1. Esempio di fissazione e di inclusione in resina <ol><li> I campioni di tessuto fresco e le cellule sono fissati per almeno 2 ore nel 2% paraformaldeide e glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato 0,1 M a pH di 7,4. La dimensione del campione non deve superare i 0,150 millimetri di spessore per consentire la penetrazione adeguata o fissativo, e non deve essere lasciato in correzione per più di 12 ore. </li><li> Mettere i campioni in fiale da 20 ml scintillazione vetro e sciacquarli per tre volte, 5 minuti ciascuno, in tampone 0,1 M cacodilato. </li><li> Macchia con 1,5% (w / v) di tetrossido di osmio ferrocianuro di potassio e 1% (w / v) in tampone 0,1 M cacodilato (0,1 M, pH 7,4) per 30 minuti. </li><li> Macchia con tetrossido di osmio 1,0% (w / v) in tampone 0,1 M cacodilato per 30 minuti. </li><li> Sciacquare subito con acqua bidistillata per 3 minuti. </li><li> Macchia con 1% (w / v) di acetato di uranile in camera doppia acqua distillata per 30 minuti. </li><li> Sciacquare sezioni per 5 minuti in acqua bidistillata, disidratano e poi in serie alcool classificato, 2 minuti a ogni cambio (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). </li><li> Incorpora in concentrazioni crescenti di resina Durcupan mescolata con l&#39;etanolo, 30 minuti ogni cambiamento, partendo da 50% Durcupan in etanolo, seguito da: 70%, 90%, 95%, e poi 100%. </li><li> Sostituire con Durcupan fresco e agitare lentamente per 4 ore. </li><li> Sezioni luogo, utilizzando stuzzicadenti di legno, su vetro microscopi vetrini rivestiti con l&#39;agente di separazione dello stampo, e mettere in forno a 65 ° C per 24 ore. </li></ol> 2. Preparazione del campione per il FIB / SEM <ol start="11"><li> Separare lo strato di resina, contenenti i campioni, da tra i due vetrini e microscopio lavare accuratamente per rimuovere qualsiasi forma di separazione agente. </li><li> Utilizzando un microscopio a luce trasmessa con gli obiettivi di bassa potenza, o dissezione microscopio con illuminazione trasmessa, per identificare la regione di interesse all&#39;interno della fetta di resina. </li><li> Tagliare un piccolo (3 mm x 3 mm) quadrati attorno alla regione di interesse con una lama di rasoio e questo bastone alla cima del blocco di resina bianca con colla acrilica (Figura 1). Attendere 5 minuti per la colla per indurire, e poi procedere con il passo successivo. </li><li> Bloccare il blocco nel supporto del ulramicrotome e, utilizzando lo stereomicroscopio collegato, ritagliare intorno alla regione di interesse con una lama di rasoio fino a solo una piccola piramide di resti materiali. </li><li> Ulteriori tagliare il blocco, con un coltello di vetro fisso nella ultramicrotomo, in modo che la regione di interesse può essere localizzato con precisione rispetto alle dimensioni della superficie del blocco (Figura 1). Tagliare un bordo del blocco, vicino alla regione di interesse, in modo che un passo perpendicolare viene tagliato attraverso il campione (Figura 1 e 2). Questa fase costituisce il volto di imaging (Figura 2). </li><li> Rimuovere il blocco dal ultramicrotomo e fotografare la regione di interesse all&#39;interno del blocco, utilizzando un microscopio a luce trasmessa. </li><li> Tagliare il blocco tagliato fuori il mozzicone resina rimanenti. Questo viene fatto utilizzando visto una gioielleria ed assicura che solo un piccolo blocco è collocato all&#39;interno del FIB / SEM. L&#39;altezza totale di questo blocco non deve essere superiore a 5 mm. </li><li> Incollare il blocco di uno stub in alluminio con pasta di carbonio garantire che il lato da acquisire è sul bordo più esterno (Figura 1). </li><li> Dopo che la colla si è asciugata, rivestire il blocco con un sottile strato di oro (&gt; 20 nm; sistema di aspirazione Cressington evaporazione). </li></ol> 3. Imaging nella FIB / SEM <ol start="20"><li> Con un ingrandimento basso, e con elettroni secondari di imaging (5 kV, 0,5 nAmp), orientare il blocco in modo che la regione di interesse e scelto il lato del blocco di essere ripreso sia rivolto verso l&#39;operatore (Figura 2 c, d). </li><li> Orientare il blocco in modo che la faccia ad essere ripreso è parallelo al fascio di fresatura. Ciò significa che il fascio di elettroni è orientato a 54 ° a questa faccia (Figura 2 b). </li><li> L&#39;utilizzo di un fascio di ioni di corrente 13-27 nAmps a 30 kV rimuovere una stretta banda di resina dalla parte anteriore della regione da acquisire. </li><li> Passa alla modalità di imaging retrodiffusi per vedere il volto fresato che sovrasta la regione di interesse. </li><li> Utilizzando la microscopia a luce immagine di riferimento (presa a passo 16) e l&#39;immagine del volto fresato individuare l&#39;area esatta sul blocco da fresare e ripreso (Figura 2). </li><li> Depositare uno strato protettivo (circa 1 micron di spessore) di carbonio (o metallo), utilizzando il sistema di iniezione di gas del microscopio, sulla superficie del blocco, al di sopra della regione di interesse (Figura 2). </li><li> Utilizzando una corrente di 700 picoAmps, mulino finemente la regione del blocco all&#39;interno del quale le immagini finale sarà presa. </li><li> Lascia il raggio di fresatura a questo mulino completamente volto immagine fino a quando non gli artefatti di fresatura può essere visto sul viso. Un mulino completa del viso è controllato da osservare i cambiamenti in ogni immagine successiva attraverso l&#39;intero campo visivo. Fresatura inadeguato può anche visto come striature bianche o &#39;tende&#39; apparire Vertically nell&#39;immagine. </li><li> Lasciare il microscopio per almeno 2 ore per tutte le modifiche termica da smaltire. Questo riduce il rischio che la faccia blocco andrà alla deriva durante l&#39;imaging, con conseguente immagini disallineate. </li><li> Selezionare i parametri microscopio per l&#39;imaging del viso in serie. Assicurarsi che il fascio di elettroni ha una tensione che è abbastanza basso per l&#39;immagine solo una profondità di materiale a fronte del blocco. Questo dovrebbe anche essere molto meno profonda di quanto lo spessore della faccia da rimuovere. I parametri tipici per l&#39;imaging sono tensioni tra 1,2-2,0 kV con dimensioni in pixel di tra 4 - 20 nm. Il pixel sosta bisogno di tempo per essere mantenuta intorno al 10 μsecs in modo che il tempo totale per macinare il viso e acquisire una sola immagine viene mantenuta sotto i 2 minuti (Figura 3). </li></ol> 4. Segreti del successo Passo 1) Assicurarsi che i campioni non sono più spessi 150 micron. Ciò consentirà un&#39;adeguata penetrazione delle macchie diverse e resina nel materiale. Ciò può essere ottenuto sezionando i campioni con un vibratome subito dopo la fissazione. Questo spessore è appropriato per il tessuto cerebrale. Altri tessuti devono essere testati per garantire adeguato di fissazione e colorazione. Fase 3) I campioni devono essere liberamente distribuiti in tutta la soluzione, e non raggruppate in una parte del flaconcino mentre questo fissativo secondario è introdotto. Questo garantirà la massima penetrazione del campione e di ridurre il campione diventa distorto durante questo processo di fissazione. Questo risultato è ottenuto rimestando delicatamente i campioni all&#39;interno della fiala immediatamente dopo la soluzione è aggiunto. Punto 15) Assicurarsi che la regione di interesse si trova immediatamente sotto (&lt;30 micron) la superficie del blocco. Ciò consentirà di ridurre la quantità di fresatura dal fascio di ioni durante la fase di acquisizione delle immagini. Punto 22) Il tempo di scansione del fascio di ioni deve essere adequte per assicurare che il volto di imaging intero è completamente fresato. Fresatura inadeguata verrà mostrato come striature bianche, o &#39;tende&#39; che appaiono in verticale lungo il viso di imaging. Punto 26) La faccia finale fresato deve essere più grande il volto che è immaginato. Questo perché la resina fresato viene espulso dal blocco e redeposits sulla superficie del blocco nelle immediate vicinanze. Questo rideposizione può sconfinare in campo dell&#39;imaging di vista, ed è evitata mediante fresatura una zona molto più ampia di quella immaginata. Per una finestra di imaging che è di 20 micron di larghezza, il volto blocco fresato è maggiore di 30 micron di larghezza. Punto 29) E &#39;fondamentale che i parametri di fascio di elettroni sono tali che l&#39;immagine è generata da elettroni che emergono da solo il nanometri prime della superficie del blocco. Questo è un acheved riducendo al minimo la tensione al di sotto del 2 kV e assicurando che nessun elettrone penetrare troppo in là. Questo è anche aiutato con una tensione di griglia sul rivelatore in modo che solo l&#39;elettrone con le più alte energie contribuire all&#39;immagine finale. Tipicamente, una tensione di 1,3 kV griglia viene utilizzato per una tensione di imaging di 1,5 kV. 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Preparazione del blocco di resina. A) in resina incorporata sezione coronale (80 micron di spessore) con un cervello di ratto adulto visualizzati in un steromicroscope. L&#39;immagine mostra chiaramente le differenti regioni del cervello che può essere tagliato dalla sezione (b) utilizzando un bisturi. Qui, un 1 mm quadrati dalla corteccia viene rimossa e (c) attaccato ad un blocco di resina bianca. D) Il blocco di resina viene poi tagliato con un coltello di vetro montato in un ultramicrotomo, e una volta che il blocco è stato ridotto a lasciare solo il regione di interesse (e), un passo è tagliata perpendicolarmente alla superficie anteriore del materiale incorporato. f) Tutta questa regione assettato è poi tagliato dal resto della resina e montato su un perno in alluminio pronto per il rivestimento di metallo e di imaging nella microscopio elettronico a scansione. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Preparazione del viso blocco per FIB / SEM imaging. A) e b) mostrano le illustrazioni del blocco e il bordo che viene macinato per creare il volto di imaging (indicata con il nero doppia freccia). La posizione del fascio di ioni (bianco) viene mostrata in parallelo alla faccia di imaging, e il fascio di elettroni (grigio) è indicata colpire la faccia a 54 ° rispetto al fascio di ioni. C) mostra una visione del blocco prese con il fascio di elettroni e ripreso con gli elettroni secondari. Lungo questo lato del blocco di una regione più scura (indicata con la scatola bianca punteggiata) mostra una parte del viso che è stato di circa lavorato (mostrato con doppia testatandr freccia nera) per rivelare il campione di fondo. d) Quando questa regione è ripreso solo con gli elettroni retrodiffusi il tessuto incorporato può essere visto. Qui, l&#39;intera larghezza della sezione di tessuto incorporato è indicato con una doppia freccia a due punte bianche. Barra di scala in c) è di 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/2588/2588fig3.jpg" alt="Figura 3"/> Figura 3. Imaging il volume del tessuto cerebrale con voxel isotropico. A) l&#39;immagine invertita retrodiffusi contrasto del blocco che mostra il volto ultrastruttura all&#39;interno di una regione del cervello di ratto. Tutte le membrane sono visibili così come le strutture macromolecolari di grandi dimensioni. B) Un totale di 1600 immagini sono state raccolte in 5 spaziatura nm con un conseguente serie di immagini con voxel isotropico. C) Questa pila può essere ripreso in qualsiasi aereo con la stessa risoluzione. Questa immagine mostra singola connessione sinaptica che è ripreso nel piano xy e il piano yz.

<ol>
	<li>Knott, G., Marchman, H., Wall, D., Lich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+section+scanning+electron+microscopy+of+adult+brain+tissue+using+focused+ion+beam+milling.">Serial section scanning electron microscopy of adult brain tissue using focused ion beam milling.</a> J Neurosci. 28, 2959-2964 (2008).</li><li>Hekking, L. H., Lebbink, M. N., De Winter, D. A., Schneijdenberg, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focused+ion+beam-scanning+electron+microscope:+exploring+large+volumes+of+atherosclerotic+tissue.">Focused ion beam-scanning electron microscope: exploring large volumes of atherosclerotic tissue.</a> J Microsc. 235, 336-347 (2009).</li><li>Armer, H. E., Mariggi, G., Png, K. M., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+transient+blood+vessel+fusion+events+in+zebrafish+by+correlative+volume+electron+microscopy.">Imaging transient blood vessel fusion events in zebrafish by correlative volume electron microscopy.</a> PLoS One. 4, e7716-e7716 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

La tecnica della FIB / SEM funziona in modo ottimale quando la regione di interesse non è troppo grande. Il limite massimo per un volume ripreso dipende dal fascio di ioni e la zona che può costantemente mulino ripetutamente nell&#39;arco di molte ore. Finora questo è stato fatto con aree di circa 60 x 60 micron, tuttavia, questa immagine intera area non è possibile con una risoluzione di immagine adatta, soprattutto per il fattore tempo nella raccolta di una grande immagine. A titolo di esempio, un 4 immagine kx 4 k pixel con un tempo di permanenza a 10 microsecondi sarebbe prendere 2 minuti e 40 secondi di acquisire, e per un campo di vista di 60 micron questo sarebbe solo dare una dimensione del pixel di 15 nm. Per l&#39;imaging l&#39;ultrastruttura di cellule e tessuti, una dimensione del pixel più piccolo è più adatto, di solito tra i 4 ei 10 nm / pixel. Per una superficie di 60 x 60 micron l&#39;immagine sarebbe stata acquisita in 10 ore, anche se il microscopio fosse questa possibilità. Per queste ragioni, il microscopio è uno strumento ideale per i volumi di immagini nell&#39;ordine di 10 x 10 x 10 micron, o regioni significativa di cellule intere. Questo può essere fatto facilmente in un periodo di 48 ore su campioni che sono ben in contrasto con questa procedura. Finora il protocollo è stato utilizzato principalmente con tessuto cerebrale, così come vari tipi di colture di cellule di mammifero aderire a lamelle. Tuttavia, la procedura di fissazione e la colorazione può essere utilizzato con molti altri tipi di materiale biologico, anche materiale vegetale per produrre ugualmente pile immagine ben contrastata. Pertanto, il principale vantaggio di questa tecnica è la capacità di volumi di immagine con voxel isotropico. Pile immagine di questo tipo permettono di analisi del volume 3d con immagini scattate in qualsiasi aereo nello stack. Il vantaggio di questo è di permettere all&#39;osservatore di caratteristiche dell&#39;immagine nella serie di immagini da qualsiasi direzione e fornendo un maggiore dettaglio immagine (Figura 3).

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Collante cianoacrilato </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microscopio da dissezione: Leica MZ8 </td><td> Leica Microsystems, Germania </td><td></td></tr><tr><td> Durcupan resina </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td></td></tr><tr><td> FIB / SEM microscopio (Zeiss, nVision 40) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vetro istologia diapositive </td><td> Menzel-Glaser, Germania </td><td> AA00008032E </td></tr><tr><td> Vetro coltellinaio: Leica EM KMR2 </td><td> Leica Microsystems, Germania </td><td></td></tr><tr><td> Scintillazione fiale di vetro (20 ml) </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 72634 </td></tr><tr><td> Glutaraldeide </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 16222 </td></tr><tr><td> Gioielleria sega </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 72010 </td></tr><tr><td> Mould distaccante </td><td> Glorex, Svizzera </td><td> 62407445 </td></tr><tr><td> Osmio tetrossido </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> 19110 </td></tr><tr><td> Paraformaldeide </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> RT 19208 </td></tr><tr><td> Sali di fosfato di tampone fosfato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td> 71642 e 71496 </td></tr><tr><td> Sodio cacodilato </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td> 20840 </td></tr><tr><td> Sputter Coater con target d&#39;oro </td><td> Cressington, Stati Uniti </td><td></td></tr><tr><td> Tris base (TBS) </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Svizzera </td><td> T1378 </td></tr><tr><td> Ultramicrotomo: Leica UCT </td><td> Leica Microsystems, Germania </td><td></td></tr><tr><td> Acetato di uranile </td><td> SME, Stati Uniti d&#39;America </td><td> RT 22451 </td></tr></tbody></table>

focussed ion beam milling and scanning electron microscopy of brain tissue

Questo protocollo descrive come campioni biologici, come il tessuto cerebrale, è possibile creare immagini in tre dimensioni con il fascio di ioni focalizzati / microscopio elettronico a scansione (FIB / SEM). I campioni sono fissati con aldeidi, macchiata da metalli pesanti utilizzando tetrossido di osmio e acetato di uranile. Essi vengono poi disidratate con alcool e infiltrati con resina, che viene poi fissata. Utilizzando un microscopio ottico e ultramicrotomo con coltelli in vetro, un piccolo blocco contenente l&#39;interesse regione vicino alla superficie è fatto. Il blocco viene poi inserito all&#39;interno della FIB / SEM, e il fascio di ioni utilizzato per circa mulino una parete verticale lungo un lato del blocco, nei pressi di questa regione. Utilizzando elettroni retrodiffusi per l&#39;immagine delle strutture sottostanti, un volto più piccolo viene poi macinato con un fascio di ioni più fine e la superficie esaminata più da vicino per determinare l&#39;area esatta del faccia a essere ripreso e fresati. I parametri del microscopio sono quindi impostare in modo che il volto è ripetutamente fresato e ripreso in modo che le immagini seriali sono raccolti attraverso un volume del blocco. La serie di immagini in genere contengono voxel isotropico di dimensioni più piccole uno nm 4 in ogni direzione. Questa qualità delle immagini in qualsiasi piano di imaging permette all&#39;utente di analizzare ultrastruttura cellulare in qualsiasi angolo di visione all&#39;interno della serie di immagini.

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Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

Questo protocollo descrive come il tessuto cerebrale resina incorporati possono essere preparati e ripreso nelle tre dimensioni del fascio di ioni focalizzato, microscopio elettronico a scansione.

Ion Beam concentrato di fresatura e Microscopia Elettronica a Scansione di tessuto cerebrale

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

focussed-ion-beam-milling-scanning-electron-microscopy-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

27.8K Views.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne. Questo protocollo descrive come il tessuto cerebrale resina incorporati possono essere preparati e ripreso nelle tre dimensioni del fascio di ioni focalizzato, microscopio elettronico a scansione.

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Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments (dendrite, dendritic spine, axon, axon terminal, perikaryon), as well as their intracellular organelles and cytoskeleton, in the central nervous system at high spatial resolution. Combined with TEM, pre-embedding immunocytochemistry allows the discrimination of cellular elements with few distinctive features and identification criteria (e.g., microglial perikarya and processes, when using an antibody against the microglia-specific marker Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; as presented here)), identifying the neurotransmitter contents of cellular elements (e.g., serotonergic) and their ultrastructural localization of soluble or membrane-bound proteins (e.g., 5 HT1A and EphA4 receptors). Here, we describe a protocol for transcardiac perfusion of mice with acrolein fixative, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase-diaminobenzidine (DAB) staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with TEM. When rigorously performed, this technique provides an excellent compromise between optimal ultrastructural preservation and immunocytochemical detection.

We describe a protocol for transcardiac perfusion of mice, removal and sectioning of the brain, as well as immunoperoxidase staining, resin embedding, and ultrathin sectioning of the brain sections. Upon completion of these procedures, the immunostained material is ready for examination with transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Transmission electron microscopy (TEM) is extremely useful for visualizing microglial, oligodendrocytic, astrocytic, and neuronal subcellular compartments ...

Ricerca

Neuroscienze

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Double-barreled and Concentric Microelectrodes for Measurement of Extracellular Ion Signals in Brain Tissue

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular concentration of all major ions. As these ion shifts bear significant functional consequences, their quantitative determination is often required to understand the function and dysfunction of neural networks under physiological and pathophysiological conditions. In the present study, we demonstrate the fabrication and calibration of double-barreled ion-selective microelectrodes, which have proven to be excellent tools for such measurements in brain tissue. Moreover, so-called &#8220;concentric&#8221; ion-selective microelectrodes are also described, which, based on their different design, offer a far better temporal resolution of fast ion changes. We then show how these electrodes can be employed in acute brain slice preparations of the mouse hippocampus. Using double-barreled, potassium-selective microelectrodes, changes in the extracellular potassium concentration ([K+]o) in response to exogenous application of glutamate receptor agonists or during epileptiform activity are demonstrated. Furthermore, we illustrate the response characteristics of sodium-sensitive, double-barreled and concentric electrodes and compare their detection of changes in the extracellular sodium concentration ([Na+]o) evoked by bath or pressure application of drugs. These measurements show that while response amplitudes are similar, the concentric sodium microelectrodes display a superior signal-to-noise ratio and response time as compared to the double-barreled design. Generally, the demonstrated procedures will be easily transferable to measurement of other ions species, including pH or calcium, and will also be applicable to other preparations.

We demonstrate the fabrication, calibration and properties of two types of ion-selective microelectrodes (double-barreled and concentric) for measurement of ion concentrations in brain tissue. These are then used in the mouse hippocampal slice preparation to show that excitatory activity changes both extracellular potassium and sodium concentrations.

Microelettrodi doppia canna e concentrico per la misurazione di extracellulare Ion Segnali in tessuto cerebrale

Electrical activity in the brain is accompanied by significant ion fluxes across membranes, resulting in complex changes in the extracellular ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

La caratterizzazione delle proprietà meccaniche del multiscala cervello tessuti utilizzando microscopia a forza atomica, Impatto rientro, e Reometria

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Analysis of Brain Mitochondria Using Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, tri-carboxylic acid (TCA) cycle and oxidative phosphorylation (OXPHOS) pathways to produce cellular energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Impairment of mitochondrial ATP production causes mitochondrial disorders, which present clinically with prominent neurological and myopathic symptoms. Mitochondrial defects are also present in neurodevelopmental disorders (e.g. autism spectrum disorder) and neurodegenerative disorders (e.g. amyotrophic lateral sclerosis, Alzheimer&#39;s and Parkinson&#39;s diseases). Thus, there is an increased interest in the field for performing 3D analysis of mitochondrial morphology, structure and distribution under both healthy and disease states. The brain mitochondrial morphology is extremely diverse, with some mitochondria especially those in the synaptic region being in the range of &#60;200 nm diameter, which is below the resolution limit of traditional light microscopy. Expressing a mitochondrially-targeted green fluorescent protein (GFP) in the brain significantly enhances the organellar detection by confocal microscopy. However, it does not overcome the constraints on the sensitivity of detection of relatively small sized mitochondria without oversaturating the images of large sized mitochondria. While serial transmission electron microscopy has been successfully used to characterize mitochondria at the neuronal synapse, this technique is extremely time-consuming especially when comparing multiple samples. The serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) technique involves an automated process of sectioning, imaging blocks of tissue and data acquisition. Here, we provide a protocol to perform SBFSEM of a defined region from rodent brain to rapidly reconstruct and visualize mitochondrial morphology. This technique could also be used to provide accurate information on mitochondrial number, volume, size and distribution in a defined brain region. Since the obtained image resolution is high (typically under 10 nm) any gross mitochondrial morphological defects may also be detected.

Mitochondrial visualization and analysis from mammalian brain tissue is a challenging task. Here, we describe how three dimensional (3D) reconstruction analysis from the serial block-face scanning electron microscopy (SBFSEM) can be used to gain insights on the morphological and volumetric analysis of this critical energy generating organelle.

Analisi di Brain mitocondri Utilizzando Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy

Human brain is a high energy consuming organ that mainly relies on glucose as a fuel source. Glucose is catabolized by brain mitochondria via glycolysis, ...

Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and characterize ultrastructural and morphological details of neurons, such as synaptic contacts. Good preservation of brain tissue for electron microscopy can be obtained by rigorous cryo-fixation methods, but these techniques are rather costly and limit the use of immunolabeling, which is crucial to understand the connectivity of identified neuronal systems. Freeze-substitution methods have been developed to allow the combination of cryo-fixation with immunolabeling. However, the reproducibility of these methodological approaches usually relies on costly freezing devices. Moreover, achieving reliable results with this technique is very time-consuming and skill-challenging. Hence, the traditional chemically fixed brain, particularly with acrolein fixative, remains a time-efficient and low-cost method to combine electron microscopy with immunohistochemistry. Here, we provide a reliable experimental protocol using chemical acrolein fixation that leads to the preservation of primate brain tissue and is compatible with pre-embedding immunohistochemistry and transmission electron microscopic examination.

Here, we provide an easy, low-cost, and time-efficient protocol to chemically fix primate brain tissue with acrolein fixative, allowing for long-term preservation that is compatible with pre-embedding immunohistochemistry for transmission electron microscopy.

Preparazione del tessuto cerebrale Primate non umano per la pre-embedding immunoistochimica e microscopia elettronica

Despite all the technological advances at the light microscopy&#160;level, electron microscopy remains the only tool in neuroscience to examine and ...

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cell excitability. Altered concentrations of extracellular K+ affect the resting membrane potential and cellular excitability by shifting the equilibria between closed, open and inactivated states for voltage-dependent ion channels that underlie action potential initiation and conduction. Hence, it is valuable to directly measure extracellular K+ dynamics in health and diseased states. Here, we describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. We deployed them in adult hippocampal brain slices to measure electrically evoked K+ concentration dynamics. The judicious use of such electrodes is an important part of the tool-kit needed to evaluate cellular and biophysical mechanisms that control extracellular K+ concentrations in the nervous system.

Potassium ions contribute&#160;to the resting membrane potential of cells and extracellular K+ concentration is a crucial regulator of cellular excitability. We describe how to make, calibrate and use monopolar K+-selective microelectrodes. Using such electrodes enables the measurement of electrically evoked K+ concentration dynamics in adult hippocampal slices.

Facendo, test e l'utilizzo di microelettrodi selettivo di ioni potassio in fettine di tessuto del cervello adulto

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

Horizontal Hippocampal Slices of the Mouse Brain

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as well as the manifestation of severe brain disorders, including Alzheimer&#8217;s disease and epilepsy. The hippocampus receives a high degree of intra- and inter-connectivity, securing a proper communication with internal and external brain structures. This connectivity is accomplished via different informational flows in the form of fiber pathways. Brain slices are a frequently used methodology when exploring neurophysiological functions of the hippocampus. Hippocampal brain slices can be used for several different applications, including electrophysiological recordings, light microscopic measurements as well as several molecular biological and histochemical techniques. Therefore, brain slices represent an ideal model system to assess protein functions, to investigate pathophysiological processes involved in neurological disorders as well as for drug discovery purposes.
There exist several different ways of slice preparations. Brain slice preparations with a vibratome allow a better preservation of the tissue structure and guarantee a sufficient oxygen supply during slicing, which present advantages over the traditional use of a tissue chopper. Moreover, different cutting planes can be applied for vibratome brain slice preparations. Here, a detailed protocol for a successful preparation of vibratome-cut horizontal hippocampal slices of mouse brains is provided. In contrast to other slice preparations, horizontal slicing allows to keep the fibers of the hippocampal input path (perforant path) in a fully intact state within a slice, which facilitates the investigation of entorhinal-hippocampal interactions. Here, we provide a thorough protocol for the dissection, extraction, and acute horizontal slicing of the murine brain, and discuss challenges and potential pitfalls of this technique. Finally, we will show some examples for the use of brain slices in further applications.

This article aims to describe a systematic protocol to obtain horizontal hippocampal brain slices in mice. The objective of this methodology is to preserve the integrity of hippocampal fiber pathways, such as the perforant path and the mossy fiber tract to assess dentate gyrus related neurological processes.

Fette ippocampali orizzontali del cervello del topo

The hippocampus is a highly organized structure in the brain that is a part of the limbic system and is involved in memory formation and consolidation as ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopia elettronica a scansione a blocchi seriali (SBEM) per lo studio delle spine dendritiche

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...