SS è finanziato da una borsa di studio clinico Wellcome Trust Intermediate, CW da Wellcome Trust programma Grant.

1. MicroSlide Preparazione <ol><li> Prerivestimento un MicroSlide sei canali con coda di ratto collagene di tipo I (RTC, diluito in PBS 1:100 dare una diluizione di lavoro di 220 mcg / ml). Questo viene effettuato iniettando 30 ml di soluzione diluita RTC direttamente nei canali e incubare per 2 ore a 37 ° C, seguita da tre lavaggi con PBS. </li></ol> 2. Cellule semina in Microslides <ol><li> Dissociare una fiasca T75 confluenti di cellule epatiche umane coltivate sinusoidali endoteliali (HSEC) (isolato da tessuto epatico come descritto in precedenza 13) in tripsina-EDTA, lavate in PBS e risospendere a 3 x 10 6 cellule / ml in mezzi completi (endoteliali umane terreni di base integrate con 2 mM L-glutammina, 100 U / ml di penicillina e la streptomicina 100μg/ml, siero umano il 10% inattivato al calore AB, di 10 ng / ml di fattore di crescita vascolare endoteliale e 10 ng / ml di fattore di crescita degli epatociti). Iniettare 30 ml di sospensione cellulare terribilictly in ciascun canale. </li><li> Lascia cellule di aderire per 1 h in un incubatore umidificato a 37 ° C con CO 2 nell&#39;atmosfera 5% su un rack scorrevole. Dopo permettendo alle cellule di aderire riempire le porte su entrambi i lati di ciascun canale con mezzo completo (Figura 1). </li></ol> 3. Citochina stimolazione delle cellule <ol><li> Lasciare le cellule in incubatore per 24 ore. Valutare la crescita delle cellule utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito. 24 ore prima del dosaggio adesione, stimolare i monostrati endoteliali con citochine sostituendo il materiale di crescita con mezzi completi integrati da fattore di necrosi tumorale alfa e interferone gamma, sia a 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolamento di sangue periferico linfociti <ol><li> Isolare linfociti del sangue periferico di sangue intero purificando inizialmente la frazione mononucleare dal gradiente di densità centrifugazione su un supporto di centrifugazione separazione cellulare appropriato per 25 min a 800x g. Incubare le cellule in plastica per 1 ora per consentire l&#39;adesione dei monociti. </li><li> Dopo l&#39;adesione ad aspirare plastica linfociti arricchito surnatante. Lavare i linfociti e risospendere loro (tipicamente 1 x 10 6 cellule / ml in mezzo di flusso (terreni di base endoteliali contenenti 0,1% (v / v) di albumina di siero bovino (BSA)). </li></ol> 5. Il pretrattamento di endotelio o leucociti con inibitori <ol><li> Preparare diluizioni raccomandate di anticorpi funzionali bloccare o piccole molecole inibitrici a endoteliale media/0.1% (v / v) BSA. Sostituire terreno completo con soluzione bloccante anticorpo / inibitore in canale MicroSlide scelto 30 min prima di fluire dosaggio. </li><li> Dove sono previsti pretrattamento di recettori per chemochine sui linfociti, risospendere leucociti isolati in soluzione RPMI contenente 0,1% (v / v) BSA e incubare con 200 ng / ml di tossina della pertosse per bloccare G-proteina recettore accoppiato attività di recettori per chemochine, in alternativa diluire specifico funzioneanticorpi bloccanti o piccole molecole inibitrici di recettori per chemochine alla diluizione raccomandata. Incubare leucociti a 37 ° C per 30 minuti, poi lavare e risospendere in mezzo flusso. </li></ol> 6. Impostazione del flusso sistema di test <ol><li> Preriscaldare una camera di controllo termostatico trasparente a 37 ° C. La camera deve avere porte per l&#39;inserimento del tubo in silicone e fornitura elettronico per un&#39;elettrovalvola elettronico che consente la commutazione tra le cellule e media praticamente senza volume morto. La camera è montata su un microscopio invertito per consentire microscopio a contrasto di fase. Figura 2 illustra la camera di dosaggio flusso e microscopio e MicroSlide posto sul palco microscopio. </li><li> PreFill una siringa di vetro da 50 ml con un luer lock con 10 ml di acqua distillata sterile e inserire un pezzo di tubo in silicone 25 cm a porta siringa. Inserire in una pompa a siringa. Alterare il tasso di ritiro della pompa siringa seguendoistruzioni del produttore MicroSlide per mantenere una sollecitazione di taglio di 0,05 Pa (0,5 dyne / cm 2, Figura 3). </li><li> Prendete due siringhe da 5 ml, scartare gli stantuffi e allegare i barili alle due porte nel flusso di una valvola a solenoide elettronica utilizzando tubi in silicone. <ol><li> Attaccare 12 cm di tubi in silicone alla valvola out-flow. La valvola permette alternanza tra un buffer cella lavaggio (endoteliale media/0.1% (v / v) BSA) e la sospensione linfocitaria. </li><li> Lavare l&#39;elettrovalvola elettronica inserendo il tampone di lavaggio sia in siringhe e garantendo tampone fluisce da un barile attraverso la valvola e nel tubo di silicone out-flow. </li><li> Con l&#39;interruttore valvola di alternare all&#39;altra canna e garantire il buffer è scorrevole e che tutte le bolle vengono rimossi dal sistema. Rimuovere il tampone di lavaggio da una delle canne e sostituire con linfociti sospensione Figura 4a. </li></ol></li><li> Collegare il Tubin siliconeg dalla pompa siringa ad una porta di un canale MicroSlide scelto tramite un adattatore MicroSlide. Quindi collegare il tubo di silicone dalla valvola di scarico alla porta opposta tramite un adattatore MicroSlide. Assicurarsi che il tubo in silicone e gli adattatori sono riempiti con tampone di lavaggio prima della connessione per evitare bolle d&#39;aria che entra nel sistema (Figura 4b). </li><li> Una volta collegato al sistema di flusso, posizionare il MicroSlide sul palco microscopio e fissare con fermagli o nastro adesivo per impedire il movimento. Impostare il microscopio per l&#39;obiettivo 10X con l&#39;impostazione della fase appropriata. Assicurarsi che il monostrato endoteliale viene visualizzato e messa a fuoco utilizzando la lente oculare. Garantire immagini possono essere catturate tramite una telecamera che è attaccato al microscopio per cui le immagini possono essere inoltrati ad un monitor e registrate. </li></ol> 7. Flusso Tecnica Tenore e registrazione di adesione per l&#39;analisi <ol><li> Profumato strato endoteliale con tampone di lavaggio per 2 minuti per iniziare withdrawal della pompa a siringa per rimuovere eventuali detriti o anticorpo non legato blocco e quindi passare la valvola per permettere un 5 min bolo di soluzione di leucociti in un costante sforzi di taglio di 0,05 Pa. </li><li> Durante gli ultimi 2 min del bolo leucocitaria, registrare 10 campi casuali lungo la lunghezza del MicroSlide. Ciò consente l&#39;analisi offline di linfociti rotolamento / tethering sul monostrato endoteliale. Registrare ogni campo per circa 10 secondi prima di passare alla successiva e garantire che le registrazioni vengono effettuate contro la direzione del flusso per evitare di registrare la stessa cella di laminazione due volte in rapida successione. </li><li> Seguire la bolo leucociti con un 5 min bolo di tampone di lavaggio restituendo la valvola nella sua posizione iniziale. Nella finale 2 min di questa bolo effettuare una seconda fase di registrazione scegliendo almeno 10 campi scelti a caso lungo la lunghezza del MicroSlide. Registrare ogni campo per circa 5 secondi prima di passare alla successiva e assicurarsi che il monostrato endoteliale e leucoc aderentiytes sono in chiaro focus. Questo consente l&#39;analisi offline del pattern di aderenza. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti

La fase più critica per eseguire con successo un saggio di flusso è garantire che un monostrato sano e confluenti di cellule endoteliali è pronto prima del test di adesione flusso. Cellule endoteliali primarie possono essere difficili da cultura e sensibile alle alterazioni nei metodi di coltura. E &#39;importante che 1) camere di flusso vengono adeguatamente e uniformemente rivestite con cellule endoteliali in un monostrato, per HSEC usiamo ratto tipo coda collagene I ma può variare per altre popolazioni endoteliali, 2) terreno di coltura appropriato per il tipo di cellula, per HSEC abbiamo descritto il terreno completo nella sezione del protocollo. Altri passi fondamentali sono l&#39;impostazione della pompa a siringa al tasso appropriato per riflettere i livelli fisiologici di shear stress. Durante il saggio di flusso è necessario evitare bolle d&#39;aria all&#39;interno del circuito di flusso che possono danneggiare il monostrato endoteliale o nastri cellule immuni dalla superficie endoteliale. Ciò può essere evitato ensuring che tutti i tubi silicone e adattatori sono perfusi con tampone di lavaggio prima della connessione, che tutte le bolle d&#39;aria vengono rimosse e che i media sono preriscaldata prima dell&#39;uso. Nel collegare gli adattatori per porte sul MicroSlide è molto importante che vi è una interfaccia liquido / liquido durante la connessione, se c&#39;è aria allora questo formerà uno spazio d&#39;aria all&#39;interno del sistema che interromperà il monostrato endoteliale durante il ritiro siringa passo. La soluzione leucociti nel cilindro della siringa deve agitazione regolare per assicurare che le cellule non si depositano, mantenendo così una densità cellulare costante durante l&#39;esperimento. Durante le fasi di registrazione è importante garantire l&#39;immagine dello strato endoteliale è sufficientemente concentrata e chiaro che permette l&#39;analisi offline accurata, e che durante la seconda fase del saggio flusso (post leucociti bolo) che viene lasciato un tempo sufficiente durante il tampone di lavaggio fase di prima registrazione viene ricominciato a garantire chetutti i leucociti non aderenti sono state rimosse. Analogamente, è indispensabile utilizzare cellule endoteliali in un monostrato di densità appropriata per prevenire la perdita di cellule che possono interferire con modelli di flusso nei capillari stretti e può anche essere difficile discriminare da grandi leucociti aderenti al microscopio a contrasto di fase. Abbiamo descritto ottimale densità di semina per le cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane, ma puo &#39;variare tra le diverse popolazioni endoteliali e specie. Notevoli progressi sono stati compiuti nello studio leucociti assunzioni in modelli animali con la microscopia intravitale. Il principale vantaggio del metodo saggi di adesione flusso è che il reclutamento dei leucociti può essere studiata in un sistema binario con cellule endoteliali umane primarie. Inoltre, queste interazioni possono essere studiati sotto i livelli fisiologici rilevanti di shear stress. E &#39;importante per confermare i risultati di studi intravitale negli animali con sistemi cellulari umani in quanto vi possono essere differences nelle proprietà endoteliali tra le specie. Una delle limitazioni del flusso saggio è che il reclutamento dei leucociti viene studiato in un ambiente unicellulare del monostrato endoteliale. Inoltre una volta che i leucociti hanno aderito e trasmigrata attraverso l&#39;endotelio non possono essere presenti in numero sufficiente per essere isolati e sottoposti a processi a valle. Nonostante questi limiti, una volta che il test di adesione flusso è stato masterizzato può essere sviluppato effettuare ulteriori analisi della cascata adesione leucocitaria e adattato ricapitolare un ambiente multicellulare. Registrazione prolungata di singoli campi e l&#39;uso di software di monitoraggio può essere utilizzato per analizzare strisciando comportamento dei leucociti. Inoltre al termine del dosaggio flusso i microslides possono essere interrogati utilizzando microscopia confocale a scansione laser e l&#39;etichettatura immunofluorescenza studiare adesione e trasmigrazione in maggior dettaglio. Inoltre, abbiamo precedentemente sviluppareEd un modello in vitro dove leucociti scorre potrebbero interagire con endotelio epatica condizionato dalla presenza di epatociti. Questo test può anche essere sviluppato per studiare sottopopolazioni di leucociti: il nostro gruppo ha condotto studi con sottoinsiemi come le cellule T regolatorie, cellule B e fegato infiltrante leucociti. Questi studi sono la prova che il saggio di adesione flusso è un potente strumento per studiare il reclutamento generale e organo leucociti specifico in sistemi umani.

E &#39;ormai accertato che il reclutamento dei leucociti, in generale, segue il paradigma della cascata adesione multistep 1. Ciò comporta la cattura di leucociti dal sangue che scorre dalle cellule endoteliali che rivestono la parete del vaso. Inizialmente, leucociti subiscono una fase di laminazione che è mediata da recettori selectina o membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Questo permette recettori accoppiati alle proteine ​​G (GPCR) espressi sulla superficie dei leucociti essere attivata da chemochine presentate sul glicocalice endoteliale. Questo porta all&#39;alterazione della conferma integrina ad uno stato &#39;alta affinità&#39; sulla superficie dei leucociti e arrestare e ferma adesione all&#39;endotelio. Ferma adesione è seguito da cambiamento di forma e scansione della leucocitaria sulla nave. Il passo finale è trasmigrazione attraverso il monostrato endoteliale, che può avvenire tramite paracellulare o transcellulare aeree. Mentre la cascata adesione multistep descriveres il meccanismo generale di leucociti assunzioni all&#39;interno del corpo ci sono differenze specifiche organo. Nel fegato la maggior parte dei leucociti assunzione avviene entro i sinusoidi epatici a differenza di altri organi dove il reclutamento avviene generalmente all&#39;interno delle venule post-capillari 2. Le sinusoidi epatici sono un ambiente a basso taglio e leucociti sottoposte ad un breve passo tethering prima di consolidare l&#39;adesione che è selectina indipendenti 2. Questi canali sono rivestite da endotelio sinusoidale epatica che è discontinuo e contiene Fenestrae, pori aperti 100-200 nm di diametro, e mancano di una membrana basale 3. Chiarire i meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti attraverso l&#39;endotelio sinusoidale epatico umano potrebbe identificare organo specifici bersagli terapeutici per le malattie del fegato infiammatorie. Saggi di adesione di flusso sono strumenti essenziali nello studio leucocitaria assunzioni. Essi consentono la ricostruzione di leucociti recruitment in presenza di shear stress per analizzare l&#39;adesione in forze ben definite. L&#39;uso più frequente per il saggio è lo studio dei leucociti adesione a monostrati endoteliali o substrati purificati. Camere di flusso commercialmente disponibili sono utilizzati per perfusione cellule in condizioni di flusso laminare tra due superfici piane e poi visualizzare il processo dinamico di adesione su un microscopio 4. Gruppi precedenti hanno dimostrato che alcune interazioni adesive avvengono solo sotto il flusso e non possono essere studiata in saggi statici 5,6. Abbiamo utilizzato questa tecnica per ricapitolare i sinusoidi epatici e studiare il reclutamento dei leucociti in condizioni di bassa tensione di taglio. Primario HSEC umano sono coltivate in microslides e leucociti può essere perfuso su questo monostrato ad una velocità di portata calcolata di riprodurre lo sforzo di taglio entro sinusoidi epatici. Lo sforzo di taglio è una sollecitazione che viene applicata parallela o tangente ad una superficie come opposed a sforzo normale, che è perpendicolare. Qualsiasi fluido che si muove lungo un confine eserciterà una sollecitazione di taglio su quel confine. Shear stress ha dimostrato di essere una componente essenziale di linfociti trasmigrazione 7. In queste condizioni ogni passo della cascata adesione può essere visualizzato mediante microscopia a contrasto di fase. Questo metodo ha permesso importanti conoscenze sulla reclutamento di leucociti all&#39;interno del fegato compreso lo studio di molecole di adesione convenzionali 8, il ruolo delle chemochine e recettori per chemochine 9-11, e molecole di adesione atipici quali l&#39;adesione vascolare proteina-1 (VAP-1 ) 8,12 e linfatica e vascolare endoteliale comune recettore-1 (CLEVER-1) 13. Anche questo test è stato citato in diverse pubblicazioni del nostro gruppo, la sua descrizione è stata breve e ci hanno colto questa opportunità per fornire una dettagliata passo passo guida per aiutare nella risoluzione dei problemi e prevenire errori tecnici durante il tentativozione del test. Inoltre, abbiamo recentemente cambiato il reperimento delle camere MicroSlide che permette alterazioni accurati shear stress. Crediamo che questo allarga l&#39;applicabilità del test ad altre cellule endoteliali e immunitarie. Il seguente metodo descrive la preparazione e la tecnica per la realizzazione di un saggio di adesione flusso based con cellule endoteliali sinusoidali epatiche umane e linfociti del sangue periferico.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

Leucocyte infiltrazione nel tessuto epatico umano è un processo comune a tutte le malattie epatiche infiammatorie adulti. Infiltrazione cronica può guidare lo sviluppo di fibrosi e la progressione a cirrosi. La comprensione dei meccanismi molecolari che mediano il reclutamento dei leucociti al fegato ha potuto identificare importanti bersagli terapeutici per le malattie del fegato. L&#39;interazione tasto durante leucociti reclutamento è quella delle cellule infiammatorie con endotelio in condizioni di sforzo di taglio. Assunzioni al fegato si verifica entro le basse canali taglio delle sinusoidi epatici che sono allineati dalle cellule epatiche endoteliali sinusoidali (HSEC). Le condizioni all&#39;interno dei sinusoidi epatici possono essere riepilogati mediante perfusione leucociti attraverso i canali fiancheggiati da monostrati HSEC umani a portate specifiche. In queste condizioni leucociti sottoposte ad un breve passo tethering seguita da attivazione e adesione stabile, seguita da una fase di scansione e successiva trasmigrazione di tutti i endotelialestrato. Utilizzando la microscopia a contrasto di fase, ogni passo di questa &#39;cascata adesione&#39; può essere visualizzato e registrato seguita da analisi offline. Cellule endoteliali o leucociti possono essere pretrattate con inibitori per determinare il ruolo di molecole specifiche durante questo processo.

Questa analisi ha la capacità di visualizzare il multistep cascata adesione flusso e chiarire i meccanismi molecolari alla base confrontando i risultati di esperimenti di controllo a quelli con inibitori molecolari. I vari letti vascolari possono essere riepilogati incorporando cellule endoteliali specifiche e alterando le condizioni di stress di taglio. Ogni passo della cascata di adesione può essere analizzato non in linea seguendo il metodo di registrazione descritto nel protocollo. Il primo passo della cascata adesione è il rotolamento dei leucociti che possono essere espresse come percentuale di cellule aderenti totali. Analisi offline consente al numero di cellule aderenti da enumerare in ogni campo registrato durante il bolo leucocitaria. La riproduzione delle immagini permette il confronto delle cellule che sono saldamente aderenti e quelli che stanno subendo un moto di rollio attraverso l&#39;endotelio. Rollio può essere visualizzato utilizzando questa tecnica, ogni campo viene registrata per almeno 10 sec. Cellule rotolamento sono identificati dal loro velocità ridotta sulla superficie endoteliale rispetto a fluire cellule. Questo comportamento deve essere dimostrata per almeno 5 secondi, senza distacco. La cascata di adesione entro i sinusoidi epatici si svolge in un ambiente a basso taglio e studi in vivo hanno confermato di rotolamento minimo con solo un breve passo tethering. Abbiamo confermato che il saggio flusso riflette l&#39;ambiente dei sinusoidi epatici dimostrando che meno del 10% di leucociti aderenti persistentemente rotolare stimolato HSEC in questi saggi. Il passo successivo della cascata adesione è ferma adesione. Aderenza totale può essere calcolato dalla seconda fase di registrazione durante il bolo tampone di lavaggio (passo 7.3). Analisi offline consente al numero totale di cellule saldamente aderenti da contare in ogni campo (Figura 5). Cellule saldamente aderenti sono definiti come cellule che sono fermi o shapechanged con un comportamento scansione lenta.Il numero medio di cellule per campo può quindi essere calcolato. Questo dato può essere utilizzato, in combinazione con la superficie totale del campo visivo (determinata secondo un reticolo o equivalente), concentrazione di linfociti (tipicamente 1 x 10 6 cellule / ml) e la portata per esprimere la misura di linfociti aderenza come cellule aderenti / mm 2/10 6 cellule perfuso. Studiando il modello di adesione prevede l&#39;analisi degli ultimi due gradini della cascata di adesione compresa la forma-cambiamento, strisciando e migrazione transendoteliale. Leucociti aderenti alla superficie superiore del monostrato HSEC appaiono fase-luminoso mentre quelli che sono migrati attraverso il monostrato appare fase di buio (Figura 6). Le cellule possono quindi essere classificati come espositrici adesione &#39;statica&#39; (nonmigrated / anno), &#39;forma-cambiato&#39; morfologia o come &#39;migrato&#39; e le singole categorie sono poi espressi come percentuale delpopolazione totale adesivo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figura 1. Monostrato di cellule endoteliali epatiche primarie umane sinusoidali all&#39;interno della camera di flusso. A) Microslides riempito con supporti contenenti monostrato di cellule endoteliali prima dell&#39;inizio del flusso adesione saggio. B) fase di contrasto immagine confluenti monostrato endoteliale, cellule endoteliali dovrebbero essere seminate in MicroSlide che sono stati prerivestita (per le cellule endoteliali epatiche umane può essere eseguito un Tipo di coda di topo collagene 1) ed è essenziale che le cellule endoteliali sono sani di cultura e confluenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Fluire camera di dosaggio. Una camera di dosaggio flusso set-up può essere visto qui, si compone di una camera trasparente che è montato su un microscopio invertito. Un riscaldatore è posta nella camera e deve essere controllata termostaticamente per mantenere una temperatura di 37 ° C. Dovrebbe esserci porte disponibili per collegare tubi in silicone da un MicroSlide all&#39;interno della camera ad una pompa a siringa che si trova all&#39;esterno. Il MicroSlide viene posizionato direttamente sul palco microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figura 3. Pompa a siringa. Una pompa a siringa è collegataEd tramite tubi in silicone alla camera di flusso. La pompa è impostata su un tasso di ritiro specifico a seconda della sollecitazione di taglio desiderata necessaria per il test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figura 4. Valvola di collegamento a fluire da camera. A) Una valvola a solenoide elettronico permette la commutazione tra due siringhe contenenti sia cellule o supporti praticamente senza spazio morto. B) Una volta che la valvola è arrossato e le due canne sono istituiti, il tubo di silicone dalla valvola è collegato alla camera di flusso. E &#39;fondamentale che quando si collega l&#39;adattatore sul tubo in silicone alla porta della camera di flusso vi è una interfaccia liquido / liquido. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figura 5. Misurazione del totale adesione leucocitaria. Durante gli ultimi due minuti del bolo fase di tampone di lavaggio (come delineato nel protocollo), un minimo di dieci campi aleatori deve essere registrata. Questi possono essere analizzati off-line e il numero totale di cellule saldamente aderenti si contano in ogni campo. Totale adesione dei leucociti può essere paragonato tra le camere di controllo e quelli pretrattati con anticorpi bloccanti, qui vi mostriamo un campo rappresentante di un vetrino di controllo e uno scivolo pretrattato con adesione intracellulare molecule-1 (ICAM-1) anticorpo bloccante. Le frecce sono state aggiunte per evidenziare i leucociti aderenti, nella rappresentazionetiva campo dal vetrino di controllo vi sono un totale di 25 leucociti identificati e nel ICAM-1 pattino ci sono un totale di 13 leucociti identificati. Barre di scala = 100 micron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figura 6. Analisi del modello di adesione leucocitaria su monostrati endoteliali mediante microscopia a contrasto di fase. Analisi offline campi registrati può anche essere usato per studiare la direzione e la velocità di adesione leucocitaria. Passaggi specifici della cascata di adesione possono essere visualizzati e quantificati con l&#39;imaging a contrasto di fase. Fase cellule brillanti che sono saldamente aderenti ma non attivato può essere definito l&#39;adesione &#39;round&#39;, le cellule che sono activated e la fase luminosa può essere definito &#39;cambiato forma&#39; e le cellule che sono fase oscura sono le cellule che hanno subito migrazioni transendoteliale e possono essere chiamati &#39;migrazione&#39;. L&#39;immagine mostra esempi di ogni modello di adesione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucociti assunzioni al fegato avviene nei canali specializzati delle sinusoidi epatici che sono rivestite da cellule endoteliali sinusoidali epatiche uniche. Fase microscopio a contrasto di reclutamento dei leucociti attraverso l&#39;endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di shear stress fisiologico può facilitare la delucidazione dei meccanismi molecolari che sono alla base di questo processo.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  University of Birmingham.  Leucociti assunzioni al fegato avviene nei canali specializzati delle sinusoidi epatici che sono rivestite da cellule endoteliali sinusoidali epatiche uniche. Fase microscopio a contrasto di reclutamento dei leucociti attraverso l'endotelio sinusoidale epatico umano in condizioni di shear stress fisiologico può facilitare la delucidazione dei meccanismi molecolari che sono alla base di questo processo. 

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Imaging adesione dei leucociti all&#39;endotelio vascolare ad alta pressione intraluminale

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...