylserine, and 7% cardiolipin)10. This is a convenient model system to directly explore BCL-2 family function because the protein and lipid components are completely defined and tractable, which is not always the case with primary mitochondria. While cardiolipin is not usually this high throughout the OMM, this model does faithfully mimic the OMM to promote BCL-2 family function. Furthermore, a more recent modification of the above protocol allows for kinetic analyses of protein interactions and real-time measurements of membrane permeabilization, which is based on LUVs containing a polyanionic dye (ANTS: 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid) and cationic quencher (DPX: p-xylene-bis-pyridinium bromide)11. As the LUVs permeabilize, ANTS and DPX diffuse apart, and a gain in fluorescence is detected. Here, commonly used recombinant BCL-2 family protein combinations and controls using the LUVs containing ANTS/DPX are described.

Biochemically-defined large unilamellar vesicles (LUVs) are a convenient model system to analyze BCL-2 family interactions with immediate implications in better understanding the mitochondrial pathway of apoptosis. A method to produce LUVs, along with standard BCL-2 family protein combinations and controls to examine LUV permeabilization, are presented.

Esaminando BCL-2 Funzione Famiglia con grandi vescicole unilamellari

The BCL-2 (B cell CLL/Lymphoma) family is comprised of approximately twenty proteins that collaborate to either maintain cell survival or initiate ...

Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow GUVs must be modified in order to form GUVs containing functional transmembrane proteins. This article describes two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation and gel-assisted swelling &#8212; to form GUVs containing the voltage-gated potassium channel, KvAP. In both methods, a solution of protein-containing small unilamellar vesicles is partially dehydrated to form a stack of membranes, which is then allowed to swell in a rehydration buffer. For the electroformation method, the film is deposited on platinum electrodes so that an AC field can be applied during film rehydration. In contrast, the gel-assisted swelling method uses an agarose gel substrate to enhance film rehydration. Both methods can produce GUVs in low (e.g., 5 mM) and physiological (e.g., 100 mM) salt concentrations. The resulting GUVs are characterized via fluorescence microscopy, and the function of reconstituted channels measured using the inside-out patch-clamp configuration. While swelling in the presence of an alternating electric field (electroformation) gives a high yield of defect-free GUVs, the gel-assisted swelling method produces a more homogeneous protein distribution and requires no special equipment.

The reconstitution of the transmembrane protein, KvAP, into giant unilamellar vesicles (GUVs) is demonstrated for two dehydration-rehydration methods &#8212; electroformation, and gel-assisted swelling. In both methods, small unilamellar vesicles containing the protein are fused together to form GUVs that can then be studied by fluorescence microscopy and patch-clamp electrophysiology.

Ricostituzione di una proteina transmembrana, la tensione gated canali ionici, KvAP, in Giant unilamellari vescicole per la microscopia e Patch Clamp Studies

Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) are a popular biomimetic system for studying membrane associated phenomena. However, commonly used protocols to grow ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many different proteins associate with curved membranes because of their ability to sense or induce membrane curvature. Typically, these processes involve a multitude of proteins making them too complex to study quantitatively in the cell. We describe a protocol to reconstitute a curved membrane in vitro, mimicking a curved cellular structure, such as the endocytic neck. A giant unilamellar vesicle (GUV) is used as a model of a cell membrane, whose internal pressure and surface tension are controlled with micropipette aspiration. Applying a point pulling force on the GUV using optical tweezers creates a nanotube of high curvature connected to a flat membrane. This method has traditionally been used to measure the fundamental mechanical properties of lipid membranes, such as bending rigidity. In recent years, it has been expanded to study how proteins interact with membrane curvature and the way they affect the shape and the mechanics of membranes. A system combining micromanipulation, microinjection, optical tweezers, and confocal microscopy allows measurement of membrane curvature, membrane tension, and the surface density of proteins, concurrently. From these measurements, many important mechanical and morphological properties of the protein-membrane system can be inferred. In addition, we lay out a protocol of creating GUVs in the presence of physiological salt concentration, and a method of quantifying the surface density of proteins on the membrane from fluorescence intensities of labeled proteins and lipids.

Many proteins in the cell sense and induce membrane curvature. We describe a method to pull membrane nanotubes from lipid vesicles to study the interaction of proteins or any curvature-active molecule with curved membranes in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

The reshaping of the cell membrane is an integral part of many cellular phenomena, such as endocytosis, trafficking, the formation of filopodia, etc. Many ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, which leads to subsequent degeneration of vital retinal structures (e.g., photoreceptors) causing severe vision impairment. Similarly, RPE-loss and decrease in visual acuity is seen in long-term follow up of patients with advanced wet age-related macular degeneration (AMD) receiving intravitreal anti-vascular endothelial growth factor (VEGF) treatment. Therefore, on the one hand, it is fundamental to efficiently derive RPE cells from an unlimited source that could serve as replacement therapy. On the other hand, it is important to assess the behavior and integration of the derived cells in a model of the disease entailing surgical and imaging methods as close as possible to those applied in humans. Here, we provide a detailed protocol based on our previous publications that describes the generation of a preclinical model of GA using the albino rabbit eye, for evaluation of the human embryonic stem cell derived retinal pigment epithelial cells (hESC-RPE) in a clinically relevant setting. Differentiated hESC-RPE are transplanted into naive eyes or eyes with NaIO3-induced GA-like retinal degeneration using a 25 G transvitreal pars plana technique. Evaluation of degenerated and transplanted areas is performed by multimodal high-resolution non-invasive real-time imaging.

Retinal pigment epithelial cells could serve as a cell-replacement therapy for the advanced form of dry age-related macular degeneration. This protocol describes the generation of a large-eyed model of geographic atrophy and the subretinal transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells into this model of disease.

Subretinal trapianto delle cellule epiteliali del pigmento retinico derivato di cellule staminali embrionali umane in un modello di atrofia geografica gran-eyed

Geographic atrophy (GA), the late stage of dry age-related macular degeneration is characterized by loss of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, ...