Questo protocollo prevede di testare l'efficacia antibatterica in tempo reale degli antibiotici eluiti da un dispositivo polimerico, che può aiutare a determinare con precisione formulazioni efficaci aumentando il loro valore traslazionale. Questo metodo consente di testare l'efficacia antibatterica in tempo reale per monitorare l'attività longitudinale dei materiali a rilascio di farmaco e per comprendere la gamma di attività antibatterica per una determinata formulazione implantare. Questo materiale polimerico è utilizzato in oltre il 90% delle protesi articolari totali come superficie portante.
E queste formulazioni a rilascio di antibiotico sono sviluppate come possibili trattamenti per le infezioni articolari periprotesiche. Questo metodo può essere utilizzato con qualsiasi dispositivo a rilascio di farmaco, come metalli porosi, polimeri degradabili e non degradabili, gel e possibilmente materiali particolati con modifiche al protocollo specifiche del materiale. Per iniziare, coltivare i batteri durante la notte in un millilitro di brodo di soia triptico.
Quindi diluire la sospensione batterica cresciuta durante la notte in brodo Mueller Hinton sterile, o MHB, e verificare la conta batterica vitale utilizzando le unità di luminescenza prima dell'inizio dell'esperimento come descritto nel manoscritto. Posizionare le strisce UHMWPE vergini e caricate con farmaco all'interno di una siringa da tre millilitri. Quindi aspirare la sospensione batterica contenente MHB nella siringa attraverso l'ago collegato fino al segno di 1,5 millilitri.
Posizionare la siringa su un'incubatrice agitatrice fino ai punti temporali indicati di sei ore, quindi ogni giorno fino al settimo giorno. Dopo ogni punto temporale indicato, estrarre la configurazione della siringa e erogare il supporto in un tubo da due millilitri. Eseguire un test di vitalità microbica in tempo reale come descritto nel manoscritto utilizzando 100 microlitri di sospensione batterica.
Dopo aver determinato il conteggio dei batteri vitali, calcolare le unità formanti colonie per millilitro dalle unità di luminescenza utilizzando la curva standard corrispondente. Per verificare l'assenza di batteri vitali nei campioni che hanno mostrato valori di luminescenza inferiori al limite di rilevazione, diffondere la coltura su piastre di agar di soia triptica. Incubare le piastre a 35 gradi Celsius durante la notte.
Quindi controlla la presenza di colonie il giorno successivo. Centrifugare la sospensione batterica rimanente. Aspirare delicatamente il supporto esaurito.
Lasciare 100 microlitri di surnatante nei tubi con pellet invisibili. Risospendere i batteri pellettati in MHB fresco. Vortice per 10 secondi per garantire una completa risospensione.
Quindi aspirare la sospensione batterica nella stessa configurazione della siringa attraverso l'ago collegato. Inizia recuperando le superfici UHMWPE vergini e caricate con farmaci dalla configurazione della siringa dopo il completamento dello studio il settimo giorno. Quindi trasferire le superfici in tubi da 1,5 millilitri e risciacquare con un millilitro di PBS sterile tre volte.
Sonicare la superficie per 40 minuti in un millilitro di PBS sterile. Determinare la vitalità dei batteri aderenti eseguendo un test luminesce su 100 microlitri del campione sonicato. Il rilascio del farmaco da vancomicina e UHMWPE caricato con gentamicina ha dimostrato un rilascio burst a sei ore seguito da un tasso di rilascio costante con una concentrazione superiore alla concentrazione inibitoria minima fino a sette giorni.
UHMWPE con vancomicina e gentamicina ha dimostrato una riduzione di oltre tre log per ATCC 12600 suscettibile a partire da sei ore e l'eradicazione completa è stata osservata al terzo giorno. Per il ceppo L1163 sensibile alla gentamicina e alla vancomicina, entrambi i materiali a rilascio di farmaco hanno causato una riduzione di oltre tre log a sei ore e non è stata osservata alcuna crescita della colonia il primo giorno. L'eluizione della gentamicina da UHMWPE non ha influenzato la vitalità batterica del ceppo L1101 resistente alla gentamicina e alla vancomicina.
Al contrario, l'eluizione della vancomicina da UHMWPE ha ridotto significativamente la vitalità batterica a sei ore. Le superfici di entrambi gli UHMWPE a rilascio di gentamicina e vancomicina non hanno mostrato batteri aderenti vitali quando esposti a ceppi di resistenza sensibili e intermedi dopo il settimo giorno. Tuttavia, alcuni batteri vitali erano presenti su UHMWPE a rilascio di gentamicina esposto a L1101 resistente alla gentamicina.
La superficie del polietilene vergine di controllo ha mostrato batteri aderenti vitali quando esposti a ciascun ceppo. La separazione dei mezzi esausti in ogni punto temporale che facilita il trascinamento della popolazione microbica è fondamentale per simulare l'esposizione prolungata agli antibiotici. Sebbene rappresenti un miglioramento rispetto ai metodi statici, questo metodo di simulazione semistatica può essere seguito da una configurazione continua per comprendere ulteriormente la cinetica dell'attività di nuove formulazioni di farmaci contro le infezioni.
Il protocollo ci ha permesso di catturare l'effetto dell'eluizione del farmaco sulle dinamiche batteriche dipendenti dal ceppo. Migliora gli strumenti per la valutazione dell'efficacia dei dispositivi di somministrazione di antibiotici sostenuti.
