L'obiettivo generale del protocollo è quello di generare un modello di topo umanizzato con sistema immunitario umano funzionale e fegato utilizzando cellule staminali ematopoietiche umane e sito epato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei topi umanizzati del fegato genetico. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare l'immunopatologia causata dall'HIV osservata nelle persone.
A dimostrare il processo sarà Yimin Sun, supervisore del dipartimento di patologia e microbiologia, insieme a Weimin Wang ed Edwrd Makarov, tecnologo della ricerca. Per iniziare, trasferire il sangue del cordone ombelicale raccolto in tubi eparinizzati in un armadio a flusso laminare sterile. Aggiungere PBS fino a quando il volume non viene aumentato a 35 millilitri.
Sovrapporre il campione sopra il mezzo di separazione dei linfociti e centrifugarlo 400 volte G e a quattro gradi Celsius per 35 minuti senza pause. Quindi, rimuovere con cura lo strato plasmatico superiore e utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire l'interfaccia del mantello bianco buffy su un nuovo tubo. Sospendere di nuovo il mantello buffy in tampone freddo da 30 a 40 millilitri.
Utilizzando una pipetta, combinare 20 microlitri della sospensione cellulare con 20 microlitri dello 0,4% di tripano blu. Pipettare 10 microlitri di questa miscela nell'apertura esterna di una delle due camere di una diapositiva di conteggio e inserire la diapositiva in un contatore di celle automatizzato per contare le celle. Centrifugare le cellule a 300 volte G e a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Aspirare con cura il supernatante e aggiungere 300 microlitri di tampone freddo ghiacciato. Aggiungere 100 microlitri di reagente bloccante del recettore FC umano e 100 microlitri di anticorpi CD34 anti-umani del mouse monoclonale coniugati MicroBeads per un massimo di 100 milioni di cellule. Incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Aggiungere 10 millilitri di tampone freddo ghiacciato per lavare le cellule e centrifugarlo 300 volte G e quattro gradi Celsius per 10 minuti. Rimuovere con cura il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di tampone freddo ghiacciato. Successivamente, posizionare una colonna LS di selezione positiva nel campo magnetico di smistamento delle celle attivate e passarla attraverso con tre millilitri di tampone freddo di ghiaccio.
Caricare il campione nella colonna LS in grado di intrappolare MicroBeads legati a cellule positive CD34 umane nei campioni e consentirgli di fluire sotto l'influenza della gravità nel tubo di raccolta. Lavare la colonna tre volte con tampone ghiacciato e raccogliere l'eluente nello stesso tubo di raccolta. Quindi, immergere la colonna con cinque millilitri di tampone freddo ghiacciato per alludere alle cellule positive cd34 in un nuovo tubo di raccolta.
Ripetere la procedura per ottenere una purezza superiore al 90%Avanti, utilizzare la tintura blu trypan e un emocitometro per contare le cellule positive CD34 eluse. Dopo il conteggio, centrifugare le cellule a 300 volte G per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in 125 microlitri di PBS per un'iniezione da utilizzare immediatamente nel trapianto.
Per verificare la purezza dell'eluente positivo CD34, prendere 50 microlitri della sospensione e incubarlo con 10 microlitri di anticorpo CD34 anti-umano coniugato in PE a quattro gradi celsius per 30 minuti. Successivamente, lavare e sospendere di nuovo le cellule in PBS e procedere all'esecuzione della citometria a flusso. Dopo l'acquisizione, analizzare i dati come delineato nel protocollo di testo.
In primo luogo, recuperare e scongelare gli epatociti crioconservati come delineato nel protocollo di testo. Quindi, rimuovere il cappuccio bio e versare gli epatociti scongelati in un tubo conico da 50 millilitri contenente mezzo di scongelamento riscaldato. Scuotere il tubo a mano per alcuni secondi per sospendere le celle.
Pellet le cellule a 100 volte G e a temperatura ambiente per otto minuti. Lavare le celle a pellet in PBS con lo 0,1%BSA e raggrupparle con HSPC freschi o scongelati in PBS fino a un volume finale di 80 microlitri per mouse. In primo luogo, attaccare un'estremità di un tubo di estensione sterile a un ago calibro 30 e l'altra estremità a una siringa millilitro.
Riempire la siringa con la sospensione di HEP e HSPC raggruppati. Inserire la siringa nella tacca di una pipetta di erogazione ripetitiva e regolare il distributore per erogare 10 microlitri in ogni pressa. Radere ogni mouse come indicato nel protocollo di testo e pulire il lato sinistro del corpo di ogni mouse con il 10% di iodio di povidone seguito al 70% da alcol isopropile.
Usando le forbici di tipo Vannas, fai una piccola incisione nella pelle, nel muscolo e nel peritoneo a sinistra della parete peritoneale per entrare nella cavità peritoneale circa 5 millimetri sotto il bordo inferiore della gabbia toracica. Individuare la milza e utilizzare le pinza per tirarla leggermente nell'area operativa per un facile accesso e inserire l'ago calibro 30 nel palo inferiore della milza. Quindi, sbloccare lo stantuffo della pipetta di erogazione e erogare 10 microlitri del volume alla volta, con un limite di 60-80 microlitri per milza.
Ritrarre lentamente l'ago e ritagliare la milza con clip leganti utilizzando un oggetto di legatura. Quindi, utilizzare applicatori con punta di cotone bagnati con PBS sterile per spingere la milza nella cavità corporea. Utilizzare un modello di sutura interrotto per chiudere lo strato muscolare della parete addominale.
Completa la chiusura della pelle con un modello di sutura interrotto utilizzando suture non assorbibili. Trasferisci tutti i materiali necessari in una struttura Designata Biosafety Level Two Plus. Indossare dispositivi di protezione individuale tra cui una copertura monouso tutto l'abito, copriscarpe, una maschera per il viso e guanti doppi, compresi guanti resistenti al taglio, in ogni momento mentre si lavora con il virus.
Selezionare topi con una ricostituzione superiore al 15% delle cellule positive cd45 umane e con una presenza di albumina umana nel siero per l'infezione da HIV-1. Iniettare per via intraperitoneale i topi con 1.000-10.000 dosi infettive di coltura tissutale di 50 ADA HIV-1 in un volume da 100 a 200 microlitri per topo. Dopo aver eutanasiato i topi, asportare il fegato da ogni topo come delineato nel protocollo di testo.
Raccogliere e riparare i fegati in paraformaldeide al 4% durante la notte. L'istituzione di un doppio modello di topo umanizzato con fegato umano e cellule immunitarie può essere facilmente monitorata ad ogni passo con ELIZA molto semplice e citometria del flusso, rispettivamente. La citometria del flusso viene regolarmente eseguita per valutare lo sviluppo di un sistema immunitario funzionale e per vedere l'effetto dell'infezione da HIV sulle cellule immunitarie.
Nei due topi umanizzati, lo sviluppo di cellule immunitarie funzionali può variare dal 15 al 90% della porta dei linfociti. Per la valutazione dell'innesto degli epatociti umani, ELIZA per i livelli di albumina specifici dell'uomo viene eseguita mensilmente sul siero del topo. I topi innestati sia con HSPC che con HEP mostrano livelli di albumina specifici per l'uomo che vanno da circa sette microgrammi per millilitro a 377 microgrammi per millilitro a un mese, continuando a crescere nel tempo di osservazione.
L'effetto dell'infezione da HIV sulle cellule immunitarie umane nel sangue di due topi umanizzati è monitorato dalla citometria a flusso e sugli EP nel fegato dall'albumina ELIZA specifica dell'uomo. Entro cinque settimane, l'HIV-1 causa una diminuzione dei livelli di albumina umana nel siero e c'è un esaurimento degli epatociti positivi CK18 umani nelle sezioni epatiche dei due topi umanizzati. Un rapporto inferiore tra CD4 e CD8 è tipicamente osservato nel sangue e nel fegato dei topi infetti da HIV, rispetto ai livelli osservati nello stesso topo prima dell'infezione.
Il sangue deve essere stratificato con cura sopra il mezzo di separazione dei linfociti per isolamenti del mantello buffy. Per l'intervento chirurgico, tenere delicatamente la milza e inserire l'ago nel polo inferiore della milza. In seguito all'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche, è fondamentale verificare la purezza delle cellule staminali ematopoietiche positive CD34 per evitare cellule positive cd3 e iniezioni acute di epatociti di diversi donatori.
Poiché i topi umanizzati mostrano un aspetto fisiologico del sistema immunitario umano e del fegato, i topi sviluppati potrebbero essere utilizzati per studiare la fisiopatogenesi dell'HIV e le infezioni fisiche e la cirrosi.
