We thank Benjamin Knowles, Yan Wei Lim, Andreas Haas, and members of the Viral Dark Matter consortium for their help and constructive input on this manuscript. This research is funded by the National Science Foundation (DEB-1046413) and is part of the Dimensions: Shedding Light on Viral Dark Matter project.

<ol>
	<li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (1), 69-114 (2000).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recoding+in+Bacteriophages.">Recoding in Bacteriophages.</a> Recoding: Expansion of decoding rules enriches gene expression. 24, 249-258 (2010).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+uncultured+marine+viral+communities.">Genomic analysis of uncultured marine viral communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (22), 14250-14255 (2002).</li><li>Breitbart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+and+population+structure+of+a+near-shore+marine-sediment+viral+community.">Diversity and population structure of a near-shore marine-sediment viral community.</a> Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. 271 (1539), 565-574 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+metagenomic+profiling+of+nine+biomes.">Functional metagenomic profiling of nine biomes.</a> Nature. 452 (7187), 629-632 (2008).</li><li>Vega Thurber, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+analysis+indicates+that+stressors+induce+production+of+herpes-like+viruses+in+the+coral+Porites+compressa.">Metagenomic analysis indicates that stressors induce production of herpes-like viruses in the coral Porites compressa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18413-18418 (2008).</li><li>Pedulla, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+highly+mosaic+mycobacteriophage+genomes.">Origins of highly mosaic mycobacteriophage genomes.</a> Cell. 113 (2), 171-182 (2003).</li><li>Calendar, R., Abedon, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The bacteriophages. , (2006).</li><li>Breitbart, M., Miyake, J. H., Rohwer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+distribution+of+nearly+identical+phage-encoded+DNA+sequences.">Global distribution of nearly identical phage-encoded DNA sequences.</a> FEMS microbiology letters. 236 (2), 249-256 (2004).</li><li>Klenk, H. -. P., Palm, P., Zillig, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-Dependent+RNA+Polymerases+as+Phylogenetic+Marker+Molecules.">DNA-Dependent RNA Polymerases as Phylogenetic Marker Molecules.</a> Systematic and Applied Microbiology. 16 (4), 638-647 (1993).</li><li>Breitbart, M., Thompson, L., Suttle, C., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+Vast+Diversity+of+Marine+Viruses.">Exploring the Vast Diversity of Marine Viruses.</a> Oceanography. 20 (2), 135-139 (2007).</li><li>Mann, N. H., Cook, A., Millard, A., Bailey, S., Clokie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+ecosystems:+bacterial+photosynthesis+genes+in+a+virus.">Marine ecosystems: bacterial photosynthesis genes in a virus.</a> Nature. 424 (6950), 741 (2003).</li><li>Mann, N. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+S-PM2,+a+&#8220;photosynthetic&#8221;+T4-type+bacteriophage+that+infects+marine+Synechococcus+strains.">The genome of S-PM2, a &#8220;photosynthetic&#8221; T4-type bacteriophage that infects marine Synechococcus strains.</a> Journal of bacteriology. 187 (9), 3188-3200 (2005).</li><li>Lindell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+photosynthesis+genes+to+and+from+Prochlorococcus+viruses.">Transfer of photosynthesis genes to and from Prochlorococcus viruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11013-11018 (2004).</li><li>Millard, A., Clokie, M. R. J., Shub, D. A., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+organization+of+the+psbAD+region+in+phages+infecting+marine+Synechococcus+strains.">Genetic organization of the psbAD region in phages infecting marine Synechococcus strains.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (30), 11007-11012 (2004).</li><li>Sullivan, M. B., Coleman, M. L., Weigele, P., Rohwer, F., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+Prochlorococcus+cyanophage+genomes:+signature+features+and+ecological+interpretations.">Three Prochlorococcus cyanophage genomes: signature features and ecological interpretations.</a> PLoS biology. 3 (5), e144 (2005).</li><li>Rohwer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genomic+sequence+of+the+marine+phage+Roseophage+SIOI+shares+homology+with+nonmarine+phages.">The complete genomic sequence of the marine phage Roseophage SIOI shares homology with nonmarine phages.</a> Limnology and Oceanography. 45 (2), 408-418 (2000).</li><li>Miller, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+genome+sequence+of+the+broad-host-range+vibriophage+KVP40:+comparative+genomics+of+a+T4-related+bacteriophage.">Complete genome sequence of the broad-host-range vibriophage KVP40: comparative genomics of a T4-related bacteriophage.</a> Journal of bacteriology. 185 (17), 5220-5233 (2003).</li><li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+auxiliary+metabolic+genes+and+the+redirection+of+cyanobacterial+host+carbon+metabolism.">Phage auxiliary metabolic genes and the redirection of cyanobacterial host carbon metabolism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (39), E757-E764 (2011).</li><li>Paterson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonistic+coevolution+accelerates+molecular+evolution.">Antagonistic coevolution accelerates molecular evolution.</a> Nature. 464 (7286), 275-278 (2010).</li><li>Seguritan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artificial+neural+networks+trained+to+detect+viral+and+phage+structural+proteins.">Artificial neural networks trained to detect viral and phage structural proteins.</a> PLoS computational biology. 8 (8), e1002657 (2012).</li><li>Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+Medium+for+Enterobacteria.">Culture Medium for Enterobacteria.</a> Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).</li><li>Khlebnikov, A., Datsenko, K. A., Skaug, T., Wanner, B. L., Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homogeneous+expression+of+the+P(BAD)+promoter+in+Escherichia+coli+by+constitutive+expression+of+the+low-affinity+high-capacity+AraE+transporter.">Homogeneous expression of the P(BAD) promoter in Escherichia coli by constitutive expression of the low-affinity high-capacity AraE transporter.</a> Microbiology (Reading, England). 147 (Pt 2), 3241-3247 (2001).</li><li>Cuevas, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+genomic+gaps+using+phenotypic+profiles.">Elucidating genomic gaps using phenotypic profiles.</a> F1000Research. , (2014).</li><li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van&#8217;t Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+of+the+bacterial+growth+curve.">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and environmental microbiology. 56 (6), 1875-1881 (1990).</li><li>Schmieder, R., Lim, Y. W., Rohwer, F., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TagCleaner:+Identification+and+removal+of+tag+sequences+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">TagCleaner: Identification and removal of tag sequences from genomic and metagenomic datasets.</a> BMC bioinformatics. 11, 341 (2010).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+and+preprocessing+of+metagenomic+datasets.">Quality control and preprocessing of metagenomic datasets.</a> Bioinformatics (Oxford, England). 27 (6), 863-864 (2011).</li><li>Schmieder, R., Edwards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+identification+and+removal+of+sequence+contamination+from+genomic+and+metagenomic+datasets.">Fast identification and removal of sequence contamination from genomic and metagenomic datasets.</a> PloS One. 6 (3), e17288 (2011).</li><li>Welch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+parameters+to+control+synthetic+gene+expression+in+Escherichia+coli.">Design parameters to control synthetic gene expression in Escherichia coli.</a> PloS One. 4 (9), e7002 (2009).</li><li>Fiehn, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+for+plant+metabolomics:+reporting+MSI-compliant+studies.">Quality control for plant metabolomics: reporting MSI-compliant studies.</a> The Plant journal: for cell and molecular biology. 53 (4), 691-704 (2008).</li><li>Zeng, Q., Chisholm, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+viruses+exploit+their+host&#8217;s+two-component+regulatory+system+in+response+to+resource+limitation.">Marine viruses exploit their host&#8217;s two-component regulatory system in response to resource limitation.</a> Current biology: CB. 22 (2), 124-128 (2012).</li><li>Shindy, W. W., Smith, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+plant+hormones+from+cotton+ovules.">Identification of plant hormones from cotton ovules.</a> Plant physiology. 55 (3), 550-554 (1975).</li><li>Lee, H. I., Leon, J., Raskin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosynthesis+and+metabolism+of+salicylic+acid.">Biosynthesis and metabolism of salicylic acid.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (10), 4076-4079 (1995).</li><li>Chappell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Isoprenoid+Metabolism.">The Biochemistry and Molecular Biology of Isoprenoid Metabolism.</a> Plant Physiology. 107 (1), 1-6 (1995).</li><li>Kitagawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+set+of+ORF+clones+of+Escherichia+coli+ASKA+library+(a+complete+set+of+E.+coli+K-12+ORF+archive):+unique+resources+for+biological+research.">Complete set of ORF clones of Escherichia coli ASKA library (a complete set of E. coli K-12 ORF archive): unique resources for biological research.</a> DNA research: an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes. 12 (5), 291-299 (2005).</li><li>Baran, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+footprinting+of+mutant+libraries+to+map+metabolite+utilization+to+genotype.">Metabolic footprinting of mutant libraries to map metabolite utilization to genotype.</a> ACS chemical biology. 8 (1), 189-199 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui vi presentiamo approcci Phenomic per la caratterizzazione funzionale dei geni dei fagi putativi. Le tecniche includono un saggio sviluppato capace di metabolismo anabolico monitoraggio host, le piastre Multi-fenotipo Assay (MAP), oltre al metodo stabilito di metabolomica, capace di effetti al metabolismo catabolico misurazione. Abbiamo fornito ulteriori strumenti per la gestione dei grandi insiemi di dati derivanti da queste tecnologie, consentendo l&#39;elaborazione ad alta produttività e analisi 24. Infine, attraverso il confronto di una proteina annotato fago capside, fagi tioredoxina, due geni del metabolismo dei fagi putativi, e la risposta media sperimentale ci proponiamo diverse strategie per interpretare entrambe le serie di dati e le classi di geni, con particolare attenzione alla identificazione delle tendenze fenotipici e l&#39;identificazione dei valori anomali. Come detto, entrambi gli approcci quantitativamente misurano solo la metà del metabolismo dell&#39;ospite. Per interpretare la relativa funzione di una qualsiasi dellenuove proteine ​​in esame, i dati di entrambi i metodi è tenuto a fornire la prova della funzione. Anche se questo non è un punto focale della nostra manoscritto corrente, uscite dati di ogni metodo Phenomic è messo attraverso analisi combinatorie che si concentrano su tecniche di clustering come la foresta casuale e analisi delle componenti principali. Inoltre, le ipotesi emerse dall&#39;analisi combinata devono essere convalidati da metodologie genetiche tradizionali. Infine, i metodi presentati sono fortemente influenzate dalla fisiologia batterica e quindi seguire le stesse norme. Nell&#39;avviare entrambi i metodi, le considerazioni devono essere fatte per garantire indipendenti, gruppi clonali sono sperimentato; è impedito contaminazione; una sola variabile è in fase di sperimentazione; e controlli adeguati sono corse contemporaneamente. La mancata per tenere conto di questi punti si tradurrà in risultati non chiari, simile a qualsiasi dosaggio fisiologico. Multi-fenotipo Piastre Assay(MAP) Lo sviluppo di MAP fornisce un elevato throughput e dosaggio adattabile rispetto alle tecnologie attualmente disponibili (Figura 5A e Tabelle 1,2). Il test utilizza forniture, attrezzature e le tecniche fondamentali disponibili in tutti i laboratori di microbiologia. L&#39;incorporazione di una pipeline di calcolo, PMAnalyzer 24, per la successiva elaborazione e analisi dei dati assicura una rapida interpretazione dei dati. Inoltre, entrambi gli aspetti sperimentali e analitiche del metodo possono essere facilmente regolati o sintonizzati per scopi personalizzati. Ad esempio, se una gran parte dei dati non riesce a passare filtraggio descritto nella sezione 4, si può vagliare manualmente attraverso le curve di crescita per identificare problemi. Se il problema è legato ai parametri di filtro stringenti, adeguamenti lo script può essere fatto. In alternativa, se i problemi sono associati con il processo sperimentale (cioè, condensazione prolungata; impropria trasferimento di cel battericals, ecc) quindi replicati supplementari possono essere facilmente ripetuti. Come descritto in Cuevas et al. 24, il PMAnalyzer è un unico programma bash scritto come uno script wrapper che esegue l&#39;analisi e analisi script come una coesa, conduttura automatizzata. Tutti gli script sono liberamente accessibili da un repository Git a 25, prendendo il valore mediano per ogni punto di tempo attraverso i dati triplice copia, e successivamente parametrizza la curva logistica per ottenere il tempo di ritardo, il tasso di crescita massima, asintoto, e un termine romanzo, Livello Crescita. Il valore mediano è stato scelto il media nel nostro studio per ridurre l&#39;effetto di grandi valori anomali, tuttavia, lo script può essere facilmente adattato per calcolare la media dei dati replicati. Grazie alla ridotta variazione (SE) visto attraverso dati replicati (Figura 2A) abbiamo mantenuto l&#39;uso della mediana nel PMAnalyzer per montare una curva logistica. Inoltre, il limite per la crescita in questo studio (GL ≥ 0,4) era determined confrontando come i dati separati attraverso livello di crescita e tasso di crescita massimo (Figura 1A, B). A seconda del modello di sistema strumenti e ha usato questo termine può variare, richiedendo ridefinizione di questo valore di soglia. Uno dei principali vantaggi della nostra analisi è la possibilità di confrontare fenotipi utilizzando un unico parametro che caratterizza la crescita microbica complessiva, che definiamo come livello di crescita (GL). GL è una media armonica, e mitiga quindi gli effetti di grandi valori anomali nei dati. L&#39;utilizzo di un media armonica con i valori logistici-misura spostati per fornire una sintesi di crescita è arrivato a attraverso tentativi ed errori. Altri metodi hanno cercato di differenziare la crescita incluso: tempo impiegato per raggiungere i parametri specifici della curva (la metà μ max, μ max, e la capacità di carico), il coefficiente di determinazione (R 2), e combinazioni di R 2 moltiplicato per specifici parametri della curva. Utilizzando un media armonica con spostatavalori logistico-fit per il GL fornito la più grande gamma nella valutazione della crescita, quindi è diventato il metodo di scelta. Una considerazione da notare è che i modelli curva di crescita dinamici hanno il potenziale di perdersi quando si utilizza un singolo parametro o di un modello adattato. Per esempio, i singoli parametri della curva della curva logistica e GL sono incapaci di rappresentare crescita bifasico. In un unico ambiente di carbonio, questo effetto sulla crescita implica mediazione della proteina virale su entrambi conversione del substrato o cambiamento di utilizzazione del substrato. Ulteriori effetti potenzialmente persi quando non considerando parametri di crescita più comprendono: ritardo prolungato, proponendo un aumento del carico di macchinari o prodotti virale; rapida accelerazione fase esponenziale, suggerendo proteine ​​virali accoppiati ad ospitare percorsi di produzione di energia; livelli o più alti di formazione della biomassa, che implica il supporto virale in assorbimento dei nutrienti ospite e anabolismo (dati non riportati). Così, tracciare curve di crescita nascenti ( <strong&gt; Figura 2A, B) fornisce informazioni per quanto riguarda le tendenze nel corso del tempo, mentre la GL tiene conto delle principali variabili del modello logistico, fornendo un unico numero quantitativa per rappresentare il successo globale di un clone. Se si considerano le diverse risposte fornite da geni strutturali e metabolici nelle mappe, si osserva che le diverse classi di substrato in questione forniscono la prova più funzione della proteina. Per esempio, le proteine ​​metaboliche sono spesso associati con l&#39;acquisizione di nutrienti limitanti, che sono non specifico per ospitare centrale metabolismo 16,32. MAP preliminari esperimenti rivelano che i cloni che ospitano putativi geni metabolici dei fagi hanno una maggiore fase di latenza quando coltivate su fonti di carbonio metabolismo centrali (Figura 2A). Al contrario, i cloni che portano geni strutturali putativi, che richiedono grandi proporzioni, di piscine energia ospite e dNTP, provocano una risposta falsi positivi sulla crescita per centosubstrati ral e aminoacidi carbonio metabolismo. Ciò è probabilmente dovuto all&#39;accumulo di proteine ​​insolubili conseguente filamentazione ospitante e / o corpi inclusi, come osservato mediante microscopia (Figura 2A e dati non mostrati). Mentre ulteriori analisi è necessaria per convalidare questi risultati preliminari, le mappe sono in grado di recuperare le risposte fenotipiche che correlano alle ipotizzato funzioni specifiche classi di geni fagi. Oltre alla spiegazione delle proteine ​​virali sconosciuti, le mappe sono un romanzo risorsa per indagare la diversità funzionale e metabolico di un individuo batterio o una comunità di batteri. I componenti del MAP sono progettati per una facile modifica per sostenere la crescita di una gamma di batteri; compresi marino, auxotrophic e microbi anaerobici. Per facilitare questi sforzi il basale e pre-sviluppo dei media definito richiedono ulteriori o regolate specie chimiche prima di un genere di batteri diverso può essere sostenuto nelle mappe.Una nota in questo uso delle mappe è quello di mantenere i media definiti, che vieta l&#39;uso di ingredienti come triptone, estratto di lievito e peptone. Metabolomica Il campo della metabolomica dipende database metaboliti, che comprendono metaboliti isolati identificati mediante spettrometria di massa. La struttura di base scelto qui ha uno dei più grandi database metabolomica. È interessante notare che più della metà dei metaboliti derivanti dalle nostre sperimentazioni erano identificabili (~ 65%), mentre gli altri non erano mai stati registrati nel nostro ospite, Escherichia coli (esempi includono: Indole 3 acido acetico 33, acido salicilico 34, e l&#39;acido dihydroabietic 35). Questo fatto potrebbe essere attribuita a una forte inclinazione del database verso metaboliti di piante, o le proteine ​​specifiche in esame. Indipendentemente, il risultato è un numero limitato di metaboliti noti disponibili per la rappresentazione e l&#39;analisi dei dati. Nella future, diversi metodi di metabolomica con varie banche dati consentirebbe una maggiore copertura metabolita. Attualmente, sia conosciuto e metaboliti sconosciuti vengono utilizzati quando comparare e confrontare le nostre proteine ​​virali romanzo. Usando questo approccio, ipotizziamo che i cloni che ospitano le proteine ​​funzionalmente simili condivideranno una maggiore somiglianza nel loro profilo metabolomica completo. Analisi metabolomica preliminari hanno rivelato che mentre geni strutturali e metaboliche non si separano chiaramente uno dall&#39;altro, quei geni esibendo effetti simili sul host quando overexpressed non correlare (Figura 6). Ad esempio, i Capside cluster di geni annotati da vicino con i geni metabolici putativi evidenziati in questo studio, EDT2440 e EDT2441. Le indagini che utilizzano una topologia transmembrana e peptide segnale programma predittore a disposizione del pubblico hanno mostrato evidenza che entrambi i geni metabolici putativi porto un singolo dominio transmembrana. Interessante 5 su the 9 cloni del primo gruppo di cluster (più a sinistra parte del dendrogramma) hanno previsto domini transmembrana che utilizzano lo stesso programma topologia. Sono necessari ulteriori studi, tuttavia, è probabile che i metaboliti presenti durante la sovraespressione di questi cloni sono associati a risposta allo stress cellulare risultante dalla membrana o fardelli strutturali. Queste prove sostengono che mentre i dati metabolomics possiede una maggiore quantità di rumore, il metodo è in grado di segnali che differenziano effetti generali di geni, sia all&#39;interno e attraverso una classe gene evidenziando. Per determinare se il metodo è in grado di estrarre le informazioni specifiche della funzione del gene, i metaboliti sono stati raggruppati in specifiche vie metaboliche. L&#39;essere ipotesi, se un clone colpisce metaboliti specifici di un unico percorso, allora il gene overexpressed è attivo in quel percorso. Prima della costituzione della nostra pipeline di garanzia della qualità metabolomica, dati preliminari hanno rivelato che più did metaboliti sottorappresentati erano tipicamente &quot;sconosciuto&quot;, che fornisce poche informazioni sui percorsi a cui sono associati (dati non riportati). Dati metabolomica pre-elaborati, tuttavia, rivela che la maggior parte dei profili dei metaboliti sono simili e solo un numero selezionato di sconosciute e conosciute abbondanze metaboliti variano tra i cloni, per esempio putrescina e uracile (Figura 6). Per offrire una maggiore risoluzione degli sforzi di funzione della proteina sono stati fatti per confrontare sperimentalmente i geni dei fagi nuovi contro geni fago noti, che possono essere utilizzati per riempire i &quot;buchi&quot; del metabolita basate caratterizzazione funzionale. Usando questa tecnica, la funzione assegnata di geni virali conosciuti fornisce un riferimento per la funzione dei geni ignoti. Tuttavia, il fattore limitante di analisi metabolomica è la dimensione e la rilevanza del database. Per correggere queste limitazioni, i database metabolomica facilmente riconoscibili per questa ricerca da sviluppare; comecome un database di metaboliti e loro abbondanze specifico alla raccolta ASKA di E. cloni coli in cui un singolo ORF è sovraespresso 36. Le prove per la necessità di tali banche dati è stato fornito nel 2013 quando i ricercatori del Berkeley National Laboratory Lawerence compilato il primo database completo di metaboliti specifici per intere biblioteche mutanti di batteri modello 37. Questa ricerca ha fornito romanzo spaccato geni necessari per l&#39;utilizzo di specifici metaboliti, rivelando la chiara connessione tra fenotipo e genotipo. Quando si considera metabolomica come strumento, è importante definire il regime di trasformazione seguita al core facility. Un artefatto della maggior parte delle procedure sperimentali è la varianza giorno per giorno associati con gli strumenti di utilizzo. Fino ad oggi tutte le analisi GC-MS implementa l&#39;uso di standard interni che sono inclusi in ogni seduta analitica; tuttavia, l&#39;aggiunta di progetti specifici campioni interni &lt;/ Em&gt; corse ogni giorno di sperimentazione rimuove varianza aggiuntivo. Queste considerazioni devono essere indirizzate presto per evitare problemi di normalizzazione e pregiudizi. Un&#39;altra soluzione è di elaborare tutti i campioni in una struttura nucleo sulla stessa macchina e come singolo lotto, un&#39;opzione disponibile presso qualsiasi struttura di base. I vari strumenti sia introdotto e ri-esplorati in questo manoscritto fornire nuovi mezzi per lo screening e caratterizzare geni fagi funzionalmente sconosciuti. La semplicità e adattabilità delle tecniche sperimentali con l&#39;uso Streamline di condotte computazionali assicura questi metodi sono applicabili ad una vasta gamma di sforzi e campi di ricerca. Il nostro obiettivo è che gli approcci Phenomic qui presentati saranno di aiuto ulteriori indagini di proteine ​​fagi romanzo, oltre a sistemi che sono ugualmente funzionalmente indefinito.

I virus che infettano i batteri (aka batteriofago o fago) sono stimate a esistere da più di 10 31 particelle simili al virus (VLP) a livello globale e più numerosi di tutti gli altri organismi in un ambiente 1,2. Il primo studio metagenomica indagando le comunità virali associati agli ambienti marini incentrata sulla quantificazione della diversità visto all&#39;interno della frazione virale 3. Inoltre, Breitbart e colleghi hanno scoperto che oltre il 65% delle sequenze virali di comunità condivisa omologia di eventuali sequenze disponibili nelle banche dati pubbliche. Studi successivi hanno trovato prove metagenomiche simile: metagenomi da sedimenti marini a San Diego, California contengono il 75% sconosciuti sequenze virali 4; metagenomi dai laghi ipersalini del Salton Sea contengono il 98% sconosciuti sequenze virali 5; e metagenomi corallo associata contengono 95-98% sequenze virali sconosciuti 6. Questo accumulo di informazioni non annotate ha portatomateriale genetico Fago essere &quot;la materia oscura dell&#39;universo biologico&quot; 7. Caratterizzazione genomica del fago si basa sull&#39;identificazione di similarità di sequenza attraverso il confronto contro banche dati esistenti degli acidi nucleici e proteine. Poiché le informazioni genetiche fago codifica è prevalentemente ignota, metodi basati omologia-sono inefficaci. All&#39;interno del loro genoma, fagi tipicamente codificano tre principali tipi di geni: trascrizione e replicazione dei geni, i geni del metabolismo, e geni strutturali. I geni di trascrizione e replicazione (classe I / II geni 8) includono polimerasi, primases, endo / eso-nucleasi e chinasi. Questi geni sono altamente conservati per la loro importanza in infezione fagi, trascrivendo e replicare materiale genetico fago. Polimerasi dei fagi sono facilmente identificabili con metodi sequenza omologia tradizionali a causa della loro conservazione globale 9 e hanno dimostrato di servire come efficace marcatori filogenetici 10.Al contrario, fago metabolico e geni strutturali (classe II / III geni 8) sono sempre più divergenti e spesso annotato come geni ipotetiche. Fagi geni metabolici influenzano la capacità metabolica del paese ospitante e non sono necessariamente necessari per la replicazione virale. Questi geni, spesso denominate geni metabolici come ausiliari 11 (AMG), sembrano modulare il metabolismo di accoglienza e consentire la progressione ottimale di infezione e il successo del virione di maturazione. AMG sono stati associati con l&#39;utilizzo e la diffusione delle sostanze nutritive che limitano o in percorsi di produzione di energia. Alcuni esempi includono geni fotosistema presenti nei genomi di varie cyanophage 12-16, geni connesse e regolati da metabolismo del fosfato 17,18, e l&#39;utilizzo della via dei pentoso fosfati per fago dNTP biosintesi 18,19. In confronto, i geni strutturali sono tra la metà e la fine degli anni geni prodotte durante l&#39;infezione e variano tra i diversi fago-hoSistemi di st. La produzione delle proteine ​​strutturali sono subordinati alla disponibilità di dNTP virale, e piscine energia per la loro trascrizione, traduzione e assemblaggio 8. Le proteine ​​del capside e fibra di coda strutturali sono considerati come il più divergente di tutti i geni codificanti proteine ​​virali e sono necessari per la produzione di virion successo. La loro divergenza è tipicamente attribuita al ruolo attivo che ricoprono nella definizione dei virus-ospite coevoluzione 20. Proteine ​​divergenti, indipendentemente dalla classe gene, vengono facilmente trascurati quando utilizzando tecniche di omologia e allineamento di sequenze tradizionali. Uno sforzo per correggere le limitazioni osservati con sequenza comparazioni severe ha comportato strumenti bioinformatici capaci di utilizzare caratteristiche di sequenza per determinare associazione, come le reti neurali artificiali 21. Reti neurali artificiali (ANN) consentono la previsione di geni strutturali e metabolici, tuttavia, richiedono validazione sperimentale a valle di caratterizzare direttamentela funzione del gene. L&#39;obiettivo di questo manoscritto è quello di fornire i protocolli Phenomic in grado di monitorare sia il metabolismo catabolico e anabolico di un batterio ospite durante l&#39;espressione di un nuovo gene fago, funzionalmente previsto attraverso RNA. Il campo di fenomica, biologia associata a fenotipi cellulari, è ben consolidata in biologia dei sistemi per aiutare nelle indagini di proteine ​​con funzione sconosciuta o pleiotropico. Strumenti Phenomic vengono utilizzati per collegare le informazioni fenotipiche all&#39;informazione genotipica. Ipotizziamo per i geni dei fagi putativi che la loro funzione (s) può essere determinato attraverso l&#39;osservazione di accoglienza effetti fisiologici durante l&#39;espressione del gene fago. Per studiare questa ipotesi, sono stati scelti due metodi quantitativi. Piastre Multi-fenotipo Assay (MAP) sono stati usati per monitorare l&#39;utilizzo del substrato di accoglienza e la conseguente formazione di biomassa, mentre la metabolomica misurate diversità metabolita ospite e relativa abbondanza durante la crescita in ambienti specificicondizioni mentali. Proteine ​​strutturali e metaboliche putativi sono stati overexpressed in Escherichia coli e risultati rappresentativi di entrambi gli esperimenti vengono confrontati. Numerose tecniche visive e condotte di elaborazione high throughput vengono presentati per facilitare la replicazione sperimentale. Infine, la riproducibilità e la precisione dei metodi presentati sono discussi nel contesto degli effetti fisiologici attesi per una proteina capside annotato e fago proteine ​​metabolica, tioredossina, più due AMGs putativi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Sterivex Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m Millex Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22&#181;m SteriCap Filter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS02RE</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Omnipore membrane filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>JHWP02500</td>
			<td>Millipore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well micro-titer plates&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-764</td>
			<td>Standard F-Bottom 96 well Microplates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL 96 well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Seal Plate Film</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z369667</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125 mL Nalgene square bottles</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-06040-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4inch Panel Mount Lock Nut, black nylon&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45509-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb&#160; 1/16inch&#160;</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Female Luer Thread Style Panel Mount to 200 Series Barb, 1/8inch</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45500-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer Integral Lock Ring to 500 Series Barb, 1/16inch ID tubing</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-45505-31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer with Lock Ring x Female Luer Coupler</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>T-45508-80</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barbed Bulkhead Fittings 1/4inch OD&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>6149-0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/16inch ID x 1/8inch OD&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sanipure Tubing 1/4inch OD x 1/8inch ID&#160;</td>
			<td>SaniPure</td>
			<td>AR400007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Flow Mini Pump (Peristaltic pump)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Stirrer</td>
			<td>Velp Scientifica</td>
			<td>F203A0160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-512-141</td>
			<td>&#160;Millipore* Filter Forceps&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-plate spectrophotometer plate reader</td>
			<td>Molecular Devices Analyst GT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter manifold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;XX10 025 02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python version 2.7.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.python.org/">http://www.python.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyLab module</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://wiki.scipy.org/PyLab">http://wiki.scipy.org/PyLab</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R version 3.0.1&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.r-project.org/">http://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reshape2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://had.co.nz/reshape">http://had.co.nz/reshape</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ggplot2 library</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://ggplot2.org/">http://ggplot2.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gene Composer</td>
			<td>PSI Tech Portal</td>
			<td></td>
			<td>http://www.genecomposer.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Services:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>West Coast Metabolomics Center</td>
			<td>UC Davis</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://metabolomics.ucdavis.edu/">http://metabolomics.ucdavis.edu</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA 2.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://www.dna20.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phage phenomics: physiological approaches to characterize novel viral proteins

Le ricerche in corso in interazioni fago-ospite dipendono estrapolazione conoscenze da (meta) genomi. È interessante notare che, il 60 - 95% di tutte le sequenze dei fagi condividere alcuna omologia con le proteine ​​annotati attuali. Di conseguenza, gran parte dei geni fago annotati come ipotetico. Questa realtà incide pesantemente l&#39;annotazione di entrambi i geni metabolici strutturali e ausiliari. Qui vi presentiamo metodi Phenomic progettati per catturare la risposta fisiologica (s) di un host selezionato durante espressione di uno di questi geni fago sconosciuti. Multi-fenotipo del saggio Piastre (MAP) vengono utilizzati per monitorare la diversità di utilizzazione del substrato di accoglienza e successiva formazione della biomassa, mentre la metabolomica fornisce un&#39;analisi bi-prodotto attraverso il monitoraggio del metabolita abbondanza e la diversità. Entrambi gli strumenti sono utilizzati simultaneamente per fornire un profilo fenotipica associata con l&#39;espressione di un singolo fago putative open reading frame (ORF). Risultati rappresentativi per entrambi i metodi sono confrontati, highlighting le differenze fenotipiche profilo di un host che trasportano sia putativi geni fago strutturali o metaboliche. Inoltre, le tecniche di visualizzazione e ad alto rendimento condutture computazionali che hanno facilitato l&#39;analisi sperimentale sono presentati.

Watch this Scientific Journal Video about Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins at JoVE.com

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

phage-phenomics-physiological-approaches-to-characterize-novel-viral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.0K Views.  San Diego State University. Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Video: Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Utilizzando un pan-virale Assay Microarray (Virochip) allo schermo campioni clinici di patogeni virali

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

L&#39;uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate directional responses to pathogen exposure in vivo. Thus, ideal in vitro models for examining cellular responses to respiratory pathogens polarize, forming apical and basolateral surfaces. One such model is differentiated normal human bronchial epithelial cells (NHBE). However, this system requires lung tissue samples, expertise isolating and culturing epithelial cells from tissue, and time to generate an air-liquid interface culture.
Calu-3 cells, derived from a human bronchial adenocarcinoma, are an alternative model for examining the response of proximal airway epithelial cells to respiratory insult1, pharmacological compounds2-6, and bacterial7-9 and viral pathogens, including influenza virus, rhinovirus and severe acute respiratory syndrome - associated coronavirus10-14. Recently, we demonstrated that Calu-3 cells are susceptible to respiratory syncytial virus (RSV) infection in a manner consistent with NHBE15,16 . Here, we detail the establishment of a polarized, liquid-covered culture (LCC) of Calu-3 cells, focusing on the technical details of growing and culturing Calu-3 cells, maintaining cells that have been cultured into LCC, and we present the method for performing respiratory virus infection of polarized Calu-3 cells.
To consistently obtain polarized Calu-3 LCC, Calu-3 cells must be carefully subcultured before culturing in Transwell inserts. Calu-3 monolayer cultures should remain below 90% confluence, should be subcultured fewer than 10 times from frozen stock, and should regularly be supplied with fresh medium. Once cultured in Transwells, Calu-3 LCC must be handled with care. Irregular media changes and mechanical or physical disruption of the cell layers or plates negatively impact polarization for several hours or days. Polarization is monitored by evaluating trans-epithelial electrical resistance (TEER) and is verified by evaluating the passive equilibration of sodium fluorescein between the apical and basolateral compartments17,18 . Once TEER plateaus at or above 1,000 &Omega;&times;cm2, Calu-3 LCC are ready to use to examine cellular responses to respiratory pathogens.

Establishing a Liquid-covered Culture of Polarized Human Airway Epithelial Calu-3 Cells to Study Host Cell Response to Respiratory Pathogens In vitro

The findings and conclusions in this report are those of the authors and do not necessarily represent the views of the Centers for Disease Control and Prevention.

Creazione di un liquido coperto Cultura polarizzata Airway epiteliali umane Calu-3 celle per studio cellulare risposta dell&#39;ospite agli agenti patogeni delle vie respiratorie<em&gt; In vitro</em

The  apical and basolateral surfaces of airway epithelial cells demonstrate  directional responses to pathogen exposure in  vivo. Thus, ideal in vitro ...

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its intractability to experimental transformation with recombinant DNA. We developed an approach to perform genetic analysis in C. trachomatis&#160;despite the lack of molecular genetic tools. Our method involves: i.) chemical mutagenesis to rapidly generate comprehensive libraries of genetically-defined mutants with distinct phenotypes; ii.) whole-genome sequencing (WGS) to map the underlying genetic lesions and to find associations between mutated gene(s) and a common phenotype; iii.) generation of recombinant strains through co-infection of mammalian cells with mutant and wild type bacteria. Accordingly, we were able to establish causal relationships between genotypes and phenotypes. The coupling of chemically-induced gene variation and WGS to establish correlative genotype&#8211;phenotype associations should be broadly applicable to the large list of medically and environmentally important microorganisms currently intractable to genetic analysis.

Forward Genetic Approaches in Chlamydia trachomatis

We describe a methodology to perform genetic analysis in Chlamydia based on chemical mutagenesis and whole genome sequencing. In addition, a system for DNA exchange within infected cells is described that can be used for genetic mapping. This method may be broadly applicable to microbial systems lacking transformation systems and molecular genetic tools.

Approcci genetici in avanti<em&gt; Chlamydia trachomatis</em

Chlamydia trachomatis, the etiological agent of sexually transmitted diseases and ocular infections, remains poorly characterized due to its ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

Viral Determinazione Concentrazione Attraverso placca saggi: Sistemi overlay per mezzo di tradizionali e nuovi

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. burnetii DNA in cell cultures and clinical samples. PCR requires specialized equipment and extensive end user training, and therefore, it is not suitable for routine work especially in a resource-constrained area. We have developed a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay to detect the presence of C. burnetii in patient samples. This method is performed at a single temperature around 60 &#176;C in a water bath or heating block. The sensitivity of this LAMP assay is very similar to PCR with a detection limit of about 25 copies per reaction. This report describes the preparation of the reaction using lyophilized reagents and visualization of results using hydroxynaphthol blue (HNB) or a UV lamp with fluorescent intercalating dye in the reaction. The LAMP reagents were lyophilized and stored at room temperature (RT) for one month without loss of detection sensitivity. This LAMP assay is particularly robust because the reaction mixture preparation does not involve complex steps. This method is ideal for use in resource-limited settings where Q fever is endemic.

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Lo sviluppo del liofilizzato Loop-mediate isotermici amplificazione reagenti per la rilevazione di<em&gt; Burnetii Coxiella</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional methods to measure NA inhibiting (NI) antibody titers are not practical for routine serology. This protocol describes the enzyme-linked lectin assay (ELLA), a practical alternative method to measure NI titers that is performed in 96 well plates coated with a large glycoprotein substrate, fetuin. NA cleaves terminal sialic acids from fetuin, exposing the penultimate sugar, galactose. Peanut agglutinin (PNA) is a lectin with specificity for galactose and therefore the extent of desialylation can be quantified using a PNA-horseradish peroxidase conjugate, followed by addition of a chromogenic peroxidase substrate. The optical density that is measured is proportional to NA activity. To measure NI antibody titers, serial dilutions of sera are incubated at 37 &#176;C O/N on fetuin-coated plates with a fixed amount of NA. The reciprocal of the highest serum dilution that results in &#8805;50% inhibition of NA activity is designated as the NI antibody titer. The ELLA provides a practical format for routine evaluation of human antibody responses following influenza infection or vaccination.

We describe the enzyme-linked lectin assay (ELLA) for measuring influenza neuraminidase (NA)-inhibition antibody titers in sera. The assay uses peanut agglutinin to quantify galactose residues that become accessible when NA removes sialic acid from fetuin-coated, 96-well plates.

Misurare Influenza neuraminidasi Inibizione anticorpo I titoli da Enzyme-linked lectina Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Screening Assays to Characterize Novel Endothelial Regulators Involved in the Inflammatory Response

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory response by the endothelial layer is crucial to efficiently fight against harmful inputs and aid in the recovery of damaged areas. When the endothelial cells are exposed to an inflammatory environment, such as the outer component of gram-negative bacteria membrane, lipopolysaccharide (LPS), they express soluble pro-inflammatory cytokines, such as Ccl5, Cxcl1 and Cxcl10, and trigger the activation of circulating leukocytes. In addition, the expression of adhesion molecules E-selectin, VCAM-1 and ICAM-1 on the endothelial surface enables the interaction and adhesion of the activated leukocytes to the endothelial layer, and eventually the extravasation towards the inflamed tissue. In this scenario, the endothelial function must be tightly regulated because excessive or defective activation in the leukocyte recruitment could lead to inflammatory-related disorders. Since many of these disorders do not have an effective treatment, novel strategies with a focus on the vascular layer must be investigated. We propose comprehensive assays that are useful to the search of novel endothelial regulators that modify leukocyte function. We analyze endothelial activation by using specific expression targets involved in leukocyte recruitment (such as, cytokines, chemokines, and adhesion molecules) with several techniques, including: real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR), western-blot, flow cytometry and adhesion assays. These approaches determine endothelial function in the inflammatory context and are very useful to perform screening assays to characterize novel endothelial inflammatory regulators that are potentially valuable for designing new therapeutic strategies.

Vascular endothelium tightly controls leukocyte recruitment. Inadequate leukocyte extravasation contributes to human inflammatory diseases. Therefore, searching for novel regulatory elements of endothelial activation is necessary to design improved therapies for inflammatory disorders. Here, we describe a comprehensive methodology to characterize novel endothelial regulators that can modify leukocyte trafficking during inflammation.

Saggi per caratterizzare nuovi endoteliale regolatori coinvolti nella risposta infiammatoria di screening

The endothelial layer is essential for maintaining homeostasis in the body by controlling many different functions. Regulation of the inflammatory ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.