Questo protocollo in vitro, basato su 96 pozzetti può essere utilizzato per testare l'effetto inibitorio degli anticorpi su nuovi agenti antifungini sull'attività metabolica delle cellule fungine nei biofilm di Candida. Rispetto ad altri metodi, questa è una tecnica altamente sensibile, accurata, ad alto rendimento, riproducibile, facile da usare ed economica per valutare l'effetto di anticorpi o antimicotici sullo sviluppo di biofilm di Candida. Questo test può essere utilizzato per valutare l'efficacia di nuove terapie a base di farmaci o anticorpi, nonché di candidati vaccini contro i biofilm di Candida, che sono associati alla gravità della candidosi invasiva.
Questo metodo può essere applicato per testare l'effetto di nuovi agenti antifungini o anticorpi durante la formazione o la maturazione del biofilm in diversi contesti utilizzando diversi ceppi fungini o fonti di anticorpi. A dimostrare questa procedura sarà il signor Pankaj Chandley, uno studioso di dottorato che lavora nel mio laboratorio. Per iniziare, aggiungere 100 microlitri di coltura di Candida tropicalis a una piastra di microtitolazione a 96 pozzetti.
Utilizzando una pipetta multicanale, riempire le ultime due colonne con 100 microlitri di mezzo RPMI 1640 MOPS da solo. Coprire la piastra del titolo con un coperchio e un foglio di alluminio e incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius in condizioni stazionarie. Il giorno successivo, aspirare attentamente il mezzo utilizzando una pipetta multicanale.
Capovolgere delicatamente la piastra sui fogli assorbenti e picchiettare per rimuovere eventuali residui di terreno. Lavare la piastra con 200 microlitri di 1X PBS utilizzando una pipetta multicanale. Aspirare accuratamente il PBS utilizzando una pipetta multicanale e lavare due volte con PBS.
Per rimuovere il PBS in eccesso, asciugare all'aria la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente all'interno di un armadio di sicurezza biologica. Preparare diluizioni seriali di campioni di siero inattivati termicamente in terreno RPMI 1640 MOPS sterile. Aggiungere 100 microlitri della diluizione del siero selezionata a ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione a 96 pozzetti.
Nella colonna 10, aggiungere solo il terreno MOPS RPMI 1640 per il controllo positivo solo fungo. Aggiungere una diluizione da una a 50 di siero a tutti i pozzetti nella colonna 11 per fungere da controllo negativo senza fungo più siero. Dopo aver coperto la piastra con un coperchio e un foglio di alluminio, incubare la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius.
Il giorno successivo, dopo aver aspirato accuratamente il siero con una pipetta multicanale, picchiettare delicatamente la piastra rovesciata per rimuovere eventuali residui di siero. Ripetere il lavaggio PBS tre volte e asciugare all'aria la piastra per 30 minuti a temperatura ambiente all'interno di un armadio di sicurezza biologica per asciugare eventuali PBS in eccesso. Quindi, sciogliere 25 milligrammi di XTT in 50 millilitri di lattato di Ringer sterilizzato con filtro.
Aliquote 10 millilitri in tubi separati. Coprirlo con un foglio di alluminio e conservarlo a meno 80 gradi Celsius. Quindi, sciogliere 8,6 milligrammi di menadione in cinque millilitri di acetone.
E dopo aver distribuito 50 microlitri in 100 micro tubi separati, conservare le aliquote a meno 80 gradi Celsius. Prendere 10 millilitri di XTT e aggiungere un microlitro di menadione per ottenere una soluzione di lavoro monomolare. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di menadione XTT per pozzetto della piastra di microtitolazione a 96 pozzetti.
Successivamente, dopo aver coperto il piatto con un coperchio e un foglio di alluminio, incubare il piatto per due ore a 37 gradi Celsius al buio. Infine, trasferire 80 microlitri di surnatante colorato da ciascun pozzetto in una nuova piastra da 96 pozzetti e leggere la piastra a 490 nanometri. Il siero di topi immunizzati con parapsilosis Sap2 potrebbe impedire la maturazione dei biofilm preformati di Candida tropicalis del 65% rispetto al 45% nel siero di Sap2-albicans e al 55% nei topi immunizzati Sap2-tropicalis.
In generale, l'inibizione del biofilm da parte del siero immunitario Sap2 era significativamente superiore a quella del siero immunitario fittizio, che è del 16% e del 13% nel siero pre-immune. L'inibizione del biofilm è stata quasi trascurabile con l'uso di PBS e nessun controllo del siero. È necessario prestare la massima attenzione durante l'esecuzione delle fasi di lavaggio per prevenire l'interruzione dei biofilm.
La soluzione XTT deve essere preparata appena prima dell'uso e aggiunta immediatamente alla piastra. Seguendo questa procedura, gli utenti possono valutare l'effetto di nuovi agenti antifungini, candidati vaccini, o anticorpi durante la formazione e la maturazione del biofilm di Candida in diversi contesti di ricerca utilizzando diversi ceppi fungini.
