The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

1. chimica Accoppiamento di proteine ​​per Beads Polymer <ol><li> Accoppiatore direzionale tiolo-ammina Nota: Questo protocollo è adatto per l&#39;accoppiamento di cisteina contenenti proteine ​​ammina-funzionalizzati perle di polimero, utilizzando Sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butirrato (solfo-SMPB) come agente reticolante (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Figura 1. reticolazione strategia utilizzata per l&#39;accoppiamento direzionale tiolo-ammina di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene Amine modificati vengono attivati ​​con Sulfo-SMPB. Il maleimmide reagisce con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Preparazione dei reagenti: <ol><li> Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li&gt; <li> Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS) di TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina) immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH 2 O) di solfo-SMPB immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Attivazione Bead: <ol><li> Mescolare sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0. </li><li> Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare. Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio. Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 200 ml di preparati al momento 10 mM Sulfo-SMPB, per dare un concent finalerazione di 2 mm. </li><li> Incubare la sospensione di sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole. </li></ol></li><li> Riduzione Proteine: <ol><li> Durante il periodo di incubazione della fase di attivazione, preparare la proteina per la successiva fase di accoppiamento in modo che possa essere immediatamente aggiunto ai talloni attivati. Nota: Sebbene questo passaggio riduzione non è sempre necessaria per GST (glutatione S-transferasi) proteine ​​di fusione, si raccomanda di garantire una elevata efficienza di accoppiamento. <ol><li> Controllare la concentrazione di proteine, e regolarlo alla concentrazione finale richiesta per la reazione di accoppiamento. Nota: proteine ​​6 mM in PBS, e un volume di 1 ml di solito vengono utilizzati. </li><li> Aggiungi TCEP magazzino per dare una concentrazione finale di 5 mm. Incubare la soluzione per 30 minuti a RT. Nota: La miscela di reazione può essere utilizzato direttamente per la reazione di accoppiamento. </li><li> Mantenere una piccola quantità (pochi ml) della soluzione di proteine ​​per la determinazione del pro<html> la concentrazione TEIN e calcolo di efficienza di accoppiamento (vedi capitolo 2). </li></ol></li></ol></li><li> Proteine ​​fase di accoppiamento: <ol><li> Pellet le perline attivate mediante centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga), e lavare il pellet volta in 1 ml di PBS sterile fresca. </li><li> Risospendere il pellet in soluzione proteica preparato (per esempio, 1 ml), per ottenere la concentrazione proteina desiderata. Nota: La concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento dipende dalla efficienza di accoppiamento medio (vedere sezione 2 per determinare l&#39;efficienza di accoppiamento) e la densità di accoppiamento desiderato (calcolato a 1.1.4.3). L&#39;efficienza è di circa 85% e la desiderata concentrazione finale 5 mM nella sospensione 10x tallone, in modo concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento deve essere di circa 6 mm. </li><li> Calcolare la densità di accoppiamento utilizzando la seguente formula: jpg &quot;/&gt; dove ρ c densità accoppiamento [numero di molecole proteiche / nm 2], proteina concentrazione proteica conc [mg / ml], proteina M w peso molecolare delle proteine ​​[Da], concentrazione tallone conc tallone [numero di perline / L], diametro d tallone [nm 2] Numero di Avogadro </li><li> Utilizzare la densità di accoppiamento per calcolare la distanza media legante: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Incubare la sospensione della proteina-tallone per 2 ore a 25 ° C su una ruota girevole. Nota: alcuniproteine ​​possono non essere stabile a temperatura ambiente. In questi casi, la reazione può essere condotta a 4 ° CO / N. </li><li> Disattivazione rimanenti gruppi attivati ​​ai talloni aggiungendo cisteina magazzino ad una concentrazione finale di 50 mM e incubare la sospensione per 30 min a 25 ° C su una ruota girevole. Pellet le perline per centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga). </li><li> Conservare il surnatante per determinare la concentrazione di proteine ​​e calcolare il rendimento di accoppiamento (vedi capitolo 2). </li><li> Lavare il pellet tallone due volte con 1 ml di PBS e risospendere in 1 ml di PBS fresco a dare il prodotto finale. Nota: Il protocollo sopra tipicamente darà 1 ml di proteine ​​accoppiato, ad una concentrazione finale di proteine ​​5 mM, che può essere utilizzato come uno stock 10x per esperimenti successivi (vedere paragrafo 3). </li><li> Per passare alla sezione 3 del protocollo, il lavoro con 100 ml / ml di tallone stock, o ad una concentrazione finale di proteine ​​500 nm. Nota: Un buon punto di partenza per questo immissioe sarà 2 × 10 12 perline / ml, determinando un accoppiamento densità media di 3 × 10 -4 proteine ​​/ Nm 2 o una distanza media di 57 nm su un cordone di diametro di 2 mm. </li></ol></li></ol></li><li> Accoppiatore direzionale tiolo-carbossi Nota: Questo protocollo è adatto per l&#39;accoppiamento cisteina contenente proteine ​​di sferette di polistirene carbossi-funzionalizzato. La porzione carbossile viene prima attivato utilizzando 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) / N-idrossisuccinimmide (NHS), Amine modificato e poi interconnessi Sulfo-SMPB (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Figura 2. reticolazione strategia utilizzata per l&#39;accoppiamento direzionale tiolo-carbossilico di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene carbossilati vengono prima attivati ​​con EDC e modificati con NHS per formare un semi-stabile NHS-estere. Successivamente ammina-accoppiamento ethylenedirisultati ammina in un gruppo amminico libero, che reagisce con Sulfo-SMPB. Maleimmide attivato perline possono poi reagire con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Preparazione dei reagenti: <ol><li> Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li><li> Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS,) di TCEP immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (20 mM, o 4 mg / ml in PBS) di EDC (1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide) immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (50 mM, o 6 mg / ml in PBS) di NHS (N-idrossisuccinimmide) immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH 2 O) di solfo-SMPB immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente buso rima. </li></ol></li><li> Attivazione Bead: <ol><li> Mescolare sospensione di sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0. </li><li> Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare. </li><li> Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 100 ml di 10x EDC magazzino (2 mm di concentrazione finale) e immediatamente 100 ml di soluzione madre 10x NHS (5 mm concentrazione finale) per la sospensione di sferette. </li><li> Incubare la sospensione di sferette per 30 minuti a 25 ° C su una ruota girevole. </li><li> Lavare perline una volta in 1 ml di PBS e risospendere in 0,8 ml fresca sterile PBS. </li><li> Aggiungere 200 ml di etilendiammina, e incUbate sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole. </li><li> Lavare perline una volta con 1 ml di PBS e risospendere le sfere in 0,8 ml di PBS fresco. </li><li> Passare dalla sezione 1.1.2.4 (attivazione tallone con Sulfo-SMPB), come descritto nella sezione 1.1.2 e seguire il resto del protocollo descritto nella sezione 1.1 (accoppiatore direzionale Thiol-ammina). Eseguire preparazione proteine ​​e gradini accoppiamento proteina in modo identico a quelli descritti nella sezione 1.1. Nota: L&#39;efficienza di accoppiamento tipico usando questo protocollo è leggermente inferiore rispetto al punto 1.1, quindi regolare la concentrazione iniziale di proteine ​​di conseguenza per ottenere la stessa densità di accoppiamento (circa 75%.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Determinazione del Coupling efficienza Nota: per determinare la concentrazione di proteine, utilizzare Bradford reagente 10 e test colorimetrici come segue: <ol><li> Capovolgere delicatamente Bradford reagente all&#39;e<html> Nsure omogeneità del reagente. </li><li> Utilizzando un / ml soluzione madre BSA 10 mg, preparare standard che coprono proteine ​​concentrazioni da 0,1 a 1,5 mg / ml BSA in tampone. </li><li> Aggiungere 250 ml di Bradford reagente pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Preparare abbastanza pozzi per tutti i campioni, gli standard di proteine ​​e controlli negativi (tampone solo). </li><li> Aggiungere 5 ml di campione di proteine ​​(standard di proteine ​​o di tampone, per il controllo negativo) al reagente nella piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare la piastra su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 595 nm usando un lettore di piastre. </li><li> Generare una curva standard di concentrazione BSA contro A595 nm e utilizzare questo per determinare le concentrazioni di proteine ​​nei campioni iniziali e surnatante. </li><li> Calcolare la concentrazione di proteine ​​accoppiati come segue: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Calcolare l&#39;efficienza di accoppiamento come: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. Uso di Bead-accoppiato adesine in Assays Concorso <ol><li> Preparazione: <ol><li> Seed 1 ml per pozzetto di cellule HeLa alla concentrazione di 150.000 cellule / ml in una piastra da 24 pozzetti il ​​giorno prima del dosaggio concorso, per permettere alle cellule di raggiungere circa il 80% di confluenza prima di iniziare l&#39;esperimento. </li><li> Impostare ogni condizione sperimentale in triplice copia. Includere pozzi per i controlli negativi (nessun batteri aggiunti durante i test della concorrenza), controlli positivi (sfere di controllo accoppiati alla fusione-tag aggiunti solo durante i test della concorrenza) ei controlli di lisi (per esperimenti di citotossicità). </li><li> Seminare un LB (MLB) cultura 5 ml marino con una nuova colonia di V. parahaemolyticus e crescere O / N a 30 ° C, agitando. </li><li> Preparare sufficiente MAM tallone accoppiati, come descritto nella sezione 1. (Coupling). Lasciare per 100 ml di 10x tallone stock per pozzetto. </li></ol></li><li> Analisi della concorrenza: <ol><li> Il giorno della competitiesperimento ione, misurare il diametro esterno 600 della coltura batterica. </li><li> Preparare supporti infezione diluendo colture batteriche in DMEM incolore senza additivi, pre-riscaldato a 37 ° C, contenente il 10% di sospensione v / v tallone (sia adesina-coupled perle o sfere di controllo), per dare una MOI di 10. Preparare 1 ml / bene e 10-20% di volume in eccesso per campione. Nota: Per le condizioni di cui sopra (24-pozzetti, V. parahaemolyticus, MOI 10), il volume necessario di O / N cultura da aggiungere ad ogni bene (ml / ml) viene calcolato come 3 / OD 600 della cultura. Ad esempio, 1 ml di mezzo infezione in genere contengono 100 ml di sospensione tallone, a pochi ml di coltura batterica e essere effettuate fino a 1 ml con incolori, DMEM senza supplementi. </li><li> Rimuovere vecchio medio dai pozzetti e lavare cellule HeLa in coltura con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS sterile pre-riscaldato a 37 ° C in ciascun pozzetto. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di terreno infezione per bene. Anche impostare i controlli, con l&#39;aggiunta di soluzioni di containing perline di controllo e batteri (controllo positivo) o perline adesina e nessun batteri (controlli negativi) o DMEM contenente 0,1% Triton X-100 (controllo, necessaria solo per misure di citotossicità lisi). </li><li> Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per il tempo desiderato (ad esempio 4 ore per misure di citotossicità o 1 ora per misurazioni di adesione). Nota: sia l&#39;adesione batterica e la citotossicità sulle cellule ospiti possono essere utilizzati come-out di lettura per l&#39;efficacia di inibizione. Se i punti di tempo di citotossicità e di adesione misure coincidono, entrambi i test possono essere eseguite su campioni dallo stesso pozzo, dal momento che la citotossicità è determinato utilizzando le cultura surnatante e attaccamento saggi utilizzano campioni derivati ​​dallo strato di cellule rimanenti. </li></ol></li><li> Misure di citotossicità: <ol><li> A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 4 ore dopo l&#39;infezione), rimuovere tre volte da 200 ml ogni 24 pozzetti e trasferimentouna piastra a 96 pozzetti. </li><li> Spin piastre a 96 pozzetti a 1.500 xg, 5 min e trasferire 100 ml di ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti fresco. Aggiungere 100 ml di supporti utilizzati durante esperimenti di infezione nei pozzetti freschi della piastra a 96 pozzetti in triplice copia (questi saranno utilizzati come spazi). </li><li> Eseguire il saggio deidrogenasi (LDH) rilascio di lattato utilizzando un kit di rilevamento LDH citotossicità e seguendo le istruzioni del produttore. <ol><li> Brevemente, calcolare la quantità di reagente necessario in incrementi di 25 (ad esempio, se 62 campioni da misurare, costituiscono miscela reagente sufficiente per 75 etc.). </li><li> Ad esempio, per 100 campioni, miscelare 11,25 ml di reagente A con 250 microlitri di reagente B. Invertito, non fare vortex per evitare la formazione di schiuma. </li><li> Mettere il composto in un serbatoio per poter pipettare con una pipetta multicanale. Aggiungere 100 pl di miscela reagente ogni campione. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente e leggere l&#39;assorbanza a 490 nm su un lettore di piastre a 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analizzare il set di dati per il quale l&#39;assorbanza del campione di controllo lisi è alto, ma ancora all&#39;interno della gamma lineare del lettore di piastre (tipicamente, 2-3 unità di assorbanza). </li><li> Esprimere i risultati come% citotossicità, con la seguente formula di conversione: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Misura di adesione batterica: <ol><li> A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 1 ora dopo l&#39;infezione), rimuovere i supporti dallo strato di cellule. </li><li> Lavare accuratamente lo strato di cellule con sterili, pre-riscaldato PBS (almeno 3-4 lavaggi di 1 ml di PBS ciascuno) per rimuovere tutte le cellule non-attaccato. </li><li> Cellule ospiti Lyse aggiungendo 1 ml di una sterile 1% v / v Triton X-100 in PBS soluzione per pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 5 min. </li><li> Pipettare ciascun campione su e giù parecchie volte prima di trasferire il contenuto di ogni pozzetto per separare provette da 1,5 ml. Preparare 10 diluizioni seriali dei campioniin PBS sterile (ad esempio, utilizzare 100 ml di campione e 900 ml di PBS). </li><li> Piatto 100 ml di ciascun campione sulla MLB agar e diffondere con spatola cellulare. Ottimizzare cui diluizioni per placcare seconda delle ceppi batterici e punti di tempo. Nota: Per la configurazione sperimentale descritto, 10 5 o 10 6 diluizioni danno un congruo numero di CFU. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° CO / N ed enumerare i batteri dal conteggio delle colonie. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui, descriviamo due protocolli, che possono essere utilizzati per le proteine ​​contenente il tiolo paio di quali ammine o polistirolo perline carbossilato modificato, rispettivamente. Grazie alla facilità di procedura, accoppiamento tiolo-ammina è preferibile, ma a seconda della specifica tallone desiderata (diametro, proprietà di fluorescenza), uso di perline ammina-funzionalizzato potrebbe non essere possibile e pertanto abbiamo incluso un protocollo che converte il carbossilato - in un residuo amminico a dare al ricercatore la massima flessibilità nella scelta del ponteggio. Sebbene sia tiolo-ammina e lavoro accoppiamento tiolo-carbossile per ogni cisteina contenente proteine, accoppiatore direzionale (cioè, l&#39;immobilizzazione della proteina per il suo N-terminale, mimando visualizzazione superficie) richiede una proteina senza residui di cisteina, che è prodotto come fusione GST proteine, o che contiene un singolo residuo di cisteina terminale introdotto dalla mutagenesi sito-specifica. Se più cisteine ​​reattive sono contenutiall&#39;interno della proteina, questo porterà a immobilizzazione casuale che può impedire la funzione delle proteine. Molti adesine batteriche non contengono cisteine ​​naturalmente. Per altri, questi possono essere rimossi mediante mutagenesi sito-specifica, anche se questo implicherà saggi per garantire struttura e funzione nativa vengono mantenute nel mutante. Per proteine ​​di fusione GST, purificato GST-tag accoppiato a microsfere può essere utilizzato come controllo negativo idoneo. Utilizzando perline disaccoppiati come controllo dovrebbe essere evitato, in quanto questi spesso hanno una maggiore tendenza a raggrupparsi o aderire alle cellule non-specifico. Una versione semplificata del protocollo 1.2., Utilizzando solo EDC, può essere utilizzato per accoppiare proteine ​​di perle di polimero funzionalizzato carbossilici, tuttavia in questo caso l&#39;accoppiamento avviene tramite ammine primarie nella proteina e quindi non garantisce accoppiatore direzionale. TCEP come agente riducente non deve essere sostituito con altri agenti riducenti disponibili in commercio e di uso comune, come dithiothreitol (DTT) o 2-mercaptoetanolo (BME), come i tioli in essi contenute saranno in concorrenza con accoppiamento proteina nella fase di accoppiamento tiolo-maleimmide. PBS può essere sostituito con altri buffer, ma con le seguenti considerazioni: buffer non può contenere ammine primarie (quindi buffer Tris-contenenti non sono adatti). L&#39;uso di tamponi contenenti (&lt;10 mm) concentrazioni molto basse di sale porta a tallone aggregazione e dovrebbe anche essere evitata. La proteina purezza è anche un fattore importante da prendere in considerazione durante questa procedura, e per ottenere dati di alta qualità, devono essere utilizzati proteine ​​pure. Noi abitualmente purificare le proteine ​​in più fasi, di cui almeno una fase di purificazione di affinità e gel filtrazione, ma in alcuni casi agli ioni di cromatografia a scambio è fatto come un terzo passo. Come risultato la purezza delle proteine ​​utilizzate per l&#39;accoppiamento di solito è del 90% o superiore, come giudicato da SDS-PAGE. Si raccomanda di determinare concentrazioni di proteine ​​sia nella miscela di reazione iniziale e di the surnatante dopo il completamento reazione. Ciò contribuirà a determinare la concentrazione di proteine ​​apparente tallone accoppiati, e quindi la densità di accoppiamento. Determinazione dei valori sia permetterà anche calcolo dell&#39;efficienza di accoppiamento. Questo può essere preso in considerazione quando si prepara la soluzione proteica iniziale successive reazioni, per raggiungere la concentrazione e l&#39;accoppiamento densità finale desiderato. Bradford reagente è particolarmente adatto per la determinazione della concentrazione proteica prima e dopo la reazione di accoppiamento, in quanto nessuna delle sostanze nella reazione interferisce con la formazione complesso colorante alle concentrazioni utilizzate. Se le concentrazioni proteiche inferiori sono da utilizzare, questo metodo può dover essere sostituito da un metodo di rilevazione più sensibile, tuttavia attenzione deve essere rivolta al fatto che deve essere compatibile con le sostanze contenute all&#39;interno della reazione di accoppiamento. Si raccomanda inoltre di utilizzare reagenti preparati al momento e maneggiare i reagenti in polvere con cura (ad esempio, negozioin un contenitore sigillato e utilizzare granuli di silice, per evitare i reagenti disegno umidità) Poiché la qualità di reagenti influenzano l&#39;efficienza di accoppiamento. Se l&#39;efficienza di accoppiamento è inferiore al previsto, i possibili rimedi includono l&#39;aumento della concentrazione di perle e di proteine ​​iniziali. Se si utilizzano concentrazioni più elevate, la concentrazione dei reagenti di accoppiamento deve essere aumentata proporzionalmente per garantire un sufficiente eccesso molare. Modifica concentrazioni tallone / proteina di solito è un passo più verso l&#39;ottimizzazione piuttosto che aumentando i tempi di reazione. Dal momento che i protocolli per l&#39;accoppiamento tallone sono lunghi, che comunemente prepariamo un grande lotto di materiale. Aliquote di sospensione possono essere snap-congelati in azoto liquido e conservati a -20 ° C per diversi mesi. Aliquote scongelati non devono essere ricongelati e devono essere mantenuti a 4 ° C ed utilizzati entro 1-2 giorni. Tuttavia, questo varierà con la natura e la stabilità della proteina utilizzata come dovrebbe essere testato su un piccolo lotto inizialmente. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; adesine branello-accoppiati può essere usato per molte applicazioni, come discusso di seguito. Questo protocollo descritto un metodo che viene comunemente utilizzato per misurare l&#39;inibizione della citotossicità batterica vincolante e patogeno-mediata su cellule ospiti. Il test viene comunemente eseguita per misurare la capacità di DAM tallone-accoppiato ad inibire competitivamente infezione di cellule epiteliali Hela con il mare-cibo patogeno carico Vibrio, utilizzando una diminuzione attaccamento batterico alle cellule ospiti o ridotta citotossicità come una lettura-out . In entrambi i casi, la preparazione e la concorrenza saggi seguono lo stesso protocollo. A seconda della lettura, diversi ceppi di V. parahaemolyticus vengono utilizzati: il ceppo citotossico POR1 viene utilizzato per le misure di citotossicità, mentre il ceppo non citotossica POR2 viene utilizzato per misurare l&#39;adesione dei batteri, dal momento che la morte cellulare e il distacco delle cellule compromette la procedura per quantificare i batteri attaccati. Inizialmente, compecorrenza esperimenti sono stati istituiti come protocollo graduale, in cui le cellule ospiti erano prima pre-incubate con perline prima dell&#39;aggiunta dei batteri. Per V. parahaemolyticus e le specifiche tallone utilizzati (2 micron perline accoppiate a MAM7), entrambi i talloni e batteri possono essere aggiunti allo stesso tempo, senza cambiamenti nella citotossicità risultante. Vale a dire, in questa configurazione sperimentale, perline outcompete batteri per il legame della cellula ospite. A seconda della specie batteriche e tallone geometria utilizzata, ci possono essere buoni motivi per mantenere l&#39;aderenza tallone e infezione batterica due passi separati. Ad esempio, per infettare cellule con batteri non mobili, piastre sono comunemente centrifugati dopo l&#39;aggiunta del supporto infezione. Tuttavia, la centrifugazione delle piastre contenenti sospensioni tallone dovrebbe essere evitato, poiché questo porta ad una distribuzione non omogenea perline sullo strato di cellule. Se si utilizzano dimensioni delle particelle più piccole, perline ci vorrà più tempo per risolvere sulla superficie cellulare, in questo caso sutempo sere sufficienti dovrebbe essere consentito per il fissaggio tallone prima l&#39;infezione. Quando adesione batterica viene utilizzato come lettura, i campioni dovrebbero essere prese in momenti in cui cellule ospiti non sono significativamente danneggiati dal ceppo infettante, come il distacco delle cellule e lisi possono compromettere la quantificazione dei batteri attaccati. Invece di enumerare adesione batterica da diluizione in piastra, i campioni possono in alternativa essere trattati per l&#39;imaging (Figura 5). In questo caso, le cellule di coltura di tessuto devono essere seminate su vetrini di vetro, piuttosto che direttamente nei pozzi. Inoltre, perline fluorescenti e batteri che esprimono una proteina fluorescente possono essere utilizzati, con marcatori cellula ospite-specifiche infezione. Ad esempio, esperimenti di competizione sono comunemente ripreso con rosso fluorescente rodamina-falloidina macchiare actina citoscheletro delle cellule ospitanti e valutare i cambiamenti morfologici derivanti da infezione, insieme con perline fluorescenti blu e fluorescenteverde (GFP che esprimono o SYTO18 macchiata) batteri. Una gamma di adesine perline accoppiati, tra cui lo Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD e Vibrio MAM, sono stati utilizzati come materiali biomimetici per studiare l&#39;adesione, l&#39;inibizione di adesione e il contributo di adesione al patogeno mediata citotossicità 1, 7, 8. Uno dei vantaggi di utilizzare questo approccio è la facilità di visualizzazione di eventi di fissaggio, poiché le perle di polimero utilizzati come supporti sono disponibili in una vasta gamma di colori (ad esempio, blu, rosso fluorescente, blu, verde, arancione). Così, etichettatura proteina diretta, che può interferire con la funzione, può essere evitato. Inoltre, superficie imita la visualizzazione di accoppiamento polivalente di adesine sulla superficie batterica, riflettendo così una conformazione più fisiologicamente rilevanti rispetto alle proteine ​​solubili. Rispetto a studi utilizzando batteri intatti o bacteriAl mutanti, l&#39;approccio tallone elude problemi associati con la crescita batterica. Ad esempio, a più lungo termine (ad esempio, O / N) studi di adesione batterica alle cellule ospiti che utilizzano batteri intatti sono spesso compromesse da fenomeni che accompagnano la crescita batterica - acidificazione del mezzo di crescita e nutrienti esaurimento influenzare negativamente cellule ospiti, e la replica batterica alla fine compromette qualità delle immagini. Più di recente, l&#39;uso di adesine perline accoppiamento è stato ampliato per includere il loro uso come strumenti per purificazioni affinità di accoglienza cellulare fattori coinvolti nei processi a valle di attaccamento batterico segnalazione. V. parahaemolyticus MAM7, tramite legame con acidi fosfatidici nella membrana della cellula ospite, provoca l&#39;attivazione RhoA e actina riarrangiamenti 1, 3. perline MAM accoppiati vengono utilizzati per purificare e identificare le proteine ​​coinvolte nelle piattaforme di segnalazione assemblati come conseguenza della cella MAM-host obbligatorio. Dal momento che può perlineessere facilmente separato dal surnatante mediante una breve fase di centrifugazione, e la proteina di interesse è covalentemente accoppiato, questo è un buon metodo per ottenere la separazione di proteine ​​contaminanti e arricchire pertinenti complessi proteici, che può essere utilizzato per applicazioni a valle, come proteomica o Western assorbente.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>646547</td>
			<td>Danger; corrosive 
			can be bought as solution or freshly prepared</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>PN22317</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30089</td>
			<td>Danger; toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&#160;&#956;m mean particle size</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0280</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>22980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>24500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLB9</td>
			<td>harmful; 
			a range of alternative particle sizes and colors is available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26266</td>
			<td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>W3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford reagent</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6916</td>
			<td>Danger; corrosive and toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose - With 4500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&#160;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D1145</td>
			<td>for infection experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6429</td>
			<td>for maintenance of cultured host cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin - 
			Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&#160;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9665</td>
			<td>supplement for tissue culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDH Cytotoxicity detection kit</td>
			<td>Takara</td>
			<td>MK401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reagent reservoirs (25ml)</td>
			<td>SLS</td>
			<td>F267660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>662160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>haemocytometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plate reader</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tissue culture facilities</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>multichannel pipette</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Il V. parahaemolyticus adesina MAM7 contiene sette tandem ingresso di cellule di mammifero (MCE) domini coinvolti nel riconoscimento dei recettori di superficie ospite. Abbiamo usato perle di polistirene accoppiati a ricombinante, frammenti purificati che comprende sia tutti i domini di sette tandem MCE (MAM7) o solo il dominio prima MCE (MAM1) per testare la capacità di questi materiali di competere con V. parahaemolyticus per cellula ospite vincolante e l&#39;efficacia risultante di questi materiali, come gli inibitori di adesione. Cellule HeLa sono state infettate con V. parahaemolyticus ceppo POR1 e citotossicità dovuta a infezione in vitro è stata valutata dopo 4 ore (Figura 3). Il trattamento delle cellule Hela con 0,1% Triton X-100 (controllo lisi positivo) provocato lisi cellulare completa, cellule non infette visualizzati molto bassi livelli di citotossicità. In vitro infezione di cellule non trattate con POR1 determinato livelli molto elevati di lisi cellulare, e questo è stata inibita da MAM7-coperline upled ma non MAM1 accoppiata o sfere di controllo GST-coupled (Figura 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Figura 3. Caratterizzazione del Vibrio parahaemolyticus indotta citotossicità in cellule epiteliali durante saggi di competizione. Le cellule sono state trattate con V. parahaemolyticus (Vp), indicati con (+), o nessun batteri (-) in presenza di diversi soggetti concorrenti (Comp.), come indicato. Tra queste, o nessuno comp. (-), Perline MAM7 (MAM7), MAM1 perline (MAM1) o sfere di controllo GST (GST). Come controllo, le cellule sono state trattate sia con Triton X-100 (triton, controllo lisi), o lasciato non infetto (uninf). Rilascio di LDH dopo 4 ore è stata misurata come descritto nel paragrafo 3, e risultati normalizzato ai controlli Triton (100%) e spazi vuoti (0%) come descritto sopra. I risultati sono mezzi ± sem da esperimenti in triplo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Conteggio di V. parahaemolyticus fissato sia cellule HeLa non trattate, o cellule incubate con MAM7-, MAM1-, o sfere di controllo GST, ha rivelato che MAM7-perle, ma non MAM1- o sfere di controllo GST- outcompete V. parahaemolyticus per il fissaggio a ospitare recettori della superficie cellulare (Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Figura 4. Caratterizzazione di attacco batterico durante esperimenti di competizione. Cellule HeLa sono state infettate con V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), in assenza (-) o la presenza di competere entità come segue: perline MAM7 (MAM7), perline MAM1 (MAM1) o perline di controllo GST (GST) (comp.). Adesione batterica è stata misurata dopo 1 ora, come<html> descritto nella sezione 3. I risultati sono mezzi ± sem da esperimenti in triplo. Mezzi (FLTR in UFC / ml) sono 2,3010 6, 5 1,5310, 2,0510 6, 2,1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Adesine accoppiati a fluoroforo etichettato perline risultato la generazione di materiali che imitano adesione batterica alle cellule ospiti e sono strumenti potenti per l&#39;imaging cellulare (Figura 5). Utilizzando fluorescenti perline blu MAM7 accoppiati, abbiamo caratterizzato il processo di attaccamento MAM7 mediata da cellule epiteliali. Fissaggio della MAM7 alle cellule ospiti provocato actina riarrangiamenti e la formazione di fibre di stress, che sono stati co-visualizzate con rodamina-falloidina colorare per F-actina (Figura 5B). _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Preparazione e utilizzo di fluoroforo etichettati perline biomimetici per scopi di imaging. (A) Sospensione di fluorescenti biomimetici perline blu (tubo a destra, 10x azione) e il tampone di controllo (tubo a sinistra). (B) Allegato di perline MAM7 accoppiati a Hela cellule risultati in riarrangiamenti di actina e la formazione di fibre di stress. Fibre di attacco di fluorescenti perline blu e conseguente allo stress actina (rosso, colorati con rodamina-falloidina) sono stati ripresi al microscopio. Bar, 10 micron. Immagini nel pannello B sono stati adattati da Lim et al. 1 e riprodotti sotto la licenza Creative Commons Attribution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.2K Views.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

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Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human papillomavirus (HPV), that cause localized infections. The steps involved are identifying region(s) of HPV proteins that contain T-cell epitope(s) from a subject, selecting for the peptide-specific T cells based on interferon-&gamma; (IFN-&gamma;) secretion, and growing and characterizing the T-cell clones (Fig. 1). Subject 1 was a patient who was recently diagnosed with a high-grade squamous intraepithelial lesion by biopsy and underwent loop electrical excision procedure for treatment on the day the T cells were collected1. A region within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 and E7 proteins which contained a T-cell epitope was identified using an IFN- g enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay performed with overlapping synthetic peptides (Fig. 2). The data from this assay were used not only to identify a region containing a T-cell epitope, but also to estimate the number of epitope specific T cells and to isolate them on the basis of IFN- &gamma; secretion using commercially available magnetic beads (CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). The selected IFN-&gamma; secreting T cells were diluted and grown singly in the presence of an irradiated feeder cell mixture in order to support the growth of a single T-cell per well. These T-cell clones were screened using an IFN- &gamma; ELISPOT assay in the presence of peptides covering the identified region and autologous Epstein-Barr virus transformed B-lymphoblastoid cells (LCLs, obtained how described by Walls and Crawford)2 in order to minimize the number of T-cell clone cells needed. Instead of using 1 x 105 cells per well typically used in ELISPOT assays1,3, 1,000 T-cell clone cells in the presence of 1 x 105 autologous LCLs were used, dramatically reducing the number of T-cell clone cells needed. The autologous LCLs served not only to present peptide antigens to the T-cell clone cells, but also to keep a high cell density in the wells allowing the epitope-specific T-cell clone cells to secrete IFN-&gamma;. This assures successful performance of IFN-&gamma; ELISPOT assay. Similarly, IFN- &gamma; ELISPOT assays were utilized to characterize the minimal and optimal amino acid sequence of the CD8 T-cell epitope (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) and its HLA class I restriction element (B58). The IFN- &gamma; ELISPOT assay was also performed using autologous LCLs infected with vaccinia virus expressing HPV 16 E6 or E7 protein. The result demonstrated that the E6 T-cell epitope was endogenously processed. The cross-recognition of homologous T-cell epitope of other high-risk HPV types was shown. This method can also be used to describe CD4 T-cell epitopes4.

Use of Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Characterizing T-cell epitopes of pathogens that cause localized infections such as human papillomavirus is a challenge because of limited number of T cells in circulation. A method is described in which rare T cells were isolated and were characterized starting with a very small number of cells.

L&#39;uso di interferone-γ Enzyme-linked Assay Immunospot per caratterizzare Nuovi epitopi T-cellulari di Papillomavirus Umano

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

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Immunologia e infezioni

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Misure singole cellule di Rottura Vacuolar causate da patogeni intracellulari

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

A Comparative Approach to Characterize the Landscape of Host-Pathogen Protein-Protein Interactions

Significant efforts were gathered to generate large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is instrumental to understand the pathogen-host relationships and was essentially performed by genetic screenings in yeast two-hybrid systems. The recent improvement of protein-protein interaction detection by a Gaussia luciferase-based fragment complementation assay now offers the opportunity to develop integrative comparative interactomic approaches necessary to rigorously compare interaction profiles of proteins from different pathogen strain variants against a common set of cellular factors.
This paper specifically focuses on the utility of combining two orthogonal methods to generate protein-protein interaction datasets: yeast two-hybrid (Y2H) and a new assay, high-throughput Gaussia princeps protein complementation assay (HT-GPCA) performed in mammalian cells.
A large-scale identification of cellular partners of a pathogen protein is performed by mating-based yeast two-hybrid screenings of cDNA libraries using multiple pathogen strain variants. A subset of interacting partners selected on a high-confidence statistical scoring is further validated in mammalian cells for pair-wise interactions with the whole set of pathogen variants proteins using HT-GPCA. This combination of two complementary methods improves the robustness of the interaction dataset, and allows the performance of a stringent comparative interaction analysis. Such comparative interactomics constitute a reliable and powerful strategy to decipher any pathogen-host interplays.

This article focuses on the identification of high-confident interaction datasets between host and pathogen proteins using a combination of two orthogonal methods: yeast two-hybrid followed by a high-throughput interaction assay in mammalian cells called HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Significant efforts were gathered to generate  large-scale comprehensive protein-protein interaction network maps. This is  instrumental to understand the ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Bacterial intracellular pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling cascades due to their capacity to exquisitely manipulate and subvert cell functions which are required for the infection of host target tissues. Among these bacterial pathogens, Listeria monocytogenes is a Gram positive microorganism that has been used as a paradigm for intracellular parasitism in the characterization of cellular immune responses, and which has played instrumental roles in the discovery of molecular pathways controlling cytoskeletal and membrane trafficking dynamics. In this article, we describe a robust microscopical assay for the detection of late cellular infection stages of L. monocytogenes based on the fluorescent labeling of InlC, a secreted bacterial protein which accumulates in the cytoplasm of infected cells; this assay can be coupled to automated high-throughput small interfering RNA screens in order to characterize cellular signaling pathways involved in the up- or down-regulation of infection.

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram positive bacterial pathogen frequently used as a major model for the study of intracellular parasitism. Imaging late L. monocytogenes infection stages within the context of small-interfering RNA screens allows for the global study of cellular pathways required for bacterial infection of target host cells.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

Uso di<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Per studiare le interazioni autofagia-Citoscheletro

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

Phage Phenomics: Physiological Approaches to Characterize Novel Viral Proteins

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage sequences share no homology to current annotated proteins. As a result, a large proportion of phage genes are annotated as hypothetical. This reality heavily affects the annotation of both structural and auxiliary metabolic genes. Here we present phenomic methods designed to capture the physiological response(s) of a selected host during expression of one of these unknown phage genes. Multi-phenotype Assay Plates (MAPs) are used to monitor the diversity of host substrate utilization and subsequent biomass formation, while metabolomics provides bi-product analysis by monitoring metabolite abundance and diversity. Both tools are used simultaneously to provide a phenotypic profile associated with expression of a single putative phage open reading frame (ORF). Representative results for both methods are compared, highlighting the phenotypic profile differences of a host carrying either putative structural or metabolic phage genes. In addition, the visualization techniques and high throughput computational pipelines that facilitated experimental analysis are presented.

Here, we present phenomic approaches for the functional characterization of putative phage genes. Techniques include a developed assay capable of monitoring host anabolic metabolism, the Multi-phenotype Assay Plates (MAPs), in addition to the established method of metabolomics, capable of measuring effects to catabolic metabolism.

Fenomica fagi: Approcci fisiologici per caratterizzare Novel virali Proteine

Current investigations into phage-host interactions are dependent on extrapolating knowledge from (meta)genomes. Interestingly, 60 - 95% of all phage ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Valutazione della efficacia e la tossicità degli RNA targeting HIV-1 Produzione per l&#39;uso in gene terapia farmacologica

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.

Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of ...

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into possible MOA, morphologic changes associated with antibiotic exposure can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Integrating SEM imaging with traditional kill curves may improve our insight into drug action and advance the drug development process. To test this premise, kill curves and SEM studies were conducted using drugs with known but different MOA (vancomycin and metronidazole). C. difficile cells (R20291) were grown with or without the presence of antibiotic for up to 48 h. Throughout the 48 h interval, cells were collected at multiple time points to determine antibiotic efficacy and for imaging on the SEM. Consistent with previous reports, vancomycin and metronidazole had significant bactericidal activity following 24 h of treatment as measured by colony-forming unit (CFU) counting. Using SEM imaging we determined that metronidazole had significant effects on cell length (&#62; 50% reduction in cell length for each antibiotic; P&#60; 0.05) compared to controls and vancomycin. While the phenotypic response to drug treatment has not been documented previously in this manner, they are consistent with the drug&#39;s MOA demonstrating the versatility and reliability of the imaging and measurements and the application of this technique for other experimental compounds.

A Protocol to Characterize the Morphological Changes of Clostridium difficile in Response to Antibiotic Treatment

Antibiotic efficacy is most commonly determined by conducting killing kinetic studies and measuring colony forming units (CFUs). By integrating scanning electron microscopy (SEM) with these standard methods, we can distinguish the pharmacological effects of treatment between different antibiotics.

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Assessment of antibiotic action with new drug development directed towards anaerobic bacteria is difficult and technically demanding. To gain insight into ...