Gli autori desiderano ringraziare Emilie Mairey e Emmanuel Donnadieu per il primo insediamento della procedura.

1. Della cellula ospite umano e coltura batterica <ol><li> HUVECs cultura passaggio tra 1 e 9 a 37 ° in un incubatore umidificato con il 5% (v / v) di CO 2. Passaggio delle cellule quando si avvicinano l&#39;80% confluenza con tripsina / EDTA per fornire culture manutenzione su 75 cm 2 fiaschi cultura e delle culture sperimentali in camere a flusso monouso (μ-Slides VI). </li><li> Ritirare media dai contenitori da diversi passaggi, lavare le cellule con 10 ml di PBS, ritirare e sostituirlo con 1,5 ml di tripsina / EDTA. Permettono alle cellule di staccare in una coltura cellulare incubatore per 5 minuti a 37 ° C. </li><li> Raccogliere le cellule con 10 ml di mezzo di coltura cellulare in una provetta da 15 ml di raccolta. Agglomerare le cellule con una centrifugazione 5 minuti (a 200 g), a temperatura ambiente. Sospendere le cellule in 4 ml di Endo-SFM supplementato con 10% (v / v) di FBS e contare su una camera di Malassez, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Introdurre 30 ml di uno 1x10 6 cellule HUVEC per ml di sospensione nel canale (3x10 4 in totale) e permettono alle cellule di aderire per 3 ore a 37 ° in un incubatore umidificato con un&#39;atmosfera del 5% (v / v) di CO 2. Aggiungere un volume aggiuntivo di 120 ml di Endo-SFM a riempire i pozzi. Le cellule dovrebbero formare un monostrato subconfluent (Figura 2). </li><li> Crescere N. meningitidis che esprimono GFP (in questo caso ceppo 8013 GFP che esprimono sotto il controllo di un IPTG-inducibile promotore), su piastre di agar GCB contenente Kellogg integratori e 5 mg / ml di cloramfenicolo a 37 ° C in atmosfera umida contenente il 5% (v / v) di CO 2 per 16 ore. </li></ol> 2. Adesione iniziale di batteri individuali di ospitare le cellule <ol><li> Regolare la concentrazione di batteri coltivati ​​su piastre di agar GCB ad un OD600 di 0,05 con pre-riscaldato Endo-SFM contenente il 10% (v / v) di FBS e incubare per 120 minuti a 37 ° C in atmosfera umida contenente il 5% (v / v) di CO 2, in agitando delicatamente (130 giri). Indurre l&#39;espressione GFP con l&#39;aggiunta di 1 mM IPTG nel terreno di coltura per l&#39;intero periodo di incubazione. </li><li> Posizionare la usa e getta μ-Slide sul palcoscenico di un microscopio invertito dotato di una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura del campione a 37 ° C. </li><li> Versare preriscaldata Endo-SFM integrato con il 2% (v / v) FBS in un bicchiere di vetro sterile e riempire una siringa sterile da 50 ml con questo mezzo. Collegare il tubo &quot;voce&quot; alla siringa e riempire con l&#39;introduzione di mezzo. </li><li> Collegare il tubo &quot;voce&quot; al μ-Slide, con cura, al fine di evitare l&#39;introduzione di aria nella camera. Poi, apporre il tubo &quot;uscita&quot; verso l&#39;altra estremità e compilare accuratamente il canale con medie di circa 1 cm di distanza dalla &quot;uscita&quot; da camera. </li><li> Misurare la OD600 batterica e regolare a 0,15 in Endo-SFM contenente il 2% (v / v) di FBS. Per guardare i batteri individuale qualsiasi aggregati deve essere interrotto da vortex vigorosa del campione batterica. </li><li> Posto 100 l di Endo-SFM integrato con il 2% (v / v) FBS medio nel serbatoio e aggiungere 100 microlitri della soluzione batterica presa dalla cima della soluzione in agitazione per evitare di campionamento ogni aggregati rimanenti batterica. </li><li> Con attenzione introdurre il volume di 200 microlitri nel μ-Slide girando il rubinetto per iniettare i batteri nella camera. </li><li> Introdurre Endo-SFM contenente il 2% (v / v) di FBS, mantenuto a 37 ° C con la piattaforma riscaldata, nella camera usando una pompa a siringa con un sforzo di taglio compatibile con l&#39;adesione del 0,044 dyne / cm 2 per 15 minuti. </li></ol> Vedere il video per 1 o esempio la figura 3. Dopo questo passaggio, spostare le sezioni 3, 4 o 6. 3. Quantificazione di adesione iniziale di batteri individuali per le cellule ospiti <ol><li> Dopo l&#39;adesione iniziale per 15 minuti, acquisire immagini di dieci campi in modo casuale mentre il liquido è ancora in circolazione. </li><li> Analizzare le immagini acquisite utilizzando il software ImageJ 8, al fine di accedere al numero medio di batteri adherant per campo. Questo avviene nel seguente modo: prima di tutto, ogni immagine è thresholded utilizzando la finestra &quot;Soglia&quot; che si trova nel menu &quot;Immagine&quot; per evidenziare i singoli batteri aderiscono fluorescenti, riducendo al minimo lo sfondo dalle cellule. Poi, ogni singolo batterio viene conteggiato, utilizzando il plug-in &quot;Counter Cell&quot; ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html">http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html</a> ). I dati per ogni immagine sono riportate in un foglio di calcolo Excel e viene calcolata la media di quantificare il numero medio di batteri aderenti per campo. </li></ol> 4. Misurare la resistenza al flusso dei batteri singoli aderenti a cellule ospiti <ol><li> Programmare il siringa pompa set-up per generare sollecitazioni di taglio che vanno dal 3-100 dyne / cm 2 per 5 minuti. </li><li> Al termine dei 5 minuti, acquisire dieci campi scelti a caso come descritto al punto 3.1, ma con il flusso interrotto prIOR per l&#39;acquisizione. </li><li> Analizzare le immagini acquisite come descritto al punto 3.2 e quantificare il numero medio di batteri rimasti per campo. </li></ol> 5. Misurare la crescita di un batterio isolato aderente ad un microcolony <ol><li> Introdurre Endo-SFM contenente il 10% (v / v) di FBS, mantenuto a 37 ° C con la piattaforma riscaldata, nella camera usando una pompa a siringa con lo stress di taglio scelto per diverse ore. Registrare le immagini in tempo reale la microscopia video un fotogramma ogni 5 minuti. </li><li> A seguito di microscopia video, fermare la sollecitazione di taglio, spegnendo la pompa a siringa, acquisire 2-3 immagini aggiuntive e quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software. Un esempio di proliferazione batterica può essere visto sul video 2. </li></ol> 6. Misurare la resistenza al flusso di aderenti microcolonie batterica <ol><li> Dopo la formazione di grandi microcolonie sulla superficie cellulare (step5.2) 2-3 acquisire immagini di entrambe le cellule (per contrasto di fase) e batteri (da GFP-fluorescenza) prima dell&#39;applicazione di flusso. Per il resto dell&#39;esperimento, il protocollo di acquisizione monitorare solo la fluorescenza. </li><li> L&#39;applicazione di elevate sollecitazioni di taglio per 5 minuti (300-100 dyne / cm 2) e registrare le immagini ad un frame ogni 5 secondi. </li><li> Interrompere la tensione di taglio, spegnendo la pompa a siringa, acquisire 2-3 immagini aggiuntive e quindi interrompere la sequenza di acquisizione delle immagini sul software. </li><li> Quindi, rimuovere il tubo di &quot;uscita&quot; prima e con attenzione, per evitare lo svuotamento del canale e quindi aggiungere preriscaldato mezzo fresco di riempire i pozzi prima di rimuovere il tubo &quot;voce&quot;. </li><li> Per determinare quantitativamente l&#39;effetto della sollecitazione di taglio sulla resistenza dei batteri, un saggio di placcatura può essere eseguita come segue: raccogliere i media residua e lavare la μ-Slide due volte con 120 ml di PBS, che rimuove il medium rimanenti dal canale (entrambi i lavaggi sono ) anche raccolti. </li><li> Staccare le cellule infettate con l&#39;aggiunta di 50 ml di tripsina / EDTA per 5 minuti a 37 ° e mescolare il campione staccato con la sospensione raccolti nel passaggio precedente. </li><li> Effettuare diluizioni seriali in PBS e piastra a 10 microlitri frazione su piastre di agar GCB, in triplice copia, al fine di determinare il numero di unità formanti colonia (CFU) il giorno seguente, dopo incubazione delle piastre a 37 ° C in un incubatore con 5% (v / v) di CO 2. </li></ol> Video 3 e 4 confrontare il ceppo wild type con il mutante pilV. 7. Distacco batterica microcolonie <ol><li> Infettare le cellule nella camera di flusso ripetendo i punti da 2.1 a 2.8 e permettere l&#39;infezione procede per 30 minuti. </li><li> Rimuovere i batteri non legato aumentando il flusso a 10 dyne / cm 2 per un periodo di 2 minuti e lasciare infezione proseguire per 2 ore. </li><li> Ridurre il flusso a 0,15 dyne / cm 2. </li><li> Ogni ora, raccogliere una goccia di media uscendo dalla camera di flusso. </li><li> Effettuare diluizioni seriali dei campioni e la piastra di loro su piastre di agar GCB. </li><li> Determinare il numero di unità formanti colonia (CFU) il giorno seguente, dopo incubazione delle piastre a 37 ° C in un incubatore con il 5% (v / v) di CO 2. </li></ol> 8. Rappresentante risultati <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig1.jpg" /> Figura 1: fasi differenti di un monostrato cellulare che può essere osservato e misurato in presenza di flusso della procedura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig2.jpg" /> Figura 2: monostrato di cellule endoteliali nella camera di flusso all&#39;inizio di un esperimento (assenza di sforzo di taglio). Circa 50 le cellule endoteliali sono organizzati in una sub-confluenti monostrato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3241/3241fig3.jpg" /> Figura 3: Rappresentazione grafica di adesione iniziale dei batteri sulla superficie cellulare. Valori per i tre campi sono indicati per dare un&#39;idea del campo a campo di variazione che si prevede (0044 dyne / cm 2). Video 1. Visualizzazione di adesione iniziale di batteri sulla monostrato cellulare in funzione del tempo (0044 dyne / cm 2). GFP-esprimere i batteri stanno seguendo la direzione del flusso del fluido. Il film è accelerato 60 volte, la durata reale del video è di 10 minuti. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video1.mov">Clicca qui per vedere il video.</a> Video 2. Dopo i batteri adesione iniziale è stato permesso di proliferare sulla superficie cellulare, per un periodo di 7 ore (accelerato 1000-fold). <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video2.mov">Clicca qui per vedere il video.</a> Video 3. Dopo proliferazione sulla superficie cellulare il meccanicoresistenza al di microcolonie è stato testato aumentando il livello di sollecitazione di taglio a 10 dyne / cm 2 per 5 minuti, ma microcolonie wild-type sono resistenti accelerato di 60 volte. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video3.mov">Clicca qui per vedere il video.</a> Microcolonie video 4. Formata dal mutante pilV sono interrotti da aumentare il flusso (10 dyne / cm 2). Questo mutante non riesce a indurre il rimodellamento della membrana plasmatica in microcolonie ed è quindi molto più sensibile alle sollecitazioni di taglio maggiore (il video è accelerato di 60 volte) 5. <a href="/files/ftp_upload/3241/3241video4.mov">Clicca qui per vedere il video.</a>

<ol>
	<li>Mairey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+microcirculation+shear+stress+levels+determine+Neisseria+meningitidis+attachment+sites+along+the+blood-brain+barrier.">Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier.</a> J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).</li><li>Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+of+Vascular+Beds.">Design Principles of Vascular Beds.</a> Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).</li><li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow.">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16, 31-42 (2009).</li><li>Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motion+of+cells+sedimenting+on+a+solid+surface+in+a+laminar+shear+flow.">Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow.</a> Biophys J. 61, 204-215 (1992).</li><li>Mikaty, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+bacterial+pathogen+induces+host+cell+surface+reorganization+to+resist+shear+stress.">Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress.</a> PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).</li><li>Chamot-Rooke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modification+of+pili+upon+cell+contact+triggers+N.+meningitidis+dissemination.">Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination.</a> Science. 331, 778-782 (2011).</li><li>Soyer, M., Dum&#237;nil, G., Christodoulides, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+under+shear+stress.">Bacterial adhesion under shear stress.</a> Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).</li><li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+adhesion+to+target+cells+enhanced+by+shear+force.">Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force.</a> Cell. 109, 913-923 (2002).</li><li>Tchesnokova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-enhanced+binding+of+intestinal+colonization+factor+antigen+I+of+enterotoxigenic+Escherichia+coli.">Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).</li><li>Konto-Ghiorghi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+role+for+pilus+in+adherence+to+epithelial+cells+and+biofilm+formation+in+Streptococcus+agalactiae.">Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae.</a> PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

L&#39;importanza della sollecitazione di taglio e, in generale degli aspetti meccanici in biologia è sempre più riconosciuto. Per esempio le proprietà altamente adattato adesivo della famiglia selectina di proteine ​​nel processo di adesione dei linfociti e rotolare sulla parete vascolare è stato riconosciuto con l&#39;introduzione di shear stress nel processo. La procedura sopra descritta è stata applicata al batteri Gram-negativi Neisseria meningitidis, ma dovrebbe essere applicabile a una vasta gamma di agenti patogeni. L&#39;importanza della sollecitazione di taglio è stato dimostrato anche per altri patogeni e altri siti di infezione. Adesione batterica condizionata da shear stress è stato descritto dallo studio del adesina FimH trovato su Escherichia coli uropatogeni (UPEC) 9. Simile a selectine, l&#39;interazione tra FimH e del suo recettore della cellula ospite ha dimostrato di essere rafforzata da forze meccaniche di taglio indotta 9 e il adesina CfaE di enterotossigena E.coli è stata segnalata anche a mediare l&#39;adesione a cellule epiteliali intestinali attraverso un taglio-dipendente meccanismo 10. Abbiamo segnalato, con il flusso laminare protocollo del saggio camera descritto in questo capitolo che Streptococcus agalactiae pili erano essenziali per il rispetto di questo patogeno alle cellule epiteliali in condizioni di flusso 11. Questi studi confermano che il nostro saggio camera di flusso è uno strumento utile per lo studio della cellula ospite-patogeno interazioni in condizioni di stress di taglio.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> μ-Slide VI 0,4 kit di flusso </td><td> IBIDI </td><td> 80606 </td></tr><tr><td> Plastipak siringa da 50 ml Luer-Lock </td><td> Becton Dickinson </td><td> 300865 </td></tr><tr><td> Tubo Tygon R3603 3,2 x 4,8 millimetri </td><td> Fisher-Scientifico </td><td> R3603 </td></tr><tr><td> Rubinetto a 3 vie, 2 luer femmina a maschio luer </td><td> Bio-Rad </td><td> 7328103 </td></tr><tr><td> Pompa siringa </td><td> Harvard Apparatus </td><td> PHD 2000 </td></tr><tr><td> Microscopio invertito, Nikon </td><td> Nikon </td><td> Eclipse T i </td></tr><tr><td> CCD </td><td> Hamamatsu </td><td> ORCA 285 CCD o ORCA 3-CCD </td></tr><tr><td> ImageJ software </td><td> NIH </td><td> Gratuito ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) </td></tr></tbody></table>

introducing shear stress in the study of bacterial adhesion

Durante le infezioni batteriche una sequenza di interazioni avvengono tra il patogeno e il suo ospite. Adesione batterica alla superficie della cellula ospite è spesso il primo passo e la determinazione della patogenesi. Anche se in via sperimentale l&#39;adesione è per lo più studiati in condizioni statiche adesione avviene concretamente in presenza di liquido che scorre. Primi incontri tra batteri e il loro ospite spesso si verificano a livello delle mucose, bocca, polmoni, intestino, occhio, ecc muco dove scorre lungo la superficie delle cellule epiteliali. Più tardi, nel infezione, agenti patogeni di tanto in tanto l&#39;accesso la circolazione del sangue che causano malattie letali come la setticemia, sepsi e meningite. Una caratteristica essenziale di queste infezioni è la capacità di questi patogeni di interagire con le cellule endoteliali in presenza di sangue circolante. La presenza di liquido che scorre, muco o di sangue, per esempio, determina l&#39;adesione perché genera una forza meccanica sul patogeno. Per caratterizzare l&#39;effetto di un liquido che scorre di solito si riferisce alla nozione di sforzo di taglio, che è la forza tangenziale per unità di superficie esercitata da un fluido in movimento vicino ad una parete fissa, espressa in dyne / cm 2. Intensità di sforzo di taglio variano ampiamente a seconda del tipo diversi vasi, le dimensioni, organo, posizione ecc (0-100 dyne / cm 2). Circolazione nei capillari può raggiungere valori molto bassi shear stress e anche interrompere temporaneamente durante i periodi che vanno da pochi secondi a diversi minuti 1. All&#39;altra estremità dello spettro di sollecitazione di taglio nelle arteriole può raggiungere i 100 dyne / cm 2 2. L&#39;impatto dello stress di taglio sui diversi processi biologici è stato chiaramente dimostrato come ad esempio durante l&#39;interazione dei leucociti con l&#39;endotelio 3. Per tenere conto di questo parametro meccanico nel processo di adesione batterica abbiamo approfittato di una procedura sperimentale basata sull&#39;utilizzo di un flusso monouso camera 4. Cellule ospiti sono coltivate in camera di flusso e batteri fluorescenti vengono introdotti nel flusso controllato da una pompa a siringa. Inizialmente abbiamo concentrato le nostre indagini sul patogeno batterico Neisseria meningitidis, un batterio Gram-negativo responsabile della setticemia e la meningite. La procedura descritta qui ci ha permesso di studiare l&#39;impatto dello stress di taglio sulla capacità dei batteri di: aderire alle cellule 1, a proliferare sulla superficie cellulare 5 e di staccare di colonizzare nuovi siti 6 (Figura 1). Complementare informazioni tecniche si trovano in riferimento 7. Valori di shear stress qui presentate sono state scelte in base alle nostre esperienze precedenti 1 e per rappresentare i valori trovati in letteratura. Il protocollo dovrebbe essere applicabile a una vasta gamma di agenti patogeni con aggiustamenti specifici a seconda degli obiettivi dello studio.

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

Durante il processo di infezione, un passo fondamentale è l&#39;adesione di patogeni con cellule ospiti. Nella maggior parte dei casi questo passo adesione avviene in presenza di sollecitazioni meccaniche generate dal flusso liquido. Descriviamo una tecnica che introduce sforzo di taglio come un parametro importante nello studio della adesione batterica.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K Views.  INSERM U970. Durante il processo di infezione, un passo fondamentale è l'adesione di patogeni con cellule ospiti. Nella maggior parte dei casi questo passo adesione avviene in presenza di sollecitazioni meccaniche generate dal flusso liquido. Descriviamo una tecnica che introduce sforzo di taglio come un parametro importante nello studio della adesione batterica.

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In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Metodi Per inibire batterica Pyomelanin produzione e determinare il corrispondente aumento di sensibilità allo stress ossidativo

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...

Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of infected cells, including organelle ultrastructure, cytoskeletal network organization, as well as cellular processes such as Stress Granule (SG) formation. The characterization of how pathogens subvert host processes is an important and integral part of the field of pathogenesis. While variable phenotypes may be readily visible, the precise analysis of the qualitative and quantitative differences in the cellular structures induced by pathogen challenge is essential for defining statistically significant differences between experimental and control samples. SG formation is an evolutionarily conserved stress response that leads to antiviral responses and has long been investigated using viral infections1. SG formation also affects signaling cascades and may have other still unknown consequences2. The characterization of this stress response to pathogens other than viruses, such as bacterial pathogens, is currently an emerging area of research3. For now, quantitative and qualitative analysis of SG formation is not yet routinely used, even in the viral systems. Here we describe a simple method for inducing and characterizing SG formation in uninfected cells and in cells infected with a cytosolic bacterial pathogen, which affects the formation of SGs in response to various exogenous stresses. Analysis of SG formation and composition is achieved by using a number of different SG markers and the spot detector plug-in of ICY, an open source image analysis tool.

We describe a method for the qualitative and quantitative analysis of stress granule formation in mammalian cells after the cells are challenged with bacteria and a number of different stresses. This protocol can be applied to investigate the cellular stress granule response in a wide range of host-bacterial interactions.

Analisi dell&#39;immunofluorescenza della formazione di granuli di stress dopo la sfida batterica delle cellule dei mammiferi

Fluorescent imaging of cellular components is an effective tool to investigate host-pathogen interactions. Pathogens can affect many different features of ...