La distribuzione diffusa e il raggio visivo limitato del TEM presentano sfide per l'analisi infrastrutturale. Questo protocollo presenta un metodo di preparazione dei campioni innovativo ed efficiente che supera l'approccio convenzionale. Questo metodo avanzato di preparazione dei campioni TEM è più efficace nel prevenire l'arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale, consentendo ai campioni di rimanere piatti durante la successiva disidratazione.
La selezione dei reagenti e l'aggiustamento del dosaggio devono essere necessari a seconda del tipo di campione. Ci sono molti reagenti chimici tossici utilizzati nel processo di preparazione del campione. A dimostrare la procedura sarà Sheng Qingyuan, uno studente del laboratorio del Dr.Gan Guangming.
Per iniziare, sezionare le larve di Drosophila erranti del tardo terzo stadio in soluzione di Jan e ottenere l'intera parete del corpo secondo le procedure standard. Fissare la parete del corpo larvale con il fissativo nella camera di dissezione durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire la parete del corpo larvale dalla camera di dissezione a una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri e sciacquarla più volte con tampone di cacodilato di sodio.
Fissare la parete del corpo larvale in tetrossido di osmio all'1% per due ore. Dopo il fissaggio, lavare più volte i campioni con acqua distillata. Aggiungere una soluzione di acetato di orinatoio saturo al 2% nel tubo per colorare la giunzione neuromuscolare PHI.
E dopo due ore, sciacquare i campioni con acqua deionizzata. Quindi, usando le forbici, taglia due pezzi rotondi di rete metallica con una dimensione dei pori di 270 micron. Posiziona la rete metallica alla base di una bottiglia a fondo piatto.
Quindi posizionare le larve fisse sulla rete, quindi posizionare un'altra rete. Disidratare i campioni in una concentrazione crescente di etanolo per 20 minuti ciascuno a quattro gradi Celsius. Quindi sciacquare i campioni due volte con ossido di propilene a temperatura ambiente per cinque minuti ciascuno.
Quindi, posizionare i campioni in una soluzione di ossido di propilene e resina epossidica, seguita da resina epossidica pura per due ore a temperatura ambiente. Per l'incorporamento, tagliare una pellicola di polietilene in un grande quadrato e un piccolo supporto rettangolare cavo. Incolla il quadrato piccolo con il quadrato grande.
Aggiungere una quantità sufficiente di resina epossidica al centro del quadrato grande. Quindi accendere lo stereoscopio e posizionare i campioni nella resina epossidica preposizionata con il lato muscolare rivolto verso l'alto. Aggiungere diverse gocce di resina epossidica sui campioni e coprirli con un film di polietilene.
Posizionare i campioni per la polimerizzazione a temperature crescenti per 24 ore ciascuno. Dopo la polimerizzazione, utilizzando una lama affilata, rimuovere le parti in eccesso del corpo larvale mantenendo un trapezio, compresi i segmenti A2 e A3. Rimuovere il trapezio dalla parete del corpo larvale rimanente e fissarlo alla capsula riempita di resina con colla AB.
Al microscopio ottico, confermare la posizione del sesto e del settimo muscolo dei segmenti A2 e A3, mantenendo il piano tangente parallelo al sesto muscolo. Quindi tagliare un quinto del campione lungo i due lati del segmento A3. Utilizzando un microtomo, preparare una sezione ultra sottile del campione partendo dal sesto muscolo.
Dopo il sezionamento, attaccare il maggior numero possibile di fette a ciascuna rete di rame. Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione per osservare i campioni. Tra la resina Lowicryl K4M e la resina epossidica, la resina Lowicryl K4M ha fornito risultati più nitidi e più facilmente osservabili dei muscoli del corpo della Drosophila.
L'imaging confocale ha dimostrato una migliore visualizzazione della giunzione neuromuscolare tra il sesto e il settimo muscolo. La microscopia elettronica a trasmissione ha rivelato giunzioni neuromuscolari simili a perline, offrendo migliori informazioni sulla struttura sinaptica. I campioni sono rimasti piatti durante tutto il processo di disidratazione a causa della restrizione delle reti metalliche.
Inoltre, i campioni sono stati polimerizzati tra i prodotti in plastica, impedendo ai campioni di piegarsi. In futuro, il metodo di preparazione del campione TEM potrà essere applicato al neuropil del cervello e del cordone nervoso ventrale, migliorando così il potenziale della ricerca ultrastrutturale.
