Questo lavoro è stato finanziato in parte dal programma T32 del National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) (T32 GM133369) e dalla National Science Foundation (NSF 1454230). Inoltre, vengono riconosciute le strutture di ricerca condivise della WVU e l'assistenza e il supporto di biofisica applicata.

1. Sintesi di ZIF-8
<ol><li>Ai fini di questo esempio, utilizzare un rapporto di massa 1:10:100 (metallo:linker:solvente) per sintetizzare lo ZIF-8. Per questo, misurare il nitrato di zinco esaidrato e registrare la misurazione. Utilizzare il rapporto di massa di esempio per calcolare la quantità necessaria per il linker, il 2-metilimidazolo e il solvente (cioè il metanolo).</li>
	<li>Mettere l'esaidrato di nitrato di zinco e il linker in due diverse fiale di vetro. Aggiungere metà della quantità calcolata di metanolo al nitrato di zinco esaidrato e l'altra metà al linker. Lasciare che ogni soluzione si sciolga.</li>
	<li>Combinare le due soluzioni (ad esempio, soluzioni contenenti rispettivamente il metallo e il linker). Posizionare il contenitore con la soluzione combinata per la reazione su una piastra di agitazione e agitare a 700 giri/min per 24 ore a temperatura ambiente (RT).</li>
</ol>2. Collezione ZIF-8
<ol><li>Una volta conclusa la reazione di cui sopra (cioè dopo 24 ore), mettere la soluzione in provette da centrifuga da 50 mL e centrifugare a 3.075 x g per 5 minuti (utilizzare quantità uguali e bilanciare il rotore). Rimuovere i surnatanti dalle provette centrifugate.</li>
	<li>Aggiungere metanolo (5-15 ml) alle provette da centrifuga e ridisperdere le particelle.</li>
	<li>Ripetere le fasi di centrifugazione e lavaggio almeno altre due o quattro volte. Dopo l'ultimo lavaggio, scaricare il surnatante. NOTA: Le fasi di lavaggio rimuovono tutte le specie non precipitate.</li>
	<li>Rimuovere i coperchi dei tubi e posizionare sopra il nastro parafilm; Successivamente, fai dei buchi nel parafilm. Porre la/e provetta/e contenente il campione in una camera a vuoto a RT ad asciugare per 24 ore.</li>
</ol>3. Morfologia superficiale ZIF-8 (microscopia elettronica a scansione [SEM])
<ol><li>Montare le polveri secche di ZIF-8 su nastro di carbonio e farfugliare per 120 s con oro-palladio per evitare qualsiasi carica che potrebbe verificarsi durante l'analisi SEM.</li>
	<li>Impostare la tensione di accelerazione del microscopio a 15 kV. Mettere a fuoco le particelle e regolare l'ingrandimento (sono stati utilizzati ingrandimenti di 500x, 1.000x, 1.500x, 4.000x, 10.000x, 20.000x, 30.000x e 40.000x).</li>
	<li>Visualizzare le particelle sotto l'ingrandimento che consente sia una chiara valutazione della dimensione delle particelle che della morfologia (si consiglia di considerare gli intervalli per particelle di 5 μm, 10 μm e 20 μm).</li>
	<li>Raccogli i dati da almeno tre diversi campi visivi e, per ciascuno, considera diversi ingrandimenti.</li>
</ol>4. Composizione elementare ZIF-8
<ol><li>Segui i passaggi per l'imaging SEM.</li>
	<li>Utilizzando l'unità di spettroscopia a raggi X a dispersione di energia (EDX) del microscopio SEM, analizzare la composizione elementare del campione.</li>
	<li>Assicurarsi che la tensione di accelerazione e l'ingrandimento SEM corrispondano al monitor EDX. Spegnere la telecamera a infrarossi sul microscopio SEM.</li>
	<li>Sul monitor EDX, vai su Collect Spectrum e inserisci un tempo di raccolta di 200 s. Questo è raccomandato per evitare la carica e la disintegrazione delle particelle che potrebbero portare a false valutazioni.</li>
	<li>Raccogli dati da almeno tre diversi campi visivi. Una volta terminata la raccolta, analizza i dati e identifica gli elementi di interesse.</li>
</ol>5. Colture cellulari
<ol><li>La coltura ha immortalato le cellule BEAS-2B in terreni integrati con il 5% di siero fetale bovino (FBS) e lo 0,2% di penicillina/streptomicina. NOTA: I passaggi compresi tra 5 e 10 devono essere utilizzati per garantire che non si siano verificati cambiamenti fenotipici nel lotto di cellule utilizzato37 (tutti i reagenti sono elencati nella tabella dei materiali).</li>
	<li>Prelevare una piastra di coltura cellulare da 100 mm e posizionare 10 mL di terreno sulla piastra. Aggiungere 1 mL della soluzione cellulare BEAS-2B alla piastra.</li>
	<li>Mettere la piastra in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2 ) e lasciare crescere le cellule.</li>
	<li>Controllare la piastra dopo 24 ore per determinare se le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza. In questo caso, la confluenza dell'80% si riferisce alla percentuale della superficie coperta da cellule aderenti. In caso contrario, cambiare il terreno e lasciare che le cellule crescano fino a raggiungere il livello di confluenza dell'80%.</li>
</ol>6. Conteggio delle cellule
<ol><li>Una volta che le cellule sulla piastra hanno raggiunto una confluenza dell'80%, rimuovere il terreno dalla piastra. Lavare la piastra con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).</li>
	<li>Rimuovere il PBS dalla piastra. Aggiungere 2 mL di tripsina alla piastra e metterla nell'incubatrice (37 °C, 5% CO 2 ) per2 min.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di terreno alla piastra e pipettare il terreno verso l'alto e verso il basso per rimuovere le cellule dalla piastra. Trasferire la soluzione in una provetta da 15 mL e centrifugare a 123 x g per 5 min.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante dalla provetta e aggiungere 2 mL di terreno. Pipettare il terreno su e giù per disperdere nuovamente le cellule.</li>
	<li>Utilizzando una provetta da 1,5 mL, aggiungere 20 μL di blu di tripano e poi 20 μL di soluzione cellulare (rapporto 1:1 di blu di tripano:soluzione cellulare).</li>
	<li>Posizionare 10 μL della miscela cellulare su un vetrino e posizionarlo su un contatore automatico di cellule. Attendi che lo schermo sia a fuoco, quindi seleziona Acquisisci.</li>
	<li>Lo schermo visualizza il numero di cellule vive e la vitalità delle cellule. L'intervallo di misurazione si estende da 1 x 10a 4-1 x 107 celle.</li>
	<li>In alternativa, contare le cellule manualmente utilizzando un emocitometro.<ol><li>A tale scopo, aggiungere 15-20 μL della soluzione cellulare trattata con tripano blu all'emocitometro.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio verticale con una messa a fuoco dell'obiettivo 10x sulle linee della griglia dell'emocitometro.</li>
		<li>Conta il numero di celle nei quattro quadrati esterni e dividi il numero per quattro. Quindi, moltiplica per 10.000 per ottenere il numero di cellule vive.</li>
		<li>Per calcolare la vitalità cellulare, sommare il conteggio delle cellule vive e morte per ottenere il conteggio totale delle cellule e successivamente dividere il conteggio delle cellule vive per il conteggio totale delle cellule.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Preparazione della dose di ZIF-8
<ol><li>Preparare una soluzione madre di ZIF-8 da 1 mg/mL. Per questo, misurare la quantità di ZIF-8 e aggiungere acqua deionizzata (DI) alle particelle per raggiungere una concentrazione di 1 mg/mL.</li>
	<li>Sonicare (impostare il sonicatore su sonics) la soluzione madre ZIF-8 per 2 minuti a intervalli di 30 s a bagnomaria.</li>
	<li>Effettuare diverse dosi di ZIF-8 per le esposizioni cellulari calcolando la quantità di soluzione madre e il mezzo modificato di aquila di Dulbecco (DMEM) necessari per raggiungere le dosi desiderate utilizzando l'equazione C 1V1 = C 2 V2. Le dosi variano da 0 a 950 μg/mL. NOTA: In questo esperimento, sono state selezionate dosi di 0 μg/mL, 1 μg/mL, 10 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 250 μg/mL, 500 μg/mL, 750 μg/mL e 950 μg/mL.</li>
</ol>8. Concentrazione inibitoria semimassima (IC 50)
<ol><li>Dopo il conteggio delle cellule, seminare le cellule BEAS-2B a una densità di 4 x 104 cellule/mL in una piastra da 96 pozzetti, con un volume di 100 μL/pozzetto.<ol><li>Per raggiungere una densità di 4 x 104 cellule/mL, utilizzare C 1 V1= C 2 V2per calcolare la quantità di soluzione cellulare da combinare con il terreno.</li>
		<li>Assicurarsi di mantenere i pozzetti vuoti per ogni dose; lasciare questi pozzetti vuoti fino all'esposizione a ZIF-8.</li>
	</ol></li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 e lasciare crescere le cellule fino a diventare un monostrato confluente per 24 ore.</li>
	<li>Rimuovere il terreno dai pozzetti ed esporre le cellule BEAS-2B a dosi di ZIF-8 comprese tra 0 e 950 μg/mL. Aggiungere 100 μL di ZIF-8 ai rispettivi pozzetti bianchi e cellulari.</li>
	<li>Riposizionare le piastre a 96 pozzetti nell'incubatore per un tempo di esposizione di 48 ore.</li>
	<li>Dopo l'esposizione, aggiungere 10 μL di 4-[3-(4-idofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disolfonato (WST-1) a ciascun pozzetto (bianco e pozzetto cellulare) e incubare per 2 ore. I media rimangono nei pozzi; Il rapporto è 1:10 (reagente:media).</li>
	<li>Leggere le variazioni dell'assorbanza su un lettore di piastre utilizzando un'assorbanza di 485 nm.</li>
	<li>Calcolare la vitalità della cella tramite il software per determinare il valore IC50 (vedere la sezione 10).</li>
</ol>9. Rilevamento dell'impedenza elettrica della cella-substrato (ECIS)
<ol><li>Utilizzare una piastra a 96 pozzetti (96W10idf) per eseguire l'analisi ECIS. La piastra28 contiene elettrodi di connessione a dito interdigitati che coprono un'area di circa 4 mm2.</li>
	<li>Innanzitutto, verificare che tutti i pozzetti vengano letti dai sensori. Per questo, posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla stazione del pozzetto e fare clic sul pulsante Setup .</li>
	<li>Se i pozzetti sono collegati correttamente, apparirà il verde; Tutti i pozzi non collegati saranno identificati come rossi. In tal caso, rimuovere e reinserire la piastra del pozzetto e fare nuovamente clic sul pulsante Setup , fino a quando tutti i pozzetti non offrono letture verdi praticabili.</li>
	<li>Stabilizzare gli elettrodi per 40 minuti con 200 μL di terreno per pozzetto per evitare la deriva del potenziale. Aggiungere 200 μL di terreno a ciascun pozzetto utilizzato, quindi posizionare la piastra a 96 pozzetti sulla stazione ECIS. Fare clic su Setup/Check (Imposta/Verifica) per assicurarsi che la piastra sia collegata correttamente. Fare clic su Stabilizza.</li>
	<li>Una volta completata la stabilizzazione, rimuovere la piastra dalla stazione e rimuovere il terreno da ciascun pozzetto.</li>
	<li>Seminare le cellule BEAS-2B a una densità di 4 x 104 cellule/mL, con un volume di 100 μL per pozzetto, nei pozzetti contenenti le cellule e posizionare la piastra sulla stazione ECIS nell'incubatore.</li>
	<li>Sul monitor, fare clic su Verifica per determinare che tutti gli elettrodi vengono letti dai sensori sulla stazione.</li>
	<li>Impostare la misurazione dell'andamento del tempo selezionando MFT (Multiple Freq/Time). Il programma misurerà ogni pozzetto a sette diverse frequenze.</li>
	<li>Fare clic su Start e lasciarlo funzionare per 24 ore in modo che le celle possano formare un monostrato confluente.</li>
	<li>Dopo 24 ore, i pozzetti contenenti le cellule mostreranno una maggiore resistenza sul monitor. Questo è un indicatore che le cellule si sono attaccate agli elettrodi.</li>
	<li>Premere Pausa sul monitor per interrompere la raccolta dei dati.</li>
	<li>Effettuare le dosi di ZIF-8 al di sopra e al di sotto del valore IC50 calcolato seguendo i passaggi descritti nella sezione 7 di cui sopra.</li>
	<li>Esporre le nanoparticelle ZIF-8 ai rispettivi pozzetti vuoti e cellulari a un volume di 100 μL per pozzetto e riposizionare la piastra a 96 pozzetti sulla stazione.</li>
	<li>Fare nuovamente clic su Controlla sul monitor per assicurarsi che i sensori leggano tutti gli elettrodi. Fare clic su Riprendi e consentire al sistema di funzionare per 72 ore per monitorare il comportamento cellulare e l'allegato.</li>
	<li>Una volta terminata la raccolta dei dati, fare clic su Fine sul monitor. Per salvare il file, fare clic su File > Salva con nome. Salvare i dati come file di foglio di calcolo.</li>
	<li>Per ottenere i parametri alfa, fare clic su Modello. Nella finestra pop-up dello schermo, fai clic su Contenitore solo media, quindi seleziona il contenitore che contiene solo contenuti multimediali.</li>
	<li>Fate clic su Imposta rif. Sul monitor, fare clic su Trova.</li>
	<li>Se il pozzetto mostrato nel sistema non è lo stesso di quello scelto, ripetere il passaggio 9.16.</li>
	<li>Fare clic su Imposta. Fare clic su Adatta intervallo T per determinare l'intervallo di tempo desiderato per la raccolta dei dati.</li>
	<li>Durante l'elaborazione, fare clic su Alpha. Quando il sistema termina l'analisi, fare clic su Salva RbA e salvarlo come file di foglio di calcolo. NOTA: Fare riferimento al manuale ECIS, disponibile sul sito Web del produttore38.</li>
</ol>10. Analisi dei dati
<ol><li>SEM<ol><li>Aprire il software di imaging per analizzare le immagini SEM. Fare clic su File > Apri, quindi selezionare l'immagine da analizzare.</li>
		<li>Fare clic su Immagine > Digitare > 8 bit per convertire l'immagine in scala di grigi per eseguire l'operazione di soglia.</li>
		<li>Calibrare la misurazione della distanza dei pixel in micron. Fare clic sullo strumento Linea retta e tracciare la lunghezza di ogni particella da misurare.</li>
		<li>Fare clic su Analizza e quindi su Imposta scala. La distanza nota verrà impostata sulla lunghezza della dimensione della barra della scala sull'immagine SEM. L'unità di lunghezza nota sarà impostata su micron. Selezionare Globale e premere Ok.</li>
		<li>Fare clic sullo strumento Linea retta e tracciare il diametro della particella, quindi selezionare Analizza e misura. Registrare il risultato della lunghezza.</li>
		<li>Ripetere l'operazione per tutte le immagini raccolte. Calcolare la media di tutti i diametri di almeno 60 particelle per un'adeguata valutazione statistica.</li>
	</ol></li>
	<li>EDX<ol><li>Calcola la media di tutte le percentuali di peso di ciascun elemento insieme da tutte le immagini raccolte (vedi la sezione EDX sopra).</li>
		<li>Utilizzando un foglio di calcolo, traccia un grafico a barre di ciascun elemento sull'asse x e la percentuale media del peso elementare sull'asse y.</li>
	</ol></li>
	<li>IC50<ol><li>Calcolare la media dei pozzetti vuoti e calcolare la media dei pozzetti di dose per ogni replica.</li>
		<li>Calcolare il bianco regolato sottraendo la media del bianco di controllo dalla media del bianco della dose. Calcolare il valore reale delle cellule per ciascuna dose sottraendo il bianco aggiustato dal valore medio della dose.</li>
		<li>Sottrarre il valore del bianco aggiustato per ciascuna dose dal valore medio di controllo. Calcolare la vitalità cellulare di ciascuna dose utilizzando l'equazione: vitalità cellulare = (valore reale della cellula/(valore di controllo - valore del bianco aggiustato)) x 100.</li>
		<li>Ripetere l'operazione per tutte le altre repliche.</li>
		<li>Calcolare la media della vitalità cellulare per ciascuna replica insieme per ottenere la vitalità cellulare finale per ciascuna dose.</li>
		<li>Nel software, scegli la scheda XY sullo schermo.</li>
		<li>Inserire i valori di concentrazione (dose) nella colonna X e la vitalità cellulare (%) di ciascuna dose nella colonna Y.</li>
		<li>Trasformare i valori X facendo clic su Analizza > Trasforma > Ok, quindi su Trasforma X = Log(X).</li>
		<li>Normalizzare i valori Y selezionando il foglio Dati trasformati , facendo clic su Analizza e quindi selezionando Normalizza.</li>
		<li>Selezionare il foglio dati Normalizza trasformazione , fare clic su Analizza e selezionare Regressione non lineare (adattamento curva). Selezionare Dose-Risposta-Inibizione e fare clic su Log(Inibitore) Vs. Pendenza variabile di risposta (quattro parametri). Fare clic su OK per visualizzare i risultati.</li>
	</ol></li>
	<li>ECIS<ol><li>Dal foglio di calcolo, prendi le colonne di resistenza (ohm) per ogni replica (pozzetti vuoti e pozzetti di dose) e calcola la media insieme dalla frequenza di 4.000 Hz. Questa frequenza consente la valutazione del contatto cellula-cellula38.</li>
		<li>Calcolare la resistenza corretta sottraendo la media del bianco dalla dose media per ogni replica. Calcolare la media della resistenza corretta per le repliche per ciascuna dose.</li>
		<li>Ripetere gli stessi passaggi per i valori alfa per calcolare il parametro alfa medio. Rappresentare graficamente l'asse x come tempo (h) e l'asse y come valori medi di resistenza/alfa per ciascun valore di dose.</li>
	</ol></li>
</ol>11. Analisi statistica
<ol><li>SEM<ol><li>Eseguire una deviazione standard nel file del foglio di calcolo in cui sono stati calcolati i diametri medi delle particelle ZIF-8.</li>
		<li>Utilizzando la funzione STDEV nel foglio di calcolo, evidenziare i dati delle 60 particelle e fare clic su Invio. Rappresentare graficamente la deviazione standard per ogni diametro medio calcolato.</li>
	</ol></li>
	<li>EDX<ol><li>Analogamente a SEM (passaggi 11.1.1-11.1.2), calcola la deviazione standard per ogni composizione elementare media utilizzando la funzione STDEV nel foglio di calcolo. Rappresentare graficamente le deviazioni standard per ogni composizione elementare media.</li>
	</ol></li>
	<li>IC50<ol><li>Aprire il software utilizzato per il calcolo dell'IC50 e fare clic su Scheda tecnica raggruppata.</li>
		<li>Inserire le dosi ZIF-8 nelle righe etichettate Gruppo A, Gruppo B, ecc. Inserire la vitalità cellulare media per ciascuna dose e replicarla nella colonna corrispondente alla dose ZIF-8.</li>
		<li>Fare clic su Analizza e, in Analisi colonne, selezionare ANOVA unidirezionale (e non parametrica o mista).</li>
		<li>Nella scheda Progettazione sperimentale , selezionare Nessuna corrispondenza o abbinamento. In Distribuzione gaussiana dei residui, selezionare Sì usa ANOVA. Infine, seleziona Sì Usa test ANOVA ordinario in Presumi SD uguali.</li>
		<li>Nella scheda Confronti multipli selezionare Confronta la media di ogni colonna con la media di una colonna di controllo. Fare clic su OK per visualizzare i risultati.</li>
	</ol></li>
</ol>

Valutazione dei cambiamenti di comportamento delle celle indotte da MOF mediante rilevamento del substrato della cella elettrica

Gli autori non segnalano conflitti di interesse in questo lavoro.

Analisi precedenti hanno mostrato che l'ECIS potrebbe essere utilizzato per valutare il comportamento delle cellule esposte agli analiti (ad esempio, nanotubi di carbonio35, farmaci43 o nanoargille16). Inoltre, Stueckle et al. hanno utilizzato ECIS per valutare la tossicità delle cellule BEAS-2B esposte alle nanoargille e ai loro sottoprodotti e hanno scoperto che il comportamento cellulare e l'attaccamento dipendevano dalle caratteristiche fisico-c...

Le strutture metallo-organiche (MOF) sono ibridi formati attraverso la combinazione di ioni metallici e linker organici 1,2 in solventi organici. A causa della varietà di tali combinazioni, i MOF possiedono diversità strutturale3, porosità regolabile, elevata stabilità termica ed elevate aree superficiali 4,5. Tali caratteristiche li rendono candidati interessanti in una varietà di applicazioni, dallo stoccaggio di gas 6,7 alla catalisi8,9, e dai mezzi di contrasto 10,11 alle unità di somministrazione di farmaci 12,13. Tuttavia, l'implementazione dei MOF in tali applicazioni ha sollevato preoccupazioni relative alla loro sicurezza sia per gli utenti che per l'ambiente. Studi preliminari hanno dimostrato, ad esempio, che la funzione cellulare e la crescita cambiano in seguito all'esposizione delle cellule a ioni metallici o linker utilizzati per la sintesi di MOF 1,14,15. Ad esempio, Tamames-Tabar et al. hanno dimostrato che ZIF-8 MOF, un MOF a base di Zn, stava portando a più cambiamenti cellulari in una linea cellulare di cancro cervicale umano (HeLa) e in una linea cellulare di macrofagi di topo (J774) rispetto ai MOF a base di Zr e Fe. Tali effetti erano presumibilmente dovuti alla componente metallica di ZIF-8 (cioè Zn), che potrebbe potenzialmente indurre l'apoptosi cellulare dopo la disintegrazione della struttura e il rilascio di ioni Zn1. Allo stesso modo, Gandara-Loe et al. hanno dimostrato che HKUST-1, un MOF a base di Cu, ha causato la più alta riduzione della vitalità delle cellule di retinoblastoma di topo quando usato a concentrazioni di 10 μg/mL o superiori. Ciò era presumibilmente dovuto allo ione metallico Cu incorporato durante la sintesi di questa struttura, che, una volta rilasciato, poteva indurre stress ossidativo nelle cellule esposte15.
Inoltre, l'analisi ha dimostrato che l'esposizione a MOF con diverse caratteristiche fisico-chimiche potrebbe portare a risposte diverse delle cellule esposte. Ad esempio, Wagner et al. hanno dimostrato che ZIF-8 e MIL-160 (una struttura a base di Al), utilizzati nell'esposizione di una cellula epiteliale bronchiale umana immortalizzata, hanno portato a risposte cellulari dipendenti dalle proprietà fisico-chimiche delle strutture, vale a dire idrofobicità, dimensioni e caratteristiche strutturali16. Parallelamente, Chen et al. hanno dimostrato che una concentrazione di 160 μg/mL MIL-100(Fe) esposta a cellule epatiche umane normali (HL-7702) ha causato la maggiore perdita di vitalità cellulare, presumibilmente a causa della componente metallica di questa specifica struttura (cioè Fe17).
Mentre questi studi classificano gli effetti deleteri dei MOF sui sistemi cellulari in base alle loro caratteristiche fisico-chimiche e alle concentrazioni di esposizione, sollevando così potenziali preoccupazioni con l'implementazione del quadro, specialmente in campo biomedico, la maggior parte di queste valutazioni si basa su saggi colorimetrici a singolo punto temporale. Ad esempio, è stato dimostrato che quando sono stati utilizzati saggi di tetrazolio (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro) e sale di tetrazolio solubile in acqua (WST-1), questi reagenti biochimici potrebbero portare a falsi positivi nelle loro interazioni con le particelle a cui le cellule sono state esposte18. È stato dimostrato che il sale di tetrazolio e i reagenti rossi neutri possiedono un'elevata affinità di adsorbimento o legame sulle superfici delle particelle, con conseguente interferenza del segnale dell'agente19. Inoltre, per altri tipi di saggi, come la citometria a flusso, che in precedenza si era dimostrata utilizzata per valutare i cambiamenti nelle cellule esposte ai MOF20,21, è stato dimostrato che i principali problemi devono essere aggirati se si vuole prendere in considerazione un'analisi praticabile degli effetti deleteri delle particelle. In particolare, devono essere affrontati gli intervalli di rivelazione delle dimensioni delle particelle, specialmente in popolazioni miste come quelle offerte dai MOF o i riferimenti delle particelle utilizzate per la calibrazione prima dei cambiamenti cellulari22. È stato anche dimostrato che il colorante utilizzato durante la marcatura cellulare per tali saggi citometrici potrebbe anche interferire con le nanoparticelle a cui le cellule sono state esposte23.
L'obiettivo di questo studio era quello di utilizzare un saggio di valutazione in tempo reale e ad alto rendimento per valutare i cambiamenti nel comportamento cellulare in seguito all'esposizione a un MOF selezionato. Le valutazioni in tempo reale possono aiutare a fornire informazioni sugli effetti dipendenti dal tempo, in relazione alle finestre di esposizione16. Inoltre, forniscono informazioni sui cambiamenti nelle interazioni cellula-substrato, sulla morfologia cellulare e sulle interazioni cellula-cellula, nonché su come tali cambiamenti dipendano rispettivamente dalle proprietà fisico-chimiche dei materiali di interesse e dai tempi di esposizione24,25.
Per dimostrare la validità e l'applicabilità dell'approccio proposto, sono state utilizzate cellule epiteliali bronchiali umane (BEAS-2B), ZIF-8 (una struttura idrofobica di imidazolatozeolitico 16) e rilevamento dell'impedenza cellula-substrato elettrico (ECIS). Le cellule BEAS-2B rappresentano un modello per l'esposizione polmonare 26 e sono state precedentemente utilizzate per valutare i cambiamenti in seguito all'esposizione delle cellule alle nanoargille e ai loro sottoprodotti degradati termicamente26,27,28, nonché per valutare la tossicità dei nanomateriali, come i nanotubi di carbonio a parete singola (SWCNT)18. Inoltre, tali cellule sono state utilizzate per più di 30 anni come modello per la funzione epiteliale polmonare29. ZIF-8 è stato scelto per la sua ampia implementazione nella catalisi30 e come mezzo di contrasto31 per il bioimaging e la somministrazione di farmaci32, e quindi per l'esteso potenziale di esposizione polmonare durante tali applicazioni. Infine, ECIS, la tecnica non invasiva in tempo reale, è stata precedentemente utilizzata per valutare i cambiamenti nell'aderenza, nella proliferazione, nella motilità e nella morfologia cellulare 16,26 come risultato di una varietà di interazioni tra analiti (sia materiali che farmaci) e cellule esposte in tempo reale 16,18,28. ECIS utilizza una corrente alternata (AC) per misurare l'impedenza delle celle immobilizzate sugli elettrodi d'oro, con le variazioni di impedenza che forniscono informazioni sui cambiamenti di resistenza e capacità all'interfaccia del substrato cellula-oro, sulla funzione di barriera indotta dalle interazioni cellula-cellula e sulla copertura dello strato sovracellulare di tali elettrodi d'oro33,34. L'utilizzo di ECIS consente misurazioni quantitative con una risoluzione su scala nanometrica in modo non invasivo e in tempo reale26,34.
Questo studio valuta e confronta la semplicità e la facilità di valutazione dei cambiamenti indotti da MOF nel comportamento cellulare in tempo reale con le valutazioni dei saggi a punto singolo. Tale studio potrebbe essere ulteriormente estrapolato per valutare i profili cellulari in risposta all'esposizione ad altre particelle di interesse, consentendo così test delle particelle sicuri fin dalla progettazione e il successivo aiuto per l'implementazione. Inoltre, questo studio potrebbe integrare i saggi genetici e cellulari che sono valutazioni a punto singolo. Ciò potrebbe portare a un'analisi più informata degli effetti deleteri delle particelle sulla popolazione cellulare e potrebbe essere utilizzato per lo screening della tossicità di tali particelle in modo ad alto rendimento16,35,36.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;4-[3-(4-idophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate (WST-1 assay)&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5015944001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25255-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1300 Series A2 biofume hood</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>323TS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2510 Branson bath sonicator</td>
			<td>Process Equipment &#38; Supply, Inc.&#160;</td>
			<td>251OR-DTH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylimidazole, 97%</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>693-98-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL sterile microtube</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>T2076S-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL&#160; tubes&#160;</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96W10idf well plates</td>
			<td>Applied Biophysics&#160;</td>
			<td>96W10idf PET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>FB012931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biorender</td>
			<td>Biorender</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL automated cell counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C0916-186A-0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denton Desk V sputter and carbon coater</td>
			<td>Denton Vacuum</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethly sulfoxide&#160;</td>
			<td>Corning</td>
			<td>25-950-CQC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS/Modified</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30028.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-014-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECIS-Z&#920;</td>
			<td>Applied Biophysics&#160;</td>
			<td>ABP 1129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>Version 2301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes (15 mL)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUOstar OPTIMA plate reader</td>
			<td>BMG LABTECH</td>
			<td>413-2132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism Software (9.0.0)</td>
			<td>GraphPad Software, LLC</td>
			<td>Version 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERAcell 150i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50116047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hitachi S-4700 Field emission scanning electron microscope equipped with energy dispersive X-ray&#160;</td>
			<td>Hitachi High-Technologies Corporation</td>
			<td>S4700 and EDAX TEAM analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immortalized human bronchial epithelial cells</td>
			<td>American Type Culture Collection</td>
			<td>CRL-9609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp freezer</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, 99%</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>The Lab Depot</td>
			<td>HS234526A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Steptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall Legend X1R Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorvall T 6000B</td>
			<td>DU PONT</td>
			<td>&#160;T6000B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue, 0.4% solution in PBS</td>
			<td>MP Biomedicals, LLC</td>
			<td>1691049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber</td>
			<td>Belart</td>
			<td>999320237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Nitrate Hexahydrate, 98% extra pure</td>
			<td>Acros Organic</td>
			<td>101-96-18-9</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electric cell-substrate sensing for real-time evaluation of metal-organic framework toxicological profiles

Le strutture metallo-organiche (MOF) sono ibridi formati attraverso la coordinazione di ioni metallici e leganti organici in solventi organici. L'implementazione dei MOF in applicazioni biomediche e industriali ha sollevato preoccupazioni per quanto riguarda la loro sicurezza. In questo caso, il profilo di un MOF selezionato, una struttura zeolitica imidazolica, è stato valutato dopo l'esposizione a cellule epiteliali polmonari umane. La piattaforma per la valutazione era una tecnica in tempo reale (ad esempio, il rilevamento dell'impedenza della cella elettrica-substrato [ECIS]). Questo studio identifica e discute alcuni degli effetti deleteri del MOF selezionato sulle cellule esposte. Inoltre, questo studio dimostra i vantaggi dell'utilizzo del metodo in tempo reale rispetto ad altri saggi biochimici per valutazioni cellulari complete. Lo studio conclude che i cambiamenti osservati nel comportamento cellulare potrebbero suggerire una possibile tossicità indotta dall'esposizione a MOF di diverse caratteristiche fisico-chimiche e dal dosaggio di tali strutture utilizzate. Comprendendo i cambiamenti nel comportamento cellulare, si prevede la capacità di migliorare le strategie di sicurezza fin dalla progettazione dei MOF da utilizzare per applicazioni biomediche, adattando in modo specifico le loro caratteristiche fisico-chimiche.

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the combination of metal ions and organic linkers1,2 in organic solvents. Due to the variety of such combinations, MOFs possess structural diversity3, tunable porosity, high thermal stability, and high surface areas4,5. Such characteristics make them attractive candidates in a variety of applications, from gas storage6,7 to catalysis8,9, and from contrast agents10,11 to drug delivery units12,13. However, the implementation of MOFs into such applications has raised concerns relative to their safety to both the users and the environment. Preliminary studies have shown, for instance, that cellular function and growth change upon the exposure of cells to metal ions or linkers used for MOF synthesis1,14,15. For instance, Tamames-Tabar et al. demonstrated that ZIF-8 MOF, a Zn-based MOF, was leading to more cellular changes in a human cervical cancer cell line (HeLa) and a mouse macrophage cell line (J774) relative to Zr-based and Fe-based MOFs. Such effects were&#160;presumably due to the metal component of ZIF-8 (i.e., Zn), which could potentially induce cell apoptosis upon framework disintegration and Zn ion release1. Similarly, Gandara-Loe et al. demonstrated that HKUST-1, a Cu-based MOF, caused the highest reduction in mouse retinoblastoma cell viability when used at concentrations of 10 &#181;g/mL or greater. This was presumably due to the Cu metal ion incorporated during the synthesis of this framework, which, once released, could induce oxidative stress in the exposed cells15.
Moreover, analysis showed that the exposure&#160;to MOFs with different physicochemical characteristics could lead to varying responses of exposed cells. For instance, Wagner et al. demonstrated that ZIF-8 and MIL-160 (an Al-based framework), used in the exposure of an immortalized human bronchial epithelial cell, led to cellular responses dependent on frameworks&#39; physicochemical properties, namely hydrophobicity, size, and structural characteristics16. Complementarily, Chen et al. demonstrated that a concentration of 160 &#181;g/mL MIL-100(Fe) exposed to human normal liver cells (HL-7702) caused the largest loss in cellular viability, presumably due to the metal component of this specific framework (i.e., Fe17).
While these studies categorize MOFs&#39; deleterious effects on cellular systems based on their physicochemical characteristics and exposure concentrations, thus raising potential concerns with framework implementation, especially in biomedical fields, most of these evaluations are based on single time point colorimetric assays. For instance, it was shown that when (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) tetrazolium (MTT) and water-soluble tetrazolium salt (WST-1) assays were used, these biochemical reagents could lead to false positives upon&#160;their&#160;interactions with the particles that the cells were also exposed to18. The tetrazolium salt and neutral red reagents were&#160;shown to possess a high adsorption or binding affinity onto the surfaces of the particles, resulting to agent signal interference19. Moreover, for other types of assays, such as flow cytometry, which was previously shown to be used for assessing changes in cells exposed to MOFs20,21, it was shown that major issues have to be circumvented if a viable analysis of particles&#39; deleterious effects is to be considered. In particular, detection ranges of the particles&#39; sizes, especially in mixed populations like the ones offered by MOFs or references of the particles used for calibration before cellular changes, have to be addressed22. It was also shown that the dye used during cell labeling for such cytometry assays could also interfere with the nanoparticles that the cells were exposed to23.
The goal of this study was to use a real-time, high-throughput evaluation assay to assess changes in cell behavior upon exposure to a select MOF. Real-time evaluations can help provide insights into time-dependent effects, as related to the windows of exposures16. Further, they provide information on changes in cell-substrate interactions, cell morphology, and cell-cell interactions, as well as how such changes depend on the physicochemical properties of the materials of interest and exposure times24,25 respectively.
To demonstrate the validity and applicability of the proposed approach, human bronchial epithelial (BEAS-2B) cells, ZIF-8 (a hydrophobic framework of zeolitic imidazolate16), and electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) were used. BEAS-2B cells represent a model for lung exposure26 and have been previously used to evaluate changes upon the exposure of cells to nanoclays and their thermally degraded byproducts26,27,28,&#160;as well as assess the toxicity of nanomaterials, such as single-walled carbon nanotubes (SWCNTs)18. Furthermore, such cells have been used for more than 30 years as a model for pulmonary epithelial function29. ZIF-8 was chosen due to its wide implementation&#160;in catalysis30 and as contrast agents31 for bioimaging and drug delivery32, and thus for the extended potential for lung exposure during such applications. Lastly, ECIS, the noninvasive, real-time technique, was previously used to evaluate changes in cell adherence, proliferation, motility, and morphology16,26 as a result of a variety of interactions between analytes (both materials and drugs) and exposed cells in real-time16,18,28. ECIS uses an alternating current (AC) to measure the impedance of cells immobilized on gold electrodes, with the impedance changes giving insights into changes in resistance and capacitance at the&#160;cell-gold substrate interface, barrier function as induced by cell-cell interactions, and over-cell layer coverage of such gold electrodes33,34. Using ECIS allows quantitative measurements at a nanoscale resolution in a noninvasive, real-time manner26,34.
This study assesses and compares the simplicity and ease of evaluation of MOF-induced changes in cellular behavior in real-time with single-point assay evaluations. Such a study could be further extrapolated for evaluating cell profiles in response to exposure to other particles of interest, thus allowing for safe-by-design particle testing and subsequent helping with&#160;implementation. Moreover, this study could complement genetic and cellular assays that are single-point evaluations. This could lead to a more informed analysis of the deleterious effects of particles on the cellular population and could be used for screening such particles&#39; toxicity in a high-throughput manner16,35,36.

Autore in primo piano: Progressi nella valutazione della risposta delle cellule epiteliali polmonari umane alle strutture metallo-organiche 

Rilevamento elettrico cellula-substrato per la valutazione in tempo reale dei profili tossicologici della struttura metallo-organica

My research aims to evaluate changes in human lung epithelial cells'behavior upon exposure to metal organic framework, hybrids formed by combining metal ions in organic linkers in organic solvents. This research demonstrated that the physical and chemical composition of metal organic frameworks, as well as their cellular exposure ratios, affects the behavior of human lung epithelial cells in a time and dose-dependent manner. This can be recorded in a high throughput in real time fashion.Our research helps to evaluate, understand the mechanisms of toxicity of metal organic frameworks upon exposure to cellular systems. The current method allows continuous cell monitoring in a real time and in high throughput manner. Additionally, this method does not rely on any external reagents, and thus it reduces any possible interference they could have with the frameworks used for exposure.Our laboratory will continue to focus on understanding and evaluating the mechanisms of toxicity associated with nanomaterials exposures, as well as using such information to synthesize new and safe systems that could be implemented in biomedical applications at minimum risks to the user or the environment.

Utilizzando una comune linea cellulare modello in vitro 39 (BEAS-2B), questo studio mirava a dimostrare la fattibilità e l'applicabilità dell'ECIS per valutare i cambiamenti nel comportamento cellulare in seguito all'esposizione a un MOF sintetizzato in laboratorio. La valutazione di questi cambiamenti è stata integrata dall'analisi mediante saggi colorimetrici convenzionali.
Le caratteristiche fisico-chimiche del quadro sono state prima valutate per garanti...

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Il seguente studio valuta il profilo tossicologico di una struttura metallo-organica selezionata utilizzando il rilevamento dell'impedenza della cellula-substrato elettrico (ECIS), una tecnica di screening in tempo reale e ad alto rendimento.

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

La mia ricerca ha lo scopo di valutare i cambiamenti nel comportamento delle cellule epiteliali polmonari umane in seguito all'esposizione a strutture metalliche organiche, ibridi formati dalla combinazione di ioni metallici in linker organici in solventi organici. Questa ricerca ha dimostrato che la composizione fisica e chimica delle strutture metallo-organiche, così come i loro rapporti di esposizione cellulare, influenzano il comportamento delle cellule epiteliali polmonari umane in modo dipendente dal tempo e dalla dose. Questo può essere registrato in un throughput elevato in tempo reale.La nostra ricerca aiuta a valutare, comprendere i meccanismi di tossicità delle strutture metallo-organiche in seguito all'esposizione a sistemi cellulari. Il metodo attuale consente il monitoraggio continuo delle celle in tempo reale e ad alta produttività. Inoltre, questo metodo non si basa su reagenti esterni e quindi riduce qualsiasi possibile interferenza che potrebbero avere con le strutture utilizzate per l'esposizione.Il nostro laboratorio continuerà a concentrarsi sulla comprensione e la valutazione dei meccanismi di tossicità associati all'esposizione ai nanomateriali, nonché sull'utilizzo di tali informazioni per sintetizzare nuovi e sicuri sistemi che potrebbero essere implementati in applicazioni biomediche con rischi minimi per l'utente o per l'ambiente.

electric-cell-substrate-sensing-for-real-time-evaluation-metal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

605 Views.  West Virginia University. La mia ricerca ha lo scopo di valutare i cambiamenti nel comportamento delle cellule epiteliali polmonari umane in seguito all'esposizione a strutture metalliche organiche, ibridi formati dalla combinazione di ioni metallici in linker organici in solventi organici. Questa ricerca ha dimostrato che la composizione fisica e chimica delle strutture metallo-organiche, così come i loro rapporti di esposizione cellulare, influenzano il comportamento delle cellule epiteliali polmonari umane in modo...

Video: Autore in primo piano: Progressi nella valutazione della risposta delle cellule epiteliali polmonari umane alle strutture metallo-organiche 

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Ricerca

Bioingegneria

Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS)

To begin, take a 96 well plate containing interdigitated finger connection electrodes covering an area of about four square millimeters. Place the plate onto the well station and click the setup button. If the wells are connected properly, green readings will appear.Any unconnected wells will be identified as red. Add 200 microliters of media to each well being used and then place the plate into the electrical cell substrate impedance sensing, or ECIS station. To stabilize the wells and prepare them for experiments, click setup, followed by check, and then click on stabilize.After 40 minutes, remove the plate from the station and remove the media from each well. Seed the B2B cells at a density of 40, 000 cells per milliliter into the wells containing the cells, and place the plate onto the ECIS station in the incubator. Next, click on check to ensure all the electrodes are read by the sensors on the station.Select multiple frequency time to measure each electrode at seven different frequencies. Click on start and allow it to run for 24 hours so the cells can form a confluent monolayer. Every well's reading is displayed in a different color.After about 24 hours, the wells containing cells will show increased resistance on the monitor indicating the attachment of the cells to the electrodes. Press pause to interrupt the data collection. For example, for media changes, reagents edition, and so on.Expose the ZIF8 nanoparticles to the blank well and the cell wells with a volume of 100 microliters per well, Place the plate onto the station and click on check again to ensure that the sensors are reading all the electrodes. Click on resume to resume the experiments after the chosen pause. After the data collection, click finish to save the data as a spreadsheet file.To get the alpha parameters click on model, and on the popped up screen, click on media only well, then select the well that has only media. Click on set reference for data evaluation and select the reference related to the control experiment. Click on find to start the reference fitting.Select set then fit T range to process the data relative to the selected reference. To evaluate the cell attachment, select alpha. Finally, after the system finishes the analysis, click save RBA and save the parameters as a spreadsheet file.The analysis of the cell behavior upon exposure to ZIF8 MOFs was performed through electrical cell substrate impedance sensing. The images showed changes in the cell substrate interactions and the changes are dependent on the time of exposure and the dose being used.