Name: biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions
Uploaded: 2015-11-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
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The authors would like to thank members of the Krachler group for critical reading of the manuscript. DHS, DV and AMK were funded by the Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/L007916/1), FA was funded by a Republic of Iraq Ministry of Higher Education and Scientific Research Scholarship and NPS was funded by a CONICYT Scholarship.

1. chimica Accoppiamento di proteine ​​per Beads Polymer <ol><li> Accoppiatore direzionale tiolo-ammina Nota: Questo protocollo è adatto per l&#39;accoppiamento di cisteina contenenti proteine ​​ammina-funzionalizzati perle di polimero, utilizzando Sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butirrato (solfo-SMPB) come agente reticolante (Figura 1). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig1.jpg" /> Figura 1. reticolazione strategia utilizzata per l&#39;accoppiamento direzionale tiolo-ammina di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene Amine modificati vengono attivati ​​con Sulfo-SMPB. Il maleimmide reagisce con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Preparazione dei reagenti: <ol><li> Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li&gt; <li> Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS) di TCEP (tris (2-carbossietil) fosfina) immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH 2 O) di solfo-SMPB immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Attivazione Bead: <ol><li> Mescolare sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0. </li><li> Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare. Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio. Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 200 ml di preparati al momento 10 mM Sulfo-SMPB, per dare un concent finalerazione di 2 mm. </li><li> Incubare la sospensione di sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole. </li></ol></li><li> Riduzione Proteine: <ol><li> Durante il periodo di incubazione della fase di attivazione, preparare la proteina per la successiva fase di accoppiamento in modo che possa essere immediatamente aggiunto ai talloni attivati. Nota: Sebbene questo passaggio riduzione non è sempre necessaria per GST (glutatione S-transferasi) proteine ​​di fusione, si raccomanda di garantire una elevata efficienza di accoppiamento. <ol><li> Controllare la concentrazione di proteine, e regolarlo alla concentrazione finale richiesta per la reazione di accoppiamento. Nota: proteine ​​6 mM in PBS, e un volume di 1 ml di solito vengono utilizzati. </li><li> Aggiungi TCEP magazzino per dare una concentrazione finale di 5 mm. Incubare la soluzione per 30 minuti a RT. Nota: La miscela di reazione può essere utilizzato direttamente per la reazione di accoppiamento. </li><li> Mantenere una piccola quantità (pochi ml) della soluzione di proteine ​​per la determinazione del pro<html> la concentrazione TEIN e calcolo di efficienza di accoppiamento (vedi capitolo 2). </li></ol></li></ol></li><li> Proteine ​​fase di accoppiamento: <ol><li> Pellet le perline attivate mediante centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga), e lavare il pellet volta in 1 ml di PBS sterile fresca. </li><li> Risospendere il pellet in soluzione proteica preparato (per esempio, 1 ml), per ottenere la concentrazione proteina desiderata. Nota: La concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento dipende dalla efficienza di accoppiamento medio (vedere sezione 2 per determinare l&#39;efficienza di accoppiamento) e la densità di accoppiamento desiderato (calcolato a 1.1.4.3). L&#39;efficienza è di circa 85% e la desiderata concentrazione finale 5 mM nella sospensione 10x tallone, in modo concentrazione proteica durante la fase di accoppiamento deve essere di circa 6 mm. </li><li> Calcolare la densità di accoppiamento utilizzando la seguente formula: jpg &quot;/&gt; dove ρ c densità accoppiamento [numero di molecole proteiche / nm 2], proteina concentrazione proteica conc [mg / ml], proteina M w peso molecolare delle proteine ​​[Da], concentrazione tallone conc tallone [numero di perline / L], diametro d tallone [nm 2] Numero di Avogadro </li><li> Utilizzare la densità di accoppiamento per calcolare la distanza media legante: <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq2.jpg" /></li><li> Incubare la sospensione della proteina-tallone per 2 ore a 25 ° C su una ruota girevole. Nota: alcuniproteine ​​possono non essere stabile a temperatura ambiente. In questi casi, la reazione può essere condotta a 4 ° CO / N. </li><li> Disattivazione rimanenti gruppi attivati ​​ai talloni aggiungendo cisteina magazzino ad una concentrazione finale di 50 mM e incubare la sospensione per 30 min a 25 ° C su una ruota girevole. Pellet le perline per centrifugazione (2 min, 16.000 xg in una microcentrifuga). </li><li> Conservare il surnatante per determinare la concentrazione di proteine ​​e calcolare il rendimento di accoppiamento (vedi capitolo 2). </li><li> Lavare il pellet tallone due volte con 1 ml di PBS e risospendere in 1 ml di PBS fresco a dare il prodotto finale. Nota: Il protocollo sopra tipicamente darà 1 ml di proteine ​​accoppiato, ad una concentrazione finale di proteine ​​5 mM, che può essere utilizzato come uno stock 10x per esperimenti successivi (vedere paragrafo 3). </li><li> Per passare alla sezione 3 del protocollo, il lavoro con 100 ml / ml di tallone stock, o ad una concentrazione finale di proteine ​​500 nm. Nota: Un buon punto di partenza per questo immissioe sarà 2 × 10 12 perline / ml, determinando un accoppiamento densità media di 3 × 10 -4 proteine ​​/ Nm 2 o una distanza media di 57 nm su un cordone di diametro di 2 mm. </li></ol></li></ol></li><li> Accoppiatore direzionale tiolo-carbossi Nota: Questo protocollo è adatto per l&#39;accoppiamento cisteina contenente proteine ​​di sferette di polistirene carbossi-funzionalizzato. La porzione carbossile viene prima attivato utilizzando 1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC) / N-idrossisuccinimmide (NHS), Amine modificato e poi interconnessi Sulfo-SMPB (Figura 2). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig2.jpg" /> Figura 2. reticolazione strategia utilizzata per l&#39;accoppiamento direzionale tiolo-carbossilico di proteine ​​di perle di polimero. Perle di polistirene carbossilati vengono prima attivati ​​con EDC e modificati con NHS per formare un semi-stabile NHS-estere. Successivamente ammina-accoppiamento ethylenedirisultati ammina in un gruppo amminico libero, che reagisce con Sulfo-SMPB. Maleimmide attivato perline possono poi reagire con cisteine ​​libere per direzionalmente paio di proteine ​​per perline. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <ol><li> Preparazione dei reagenti: <ol><li> Preparare PBS (100 mM sodio fosfato, NaCl 150 mM, pH 7,0) e autoclave. </li><li> Preparare uno stock 100x (0,5 M o 287 mg / ml in PBS,) di TCEP immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (20 mM, o 4 mg / ml in PBS) di EDC (1-etil-3- (3-dimetilamminopropil) carbodiimmide) immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (50 mM, o 6 mg / ml in PBS) di NHS (N-idrossisuccinimmide) immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 5x (10 mM o 4.58 mg / ml in dH 2 O) di solfo-SMPB immediatamente prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare uno stock 10x (500 mm o 88 mg / ml in PBS, pH 7,0) di cisteina immediatamente buso rima. </li></ol></li><li> Attivazione Bead: <ol><li> Mescolare sospensione di sferette capovolgendo delicatamente e trasferire la quantità necessaria di sferette (ad esempio, 12 ml) in una provetta sterile da 1.5 ml contenente 1 ml di PBS sterile, pH 7,0. </li><li> Pipettare delicatamente su e giù per lavare le perline e pellet per centrifugazione in una microcentrifuga (2 min a 16.000 xg). </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare. </li><li> Risospendere il pellet tallone in 1 ml di PBS sterile fresca e ripetere la fase di lavaggio. </li><li> Risospendere il pellet tallone in 0,8 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 100 ml di 10x EDC magazzino (2 mm di concentrazione finale) e immediatamente 100 ml di soluzione madre 10x NHS (5 mm concentrazione finale) per la sospensione di sferette. </li><li> Incubare la sospensione di sferette per 30 minuti a 25 ° C su una ruota girevole. </li><li> Lavare perline una volta in 1 ml di PBS e risospendere in 0,8 ml fresca sterile PBS. </li><li> Aggiungere 200 ml di etilendiammina, e incUbate sferette per 1 ora a 25 ° C su una ruota girevole. </li><li> Lavare perline una volta con 1 ml di PBS e risospendere le sfere in 0,8 ml di PBS fresco. </li><li> Passare dalla sezione 1.1.2.4 (attivazione tallone con Sulfo-SMPB), come descritto nella sezione 1.1.2 e seguire il resto del protocollo descritto nella sezione 1.1 (accoppiatore direzionale Thiol-ammina). Eseguire preparazione proteine ​​e gradini accoppiamento proteina in modo identico a quelli descritti nella sezione 1.1. Nota: L&#39;efficienza di accoppiamento tipico usando questo protocollo è leggermente inferiore rispetto al punto 1.1, quindi regolare la concentrazione iniziale di proteine ​​di conseguenza per ottenere la stessa densità di accoppiamento (circa 75%.). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Determinazione del Coupling efficienza Nota: per determinare la concentrazione di proteine, utilizzare Bradford reagente 10 e test colorimetrici come segue: <ol><li> Capovolgere delicatamente Bradford reagente all&#39;e<html> Nsure omogeneità del reagente. </li><li> Utilizzando un / ml soluzione madre BSA 10 mg, preparare standard che coprono proteine ​​concentrazioni da 0,1 a 1,5 mg / ml BSA in tampone. </li><li> Aggiungere 250 ml di Bradford reagente pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Preparare abbastanza pozzi per tutti i campioni, gli standard di proteine ​​e controlli negativi (tampone solo). </li><li> Aggiungere 5 ml di campione di proteine ​​(standard di proteine ​​o di tampone, per il controllo negativo) al reagente nella piastra a 96 pozzetti. </li><li> Incubare la piastra su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 595 nm usando un lettore di piastre. </li><li> Generare una curva standard di concentrazione BSA contro A595 nm e utilizzare questo per determinare le concentrazioni di proteine ​​nei campioni iniziali e surnatante. </li><li> Calcolare la concentrazione di proteine ​​accoppiati come segue: <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq3.jpg" /></li><li> Calcolare l&#39;efficienza di accoppiamento come: 00eq4.jpg &quot;/&gt; </li></ol> 3. Uso di Bead-accoppiato adesine in Assays Concorso <ol><li> Preparazione: <ol><li> Seed 1 ml per pozzetto di cellule HeLa alla concentrazione di 150.000 cellule / ml in una piastra da 24 pozzetti il ​​giorno prima del dosaggio concorso, per permettere alle cellule di raggiungere circa il 80% di confluenza prima di iniziare l&#39;esperimento. </li><li> Impostare ogni condizione sperimentale in triplice copia. Includere pozzi per i controlli negativi (nessun batteri aggiunti durante i test della concorrenza), controlli positivi (sfere di controllo accoppiati alla fusione-tag aggiunti solo durante i test della concorrenza) ei controlli di lisi (per esperimenti di citotossicità). </li><li> Seminare un LB (MLB) cultura 5 ml marino con una nuova colonia di V. parahaemolyticus e crescere O / N a 30 ° C, agitando. </li><li> Preparare sufficiente MAM tallone accoppiati, come descritto nella sezione 1. (Coupling). Lasciare per 100 ml di 10x tallone stock per pozzetto. </li></ol></li><li> Analisi della concorrenza: <ol><li> Il giorno della competitiesperimento ione, misurare il diametro esterno 600 della coltura batterica. </li><li> Preparare supporti infezione diluendo colture batteriche in DMEM incolore senza additivi, pre-riscaldato a 37 ° C, contenente il 10% di sospensione v / v tallone (sia adesina-coupled perle o sfere di controllo), per dare una MOI di 10. Preparare 1 ml / bene e 10-20% di volume in eccesso per campione. Nota: Per le condizioni di cui sopra (24-pozzetti, V. parahaemolyticus, MOI 10), il volume necessario di O / N cultura da aggiungere ad ogni bene (ml / ml) viene calcolato come 3 / OD 600 della cultura. Ad esempio, 1 ml di mezzo infezione in genere contengono 100 ml di sospensione tallone, a pochi ml di coltura batterica e essere effettuate fino a 1 ml con incolori, DMEM senza supplementi. </li><li> Rimuovere vecchio medio dai pozzetti e lavare cellule HeLa in coltura con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS sterile pre-riscaldato a 37 ° C in ciascun pozzetto. </li><li> Rimuovere PBS e aggiungere 1 ml di terreno infezione per bene. Anche impostare i controlli, con l&#39;aggiunta di soluzioni di containing perline di controllo e batteri (controllo positivo) o perline adesina e nessun batteri (controlli negativi) o DMEM contenente 0,1% Triton X-100 (controllo, necessaria solo per misure di citotossicità lisi). </li><li> Incubare la piastra in un incubatore di coltura tissutale a 37 ° C per il tempo desiderato (ad esempio 4 ore per misure di citotossicità o 1 ora per misurazioni di adesione). Nota: sia l&#39;adesione batterica e la citotossicità sulle cellule ospiti possono essere utilizzati come-out di lettura per l&#39;efficacia di inibizione. Se i punti di tempo di citotossicità e di adesione misure coincidono, entrambi i test possono essere eseguite su campioni dallo stesso pozzo, dal momento che la citotossicità è determinato utilizzando le cultura surnatante e attaccamento saggi utilizzano campioni derivati ​​dallo strato di cellule rimanenti. </li></ol></li><li> Misure di citotossicità: <ol><li> A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 4 ore dopo l&#39;infezione), rimuovere tre volte da 200 ml ogni 24 pozzetti e trasferimentouna piastra a 96 pozzetti. </li><li> Spin piastre a 96 pozzetti a 1.500 xg, 5 min e trasferire 100 ml di ciascun pozzetto in una piastra da 96 pozzetti fresco. Aggiungere 100 ml di supporti utilizzati durante esperimenti di infezione nei pozzetti freschi della piastra a 96 pozzetti in triplice copia (questi saranno utilizzati come spazi). </li><li> Eseguire il saggio deidrogenasi (LDH) rilascio di lattato utilizzando un kit di rilevamento LDH citotossicità e seguendo le istruzioni del produttore. <ol><li> Brevemente, calcolare la quantità di reagente necessario in incrementi di 25 (ad esempio, se 62 campioni da misurare, costituiscono miscela reagente sufficiente per 75 etc.). </li><li> Ad esempio, per 100 campioni, miscelare 11,25 ml di reagente A con 250 microlitri di reagente B. Invertito, non fare vortex per evitare la formazione di schiuma. </li><li> Mettere il composto in un serbatoio per poter pipettare con una pipetta multicanale. Aggiungere 100 pl di miscela reagente ogni campione. </li><li> Incubare la piastra a temperatura ambiente e leggere l&#39;assorbanza a 490 nm su un lettore di piastre a 10, 20, 30 min. </li&gt; <li> Analizzare il set di dati per il quale l&#39;assorbanza del campione di controllo lisi è alto, ma ancora all&#39;interno della gamma lineare del lettore di piastre (tipicamente, 2-3 unità di assorbanza). </li><li> Esprimere i risultati come% citotossicità, con la seguente formula di conversione: <img alt="Equazione 5" src="/files/ftp_upload/53400/53400eq5.jpg" /></li></ol></li></ol></li><li> Misura di adesione batterica: <ol><li> A intervalli di tempo indicati (ad esempio, 1 ora dopo l&#39;infezione), rimuovere i supporti dallo strato di cellule. </li><li> Lavare accuratamente lo strato di cellule con sterili, pre-riscaldato PBS (almeno 3-4 lavaggi di 1 ml di PBS ciascuno) per rimuovere tutte le cellule non-attaccato. </li><li> Cellule ospiti Lyse aggiungendo 1 ml di una sterile 1% v / v Triton X-100 in PBS soluzione per pozzetto. Incubare la piastra a 37 ° C per 5 min. </li><li> Pipettare ciascun campione su e giù parecchie volte prima di trasferire il contenuto di ogni pozzetto per separare provette da 1,5 ml. Preparare 10 diluizioni seriali dei campioniin PBS sterile (ad esempio, utilizzare 100 ml di campione e 900 ml di PBS). </li><li> Piatto 100 ml di ciascun campione sulla MLB agar e diffondere con spatola cellulare. Ottimizzare cui diluizioni per placcare seconda delle ceppi batterici e punti di tempo. Nota: Per la configurazione sperimentale descritto, 10 5 o 10 6 diluizioni danno un congruo numero di CFU. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° CO / N ed enumerare i batteri dal conteggio delle colonie. </li></ol></li></ol>

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	<li>Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multivalent+Adhesion+Molecule+7+clusters+act+as+signaling+platform+for+host+cellular+GTPase+activation+and+facilitate+epithelial+barrier+dysfunction.">Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction.</a> PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outer+membrane+adhesion+factor+multivalent+adhesion+molecule+7+initiates+host+cell+binding+during+infection+by+gram-negative+pathogens.">Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).</li><li>Krachler, A. M., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+interaction+between+bacterial+adhesin+multivalent+adhesion+molecule+7+(MAM7)+protein+and+its+host+cell+ligands.">Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands.</a> J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).</li><li>Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+specificities+of+the+staphylococcal+and+streptococcal+fibronectin-binding+microbial+surface+components+recognizing+adhesive+matrix+molecules.">Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules.</a> Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).</li><li>Bingham, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structures+of+fibronectin-binding+sites+from+Staphylococcus+aureus+FnBPA+in+complex+with+fibronectin+domains.">Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).</li><li>Ensenberger, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+interactions+between+F1+adhesin+of+Streptococcus+pyogenes+and+N-terminal+modules+of+fibronectin.">Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin.</a> J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).</li><li>Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAM7+peptide-based+inhibitor+of+Staphylococcus+aureus+adhesion+does+not+interfere+with+in+vitro+host+cell+function.">A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function.</a> PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).</li><li>Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnabout+is+fair+play:+use+of+the+bacterial+Multivalent+Adhesion+Molecule+7+as+an+antimicrobial+agent.">Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent.</a> Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).</li><li>Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+multivalent+adhesion+molecule+7-based+inhibition+of+multidrug-resistant+bacteria+isolated+from+wounded+military+personnel.">In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel.</a> Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui, descriviamo due protocolli, che possono essere utilizzati per le proteine ​​contenente il tiolo paio di quali ammine o polistirolo perline carbossilato modificato, rispettivamente. Grazie alla facilità di procedura, accoppiamento tiolo-ammina è preferibile, ma a seconda della specifica tallone desiderata (diametro, proprietà di fluorescenza), uso di perline ammina-funzionalizzato potrebbe non essere possibile e pertanto abbiamo incluso un protocollo che converte il carbossilato - in un residuo amminico a dare al ricercatore la massima flessibilità nella scelta del ponteggio. Sebbene sia tiolo-ammina e lavoro accoppiamento tiolo-carbossile per ogni cisteina contenente proteine, accoppiatore direzionale (cioè, l&#39;immobilizzazione della proteina per il suo N-terminale, mimando visualizzazione superficie) richiede una proteina senza residui di cisteina, che è prodotto come fusione GST proteine, o che contiene un singolo residuo di cisteina terminale introdotto dalla mutagenesi sito-specifica. Se più cisteine ​​reattive sono contenutiall&#39;interno della proteina, questo porterà a immobilizzazione casuale che può impedire la funzione delle proteine. Molti adesine batteriche non contengono cisteine ​​naturalmente. Per altri, questi possono essere rimossi mediante mutagenesi sito-specifica, anche se questo implicherà saggi per garantire struttura e funzione nativa vengono mantenute nel mutante. Per proteine ​​di fusione GST, purificato GST-tag accoppiato a microsfere può essere utilizzato come controllo negativo idoneo. Utilizzando perline disaccoppiati come controllo dovrebbe essere evitato, in quanto questi spesso hanno una maggiore tendenza a raggrupparsi o aderire alle cellule non-specifico. Una versione semplificata del protocollo 1.2., Utilizzando solo EDC, può essere utilizzato per accoppiare proteine ​​di perle di polimero funzionalizzato carbossilici, tuttavia in questo caso l&#39;accoppiamento avviene tramite ammine primarie nella proteina e quindi non garantisce accoppiatore direzionale. TCEP come agente riducente non deve essere sostituito con altri agenti riducenti disponibili in commercio e di uso comune, come dithiothreitol (DTT) o 2-mercaptoetanolo (BME), come i tioli in essi contenute saranno in concorrenza con accoppiamento proteina nella fase di accoppiamento tiolo-maleimmide. PBS può essere sostituito con altri buffer, ma con le seguenti considerazioni: buffer non può contenere ammine primarie (quindi buffer Tris-contenenti non sono adatti). L&#39;uso di tamponi contenenti (&lt;10 mm) concentrazioni molto basse di sale porta a tallone aggregazione e dovrebbe anche essere evitata. La proteina purezza è anche un fattore importante da prendere in considerazione durante questa procedura, e per ottenere dati di alta qualità, devono essere utilizzati proteine ​​pure. Noi abitualmente purificare le proteine ​​in più fasi, di cui almeno una fase di purificazione di affinità e gel filtrazione, ma in alcuni casi agli ioni di cromatografia a scambio è fatto come un terzo passo. Come risultato la purezza delle proteine ​​utilizzate per l&#39;accoppiamento di solito è del 90% o superiore, come giudicato da SDS-PAGE. Si raccomanda di determinare concentrazioni di proteine ​​sia nella miscela di reazione iniziale e di the surnatante dopo il completamento reazione. Ciò contribuirà a determinare la concentrazione di proteine ​​apparente tallone accoppiati, e quindi la densità di accoppiamento. Determinazione dei valori sia permetterà anche calcolo dell&#39;efficienza di accoppiamento. Questo può essere preso in considerazione quando si prepara la soluzione proteica iniziale successive reazioni, per raggiungere la concentrazione e l&#39;accoppiamento densità finale desiderato. Bradford reagente è particolarmente adatto per la determinazione della concentrazione proteica prima e dopo la reazione di accoppiamento, in quanto nessuna delle sostanze nella reazione interferisce con la formazione complesso colorante alle concentrazioni utilizzate. Se le concentrazioni proteiche inferiori sono da utilizzare, questo metodo può dover essere sostituito da un metodo di rilevazione più sensibile, tuttavia attenzione deve essere rivolta al fatto che deve essere compatibile con le sostanze contenute all&#39;interno della reazione di accoppiamento. Si raccomanda inoltre di utilizzare reagenti preparati al momento e maneggiare i reagenti in polvere con cura (ad esempio, negozioin un contenitore sigillato e utilizzare granuli di silice, per evitare i reagenti disegno umidità) Poiché la qualità di reagenti influenzano l&#39;efficienza di accoppiamento. Se l&#39;efficienza di accoppiamento è inferiore al previsto, i possibili rimedi includono l&#39;aumento della concentrazione di perle e di proteine ​​iniziali. Se si utilizzano concentrazioni più elevate, la concentrazione dei reagenti di accoppiamento deve essere aumentata proporzionalmente per garantire un sufficiente eccesso molare. Modifica concentrazioni tallone / proteina di solito è un passo più verso l&#39;ottimizzazione piuttosto che aumentando i tempi di reazione. Dal momento che i protocolli per l&#39;accoppiamento tallone sono lunghi, che comunemente prepariamo un grande lotto di materiale. Aliquote di sospensione possono essere snap-congelati in azoto liquido e conservati a -20 ° C per diversi mesi. Aliquote scongelati non devono essere ricongelati e devono essere mantenuti a 4 ° C ed utilizzati entro 1-2 giorni. Tuttavia, questo varierà con la natura e la stabilità della proteina utilizzata come dovrebbe essere testato su un piccolo lotto inizialmente. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; adesine branello-accoppiati può essere usato per molte applicazioni, come discusso di seguito. Questo protocollo descritto un metodo che viene comunemente utilizzato per misurare l&#39;inibizione della citotossicità batterica vincolante e patogeno-mediata su cellule ospiti. Il test viene comunemente eseguita per misurare la capacità di DAM tallone-accoppiato ad inibire competitivamente infezione di cellule epiteliali Hela con il mare-cibo patogeno carico Vibrio, utilizzando una diminuzione attaccamento batterico alle cellule ospiti o ridotta citotossicità come una lettura-out . In entrambi i casi, la preparazione e la concorrenza saggi seguono lo stesso protocollo. A seconda della lettura, diversi ceppi di V. parahaemolyticus vengono utilizzati: il ceppo citotossico POR1 viene utilizzato per le misure di citotossicità, mentre il ceppo non citotossica POR2 viene utilizzato per misurare l&#39;adesione dei batteri, dal momento che la morte cellulare e il distacco delle cellule compromette la procedura per quantificare i batteri attaccati. Inizialmente, compecorrenza esperimenti sono stati istituiti come protocollo graduale, in cui le cellule ospiti erano prima pre-incubate con perline prima dell&#39;aggiunta dei batteri. Per V. parahaemolyticus e le specifiche tallone utilizzati (2 micron perline accoppiate a MAM7), entrambi i talloni e batteri possono essere aggiunti allo stesso tempo, senza cambiamenti nella citotossicità risultante. Vale a dire, in questa configurazione sperimentale, perline outcompete batteri per il legame della cellula ospite. A seconda della specie batteriche e tallone geometria utilizzata, ci possono essere buoni motivi per mantenere l&#39;aderenza tallone e infezione batterica due passi separati. Ad esempio, per infettare cellule con batteri non mobili, piastre sono comunemente centrifugati dopo l&#39;aggiunta del supporto infezione. Tuttavia, la centrifugazione delle piastre contenenti sospensioni tallone dovrebbe essere evitato, poiché questo porta ad una distribuzione non omogenea perline sullo strato di cellule. Se si utilizzano dimensioni delle particelle più piccole, perline ci vorrà più tempo per risolvere sulla superficie cellulare, in questo caso sutempo sere sufficienti dovrebbe essere consentito per il fissaggio tallone prima l&#39;infezione. Quando adesione batterica viene utilizzato come lettura, i campioni dovrebbero essere prese in momenti in cui cellule ospiti non sono significativamente danneggiati dal ceppo infettante, come il distacco delle cellule e lisi possono compromettere la quantificazione dei batteri attaccati. Invece di enumerare adesione batterica da diluizione in piastra, i campioni possono in alternativa essere trattati per l&#39;imaging (Figura 5). In questo caso, le cellule di coltura di tessuto devono essere seminate su vetrini di vetro, piuttosto che direttamente nei pozzi. Inoltre, perline fluorescenti e batteri che esprimono una proteina fluorescente possono essere utilizzati, con marcatori cellula ospite-specifiche infezione. Ad esempio, esperimenti di competizione sono comunemente ripreso con rosso fluorescente rodamina-falloidina macchiare actina citoscheletro delle cellule ospitanti e valutare i cambiamenti morfologici derivanti da infezione, insieme con perline fluorescenti blu e fluorescenteverde (GFP che esprimono o SYTO18 macchiata) batteri. Una gamma di adesine perline accoppiati, tra cui lo Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD e Vibrio MAM, sono stati utilizzati come materiali biomimetici per studiare l&#39;adesione, l&#39;inibizione di adesione e il contributo di adesione al patogeno mediata citotossicità 1, 7, 8. Uno dei vantaggi di utilizzare questo approccio è la facilità di visualizzazione di eventi di fissaggio, poiché le perle di polimero utilizzati come supporti sono disponibili in una vasta gamma di colori (ad esempio, blu, rosso fluorescente, blu, verde, arancione). Così, etichettatura proteina diretta, che può interferire con la funzione, può essere evitato. Inoltre, superficie imita la visualizzazione di accoppiamento polivalente di adesine sulla superficie batterica, riflettendo così una conformazione più fisiologicamente rilevanti rispetto alle proteine ​​solubili. Rispetto a studi utilizzando batteri intatti o bacteriAl mutanti, l&#39;approccio tallone elude problemi associati con la crescita batterica. Ad esempio, a più lungo termine (ad esempio, O / N) studi di adesione batterica alle cellule ospiti che utilizzano batteri intatti sono spesso compromesse da fenomeni che accompagnano la crescita batterica - acidificazione del mezzo di crescita e nutrienti esaurimento influenzare negativamente cellule ospiti, e la replica batterica alla fine compromette qualità delle immagini. Più di recente, l&#39;uso di adesine perline accoppiamento è stato ampliato per includere il loro uso come strumenti per purificazioni affinità di accoglienza cellulare fattori coinvolti nei processi a valle di attaccamento batterico segnalazione. V. parahaemolyticus MAM7, tramite legame con acidi fosfatidici nella membrana della cellula ospite, provoca l&#39;attivazione RhoA e actina riarrangiamenti 1, 3. perline MAM accoppiati vengono utilizzati per purificare e identificare le proteine ​​coinvolte nelle piattaforme di segnalazione assemblati come conseguenza della cella MAM-host obbligatorio. Dal momento che può perlineessere facilmente separato dal surnatante mediante una breve fase di centrifugazione, e la proteina di interesse è covalentemente accoppiato, questo è un buon metodo per ottenere la separazione di proteine ​​contaminanti e arricchire pertinenti complessi proteici, che può essere utilizzato per applicazioni a valle, come proteomica o Western assorbente.

Dissecting the interactions between bacterial adhesins and host surface receptors at the host-pathogen interface is an essential step towards our understanding of the underlying mechanisms driving bacterial adhesion. Ultimately, this will help us to identify strategies to interfere with these processes during infections. In conducting such studies, we often face a dilemma: Biochemical and biophysical analysis of the molecular mechanisms of adhesin binding requires their separation from other cell wall components, which may interfere with adhesion events. On the other hand, the use of recombinant soluble proteins over-simplifies the adhesion event, by disregarding protein anchoring in the bacterial cell wall and multivalency of binding achieved through bacterial surface display. Equally, from the host cell&#8217;s perspective, encountering and binding to single adhesin molecules does not always have the same impact in terms of plasma membrane organization, membrane fluidity and receptor clustering1 and this, ultimately, makes it difficult to evaluate the impact of adhesion on host cellular signaling and the outcome of bacteria-host interactions. 
Recently a method was devised, whereby recombinant purified adhesins or adhesin fragments are directionally and covalently coupled to polymer particles similar in size to bacteria, thus mimicking bacterial surface display. This approach has been used on a range of different adhesins, from Gram-negative Multivalent Adhesion Molecules (MAMs)2, 3, to Gram-positive adhesins including Staphylococcus aureus fibronectin binding protein (FnBPA)4, 5 and Streptococcus pyogenes F1 6, 7. This method has allowed the dissection of adhesin fragments important for host cell binding, identification of host surface receptors and determination of their behavior on the host cell surface, while taking both binding affinity and avidity into consideration 1, 8. Additionally, this approach has been used to investigate the efficacy of immobilized adhesins and derivatives as inhibitors of host-pathogen interactions 8, 9. It has been demonstrated that surface coupled derivatives of the Vibrio parahaemolyticus Multivalent Adhesion Molecule (MAM) 7 can be used to attenuate a range of bacterial infections in vitro, including those caused by multidrug-resistant pathogens such as Acinetobacter baumannii and methicillin-resistant S. aureus (MRSA) 7, 9. 
Herein, we describe different chemistries which can be used to immobilize adhesins to commercially available functionalized polystyrene particles. Due to the wide array of available surface functionalities, labels and particle sizes, these are a useful scaffold for the production of bacteriomimetic materials to investigate adhesin-host interactions. We further describe methods for the initial characterization of the coupling reaction, and for the calculation of important properties of the resulting materials. Finally, the use of bead-coupled adhesins as competitive inhibitors of in vitro bacterial infections is discussed as an example of their application, as well as the future scope and limitations of this approach.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td><td>Sigma</td><td>646547</td><td>Danger; corrosive&lt;br/&gt; can be bought as solution or freshly prepared</td></tr><tr><td>Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB)</td><td>Fisher</td><td>PN22317</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>30089</td><td>Danger; toxic</td></tr><tr><td>Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0&amp;nbsp;&amp;mu;m mean particle size</td><td>Sigma</td><td>L0280</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC)</td><td>Thermo scientific</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Carboxylate-modified polystyrene beads</td><td>Sigma</td><td>CLB9</td><td>harmful;&lt;br/&gt; a range of alternative particle sizes and colors is available</td></tr><tr><td>Ethylenediamine</td><td>Sigma</td><td>E26266</td><td>Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Promega</td><td>W3841</td><td></td></tr><tr><td>Bradford reagent</td><td>Sigma</td><td>B6916</td><td>Danger; corrosive and toxic</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without&amp;nbsp;L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>D1145</td><td>for infection experiments</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td>for maintenance of cultured host cells</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, heat inactivated</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin -&lt;br/&gt; Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10&amp;nbsp;mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>supplement for tissue culture medium</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>LDH Cytotoxicity detection kit</td><td>Takara</td><td>MK401</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>reagent reservoirs (25ml)</td><td>SLS</td><td>F267660</td><td></td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>Greiner</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>Greiner</td><td>655182</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>haemocytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plate reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tissue culture facilities</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>multichannel pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

biomimetic materials to characterize bacteria-host interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Il V. parahaemolyticus adesina MAM7 contiene sette tandem ingresso di cellule di mammifero (MCE) domini coinvolti nel riconoscimento dei recettori di superficie ospite. Abbiamo usato perle di polistirene accoppiati a ricombinante, frammenti purificati che comprende sia tutti i domini di sette tandem MCE (MAM7) o solo il dominio prima MCE (MAM1) per testare la capacità di questi materiali di competere con V. parahaemolyticus per cellula ospite vincolante e l&#39;efficacia risultante di questi materiali, come gli inibitori di adesione. Cellule HeLa sono state infettate con V. parahaemolyticus ceppo POR1 e citotossicità dovuta a infezione in vitro è stata valutata dopo 4 ore (Figura 3). Il trattamento delle cellule Hela con 0,1% Triton X-100 (controllo lisi positivo) provocato lisi cellulare completa, cellule non infette visualizzati molto bassi livelli di citotossicità. In vitro infezione di cellule non trattate con POR1 determinato livelli molto elevati di lisi cellulare, e questo è stata inibita da MAM7-coperline upled ma non MAM1 accoppiata o sfere di controllo GST-coupled (Figura 3). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig3.jpg" /> Figura 3. Caratterizzazione del Vibrio parahaemolyticus indotta citotossicità in cellule epiteliali durante saggi di competizione. Le cellule sono state trattate con V. parahaemolyticus (Vp), indicati con (+), o nessun batteri (-) in presenza di diversi soggetti concorrenti (Comp.), come indicato. Tra queste, o nessuno comp. (-), Perline MAM7 (MAM7), MAM1 perline (MAM1) o sfere di controllo GST (GST). Come controllo, le cellule sono state trattate sia con Triton X-100 (triton, controllo lisi), o lasciato non infetto (uninf). Rilascio di LDH dopo 4 ore è stata misurata come descritto nel paragrafo 3, e risultati normalizzato ai controlli Triton (100%) e spazi vuoti (0%) come descritto sopra. I risultati sono mezzi ± sem da esperimenti in triplo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Conteggio di V. parahaemolyticus fissato sia cellule HeLa non trattate, o cellule incubate con MAM7-, MAM1-, o sfere di controllo GST, ha rivelato che MAM7-perle, ma non MAM1- o sfere di controllo GST- outcompete V. parahaemolyticus per il fissaggio a ospitare recettori della superficie cellulare (Figura 4). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53400/53400fig4.jpg" /> Figura 4. Caratterizzazione di attacco batterico durante esperimenti di competizione. Cellule HeLa sono state infettate con V. parahaemolyticus POR2 (Vp +), in assenza (-) o la presenza di competere entità come segue: perline MAM7 (MAM7), perline MAM1 (MAM1) o perline di controllo GST (GST) (comp.). Adesione batterica è stata misurata dopo 1 ora, come<html> descritto nella sezione 3. I risultati sono mezzi ± sem da esperimenti in triplo. Mezzi (FLTR in UFC / ml) sono 2,3010 6, 5 1,5310, 2,0510 6, 2,1210 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Adesine accoppiati a fluoroforo etichettato perline risultato la generazione di materiali che imitano adesione batterica alle cellule ospiti e sono strumenti potenti per l&#39;imaging cellulare (Figura 5). Utilizzando fluorescenti perline blu MAM7 accoppiati, abbiamo caratterizzato il processo di attaccamento MAM7 mediata da cellule epiteliali. Fissaggio della MAM7 alle cellule ospiti provocato actina riarrangiamenti e la formazione di fibre di stress, che sono stati co-visualizzate con rodamina-falloidina colorare per F-actina (Figura 5B). _upload / 53400 / 53400fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5. Preparazione e utilizzo di fluoroforo etichettati perline biomimetici per scopi di imaging. (A) Sospensione di fluorescenti biomimetici perline blu (tubo a destra, 10x azione) e il tampone di controllo (tubo a sinistra). (B) Allegato di perline MAM7 accoppiati a Hela cellule risultati in riarrangiamenti di actina e la formazione di fibre di stress. Fibre di attacco di fluorescenti perline blu e conseguente allo stress actina (rosso, colorati con rodamina-falloidina) sono stati ripresi al microscopio. Bar, 10 micron. Immagini nel pannello B sono stati adattati da Lim et al. 1 e riprodotti sotto la licenza Creative Commons Attribution. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53400/53400fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.3K Views.  University of Birmingham. Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors. 

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Valutare la fattibilità di un consorzio batterico sintetico sull'interfaccia ospite-microbo In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Ricerca

Biochimica

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and frequently of indigenous origin. The ability of some anaerobic pathogens to invade human cells gives them adaptive measures to escape innate immunity as well as to modulate host cell behavior. However, ensuring that the anaerobic bacteria are live during experimental investigation of the events may pose challenges. Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative anaerobe, is capable of invading a variety of eukaryotic non-phagocytic cells. This article outlines how to successfully culture and assess the ability of P. gingivalis to invade human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). Two protocols were developed: one to measure bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize bacteria interacting with host cells. These techniques necessitate the use of an anaerobic chamber to supply P. gingivalis with an anaerobic environment for optimal growth.
The first protocol is based on the antibiotic protection assay, which is largely used to study the invasion of host cells by bacteria. However, the antibiotic protection assay is limited; only intracellular bacteria that are culturable following antibiotic treatment and host cell lysis are measured. To assess all bacteria interacting with host cells, both live and dead, we developed a protocol that uses fluorescent microscopy to examine host-pathogen interaction. Bacteria are fluorescently labeled with 2&#39;,7&#39;-Bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester (BCECF-AM) and used to infect eukaryotic cells under anaerobic conditions. Following fixing with paraformaldehyde and permeabilization with 0.2% Triton X-100, host cells are labeled with TRITC phalloidin and DAPI to label the cell cytoskeleton and nucleus, respectively. Multiple images taken at different focal points (Z-stack) are obtained for temporal-spatial visualization of bacteria. Methods used in this study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

Immunologia e infezioni

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical imaging. Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) imaging mass spectrometry represents a label-free, in situ imaging modality capable of generating spatial maps for a wide variety of metabolites. While thinly sectioned tissue samples are now routinely analyzed via this technology, imaging mass spectrometry analyses of non-traditional substrates, such as bacterial colonies commonly grown on agar in microbiology research, remain challenging due to the high water content and uneven topography of these samples. This paper demonstrates a sample preparation workflow to allow for imaging mass spectrometry analyses of these sample types. This process is exemplified using bacterial co-culture macrocolonies of two gastrointestinal pathogens: Clostridioides difficile and Enterococcus faecalis. Studying microbial interactions in this well-defined agar environment is also shown to complement tissue studies aimed at understanding microbial metabolic cooperation between these two pathogenic organisms in mouse models of infection. Imaging mass spectrometry analyses of the amino acid metabolites arginine and ornithine are presented as representative data. This method is broadly applicable to other analytes, microbial pathogens or diseases, and tissue types where a spatial measure of cellular or tissue biochemistry is desired.

Investigation of Microbial Cooperation via Imaging Mass Spectrometry Analysis of Bacterial Colonies Grown on Agar and in Tissue During Infection

A novel sample preparation method is demonstrated for the analysis of agar-based, bacterial macrocolonies via matrix-assisted laser desorption/ionization imaging mass spectrometry.

Studio della cooperazione microbica mediante spettrometria di massa per immagini Analisi di colonie batteriche cresciute su agar e nei tessuti durante l'infezione

Understanding the metabolic consequences of microbial interactions that occur during infection presents a unique challenge to the field of biomedical ...

High Throughput Co-culture Assays for the Investigation of Microbial Interactions

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many approaches used for the study of microbial interactions require specialized equipment and are expensive and time intensive. This paper presents a protocol for co-culture interaction assays that are inexpensive, scalable to large sample numbers, and easily adaptable to numerous experimental designs. Microorganisms are cultured together, with each well representing one pairwise combination of microorganisms. A test organism is cultured on one side of each well and first incubated in monoculture. Subsequently, target organisms are simultaneously inoculated onto the opposite side of each well using a 3D-printed inoculation stamp. After co-culture, the completed assays are scored for visual phenotypes, such as growth or inhibition. These assays can be used to confirm phenotypes or identify patterns among isolates of interest. Using this simple and effective method, users can analyze combinations of microorganisms rapidly and efficiently. This co-culture approach is applicable to antibiotic discovery as well as culture-based microbiome research and has already been successfully applied to both applications.

The co-culture interaction assays presented in this protocol are inexpensive, high throughput, and simple. These assays can be used to observe microbial interactions in co-culture, identify interaction patterns, and characterize the inhibitory potential of a microbial strain of interest against human and environmental pathogens.

Analisi di cocultura ad alta produttività per l'analisi delle interazioni microbiche

The study of interactions between microorganisms has led to numerous discoveries, from novel antimicrobials to insights in microbial ecology. Many ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

Visualizzazione cinetica delle interazioni batteriche interspecie a uni cell

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione della lectina e imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Automated, High-Throughput Detection of Bacterial Adherence to Host Cells

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in bacterial infections and constitutes a hallmark of potential threat. Therefore, examining the adherence of bacteria to host cells can be used as a component of bacterial threat assessment. A standard method for enumerating bacterial adherence to host cells is to co-incubate bacteria with host cells, harvest the adherent bacteria, plate the harvested cells on solid media, and then count the resultant colony forming units (CFU). Alternatively, bacterial adherence to host cells can be evaluated using immunofluorescence microscopy-based approaches. However, conventional strategies for implementing these approaches are time-consuming and inefficient. Here, a recently developed automated fluorescence microscopy-based imaging method is described. When combined with high-throughput image processing and statistical analysis, the method enables rapid quantification of bacteria that adhere to host cells. Two bacterial species, Gram-negative Pseudomonas aeruginosa and Gram-positive Listeria monocytogenes and corresponding negative controls, were tested to demonstrate the protocol. The results show that this approach rapidly and accurately enumerates adherent bacteria and significantly reduces experimental workloads and timelines.

Detection of host-bacterial pathogen interactions based on phenotypic adherence using high-throughput fluorescence labeling imaging along with automated statistical analysis methods enables rapid evaluation of potential bacterial interactions with host cells.

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Identification of emerging bacterial pathogens is critical for human health and security. Bacterial adherence to host cells is an essential step in ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Biologia

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

Sistemi modello di tessuto organotipico per lo studio delle interazioni ospite-patogeno in vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...