Abbiamo utilizzato con successo questo metodo per creare un modello murino più coerente con i cambiamenti patologici dell'atresia biliare. Questa tecnica può simulare i sintomi dell'atresia biliare acuta e cronica, che è utile per la futura ricerca sui meccanismi della malattia. Dopo l'uso di anticorpi, il tempo di sopravvivenza dei topi è stato prolungato e i sintomi sono stati alleviati, suggerendo l'effetto terapeutico degli anticorpi sull'atresia biliare.
Dopo aver diviso i topi neonatali in diversi gruppi, come descritto nel manoscritto, pretrattare ciascun topo con un'iniezione intraperitoneale di cinque microgrammi di anticorpo anti-Ly6G quattro ore prima del rotavirus rhesus o dell'iniezione di RRV per esaurire le cellule Gr1-positive. Entro 24 ore dalla nascita, iniettare per via intraperitoneale il topo neonatale con 20 microlitri di rotavirus rhesus o soluzione salina. Dopo l'iniezione RRV, somministrare 20 microgrammi di anticorpi anti-Ly6G nell'addome del topo.
Controlla e registra l'aspetto, il peso e la sopravvivenza di tutti i topi ogni giorno. Per l'iniezione intraperitoneale, esporre l'addome del topo giovane pizzicando la pelle del collo con l'indice e il pollice di una mano e tenendo delicatamente le zampe posteriori del topo con l'anulare e la coda. Sollevare l'ago della siringa con un'inclinazione verso l'alto e inserire l'ago nella coscia centrale della zampa posteriore destra del topo con un angolo di 15 gradi con la pelle.
Mentre si muove l'ago lungo il percorso sottocutaneo fino a raggiungere il bordo costale destro del topo, dirigere l'ago verso il basso nella cavità addominale e iniettare il liquido sotto il fegato del topo. Tiri fuori l'ago immediatamente dopo l'iniezione. Osservare per sanguinamento o perdite nel sito di iniezione.
Dopo aver anestetizzato il topo il 12 ° giorno, sezionarlo al microscopio. Inserire una siringa da insulina da un millilitro nel ventricolo sinistro del cuore per raccogliere il sangue. Centrifugare il sangue a 400 g per cinque minuti a temperatura ambiente e separare il siero per le misurazioni della funzionalità epatica.
Sezionare il fegato di topo e la milza dai tessuti circostanti usando forbici e pinzette. Fotografa l'aspetto generale del fegato e del dotto biliare. Dopo l'anestesia per inalazione, esporre il fegato, la cistifellea e i dotti biliari extraepatici con forbici e tamponi di cotone.
Sotto un microscopio posturale, iniettare da cinque a 10 microlitri del colorante fluorescente Rhodamine 123 nella cistifellea con una siringa da insulina da un millilitro e scattare foto. Immergere il tessuto epatico di topo fresco in formalina al 10% per 24 ore. Una volta che il tessuto è incorporato nella paraffina, utilizzare un microtomo di paraffina per tagliare il blocco di paraffina in sezioni con uno spessore di quattro micrometri e posizionare due sezioni consecutive sullo stesso vetrino.
Quindi mettere le fette in una griglia, decerarle in xilene e idratarle successivamente in etanolo assoluto, etanolo al 95%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata per cinque minuti ciascuna. Macchiare le sezioni con una soluzione di ematossilina per cinque minuti e immergerle in acido cloridrico all'1% e alcool al 75% per cinque secondi. Dopo aver risciacquato le sezioni con acqua pulita, colorarle con la soluzione di eosina per un minuto.
Preparare le sezioni di tessuto per la colorazione, come dimostrato in precedenza, ed eseguire la riparazione dell'antigene con il tampone Tris-EDTA. Riscaldare le sezioni in un forno a microonde a 95 gradi Celsius per 10 minuti, quindi rimuoverle e raffreddarle naturalmente a temperatura ambiente. Per rimuovere la perossidasi endogena, posizionare le sezioni di tessuto in perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti e trattare le fette con il 5% di siero di capra per bloccare il legame non specifico.
Quindi, aggiungere alle sezioni la citocheratina 19 anti-topo primaria del ratto o l'anticorpo monoclonale F4/80 del ratto anti-topo e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Incubare le sezioni con anticorpi secondari appropriati per 30 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare 3, 3-prime-diaminobenzidina come agente cromogenico per osservare la reazione cromogenica al microscopio.
Osservare le fette al microscopio 40x per ottenere immagini e analizzarle secondo necessità. Una volta che le sezioni di tessuto sono state preparate e controcolorate con ematossilina, coprire ogni tessuto con 50 microlitri di soluzione di colorante rosso sirius a temperatura ambiente per un'ora. Asciugare i vetrini naturalmente a temperatura ambiente per quattro ore, aggiungere una goccia di gomma neutra a ciascun vetrino e utilizzare un vetrino di copertura per coprire il tessuto per evitare bolle.
Lasciare i vetrini a temperatura ambiente per 24 ore per solidificare la gomma neutra. Osservare i dettagli della deposizione di collagene utilizzando la microscopia a luce a contrasto polarizzata. Selezionare un campo visivo chiaro e adatto e regolare la luminosità e il bilanciamento del bianco del campo visivo del microscopio.
Ottieni immagini e analizzale secondo necessità con un microscopio 40x. Dopo l'iniezione di RRV, il tempo mediano di sopravvivenza nel gruppo RRV è stato di 13 giorni. La maggior parte dei topi trattati con l'anticorpo ha sviluppato ittero lieve e non è stata osservata alcuna perdita di peso.
I fegati dei topi BA mostravano lesioni necrotiche e un segmento extraepatico di atresia del dotto biliare. La dimensione del fegato è più piccola dei controlli. L'analisi istologica ha mostrato che la terapia anti-Ly6G a basso dosaggio ha ridotto l'infiammazione della vena porta.
L'accumulo di cellule infiammatorie è stato ancora osservato nelle fette di tessuto epatico il giorno 42. Il giorno 12, c'è stato un leggero aumento della deposizione di collagene nella regione portale. Il giorno 42, l'espressione del collagene è stata significativamente aumentata e si è osservata una sostanziale deposizione di collagene nel tessuto BA.
Le cellule CK19-positive sono state osservate il giorno 12. Il giorno 42, le cellule CK19-positive sono aumentate, ma c'erano pochi dotti biliari maturi. Il dotto biliare extraepatico nei topi BA cronici era bloccato e aveva infiltrati infiammatori di microfagi.
I livelli di ALT e ALP nel fegato erano più alti nel gruppo BA cronico rispetto al gruppo di controllo normale. I livelli di bilirubina totale, bilirubina diretta e bilirubina indiretta sono aumentati, indicando che la funzionalità epatica era significativamente ridotta nella fase di fibrosi cronica di BA. L'iniezione deve essere fatta con cautela per non perforare il fegato del topo. Dopo l'iniezione, dovremmo impiegare circa 10 secondi per osservare lo stato del topo e pulire il sangue dalla ferita.
