Teknik tavsiyeler için Rosanna Calderon, Dominic Shayler ve Rosa Sierra'ya teşekkürler. Bu çalışma kısmen, USC Keck Tıp Fakültesi Oftalmoloji Bölümü'ne Körlüğü Önleme Araştırmaları (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Oftalmoloji için Deneysel Terapötikler Vakfı (AN), Körlüğü Önleme Araştırması Kariyer Geliştirme Ödülü (AN), Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı Vakfı (AN), ve Edward N. ve Della L. Thome Anma Vakfı (AN, KG).

Tüm prosedürler, Güney Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ile uyumlu olarak yürütülmüş ve onaylanmıştır. Bu protokolün geliştirilmesinde 4 ila 6 aylık yaşları arasında on dört (n = 14) Hollanda kuşaklı tavşan kullanılmıştır. Hem erkek hem de dişi hayvanlar kullanıldı. Tüm hayvanlar 2,0 ila 2,5 kg ağırlığındaydı. Bütün hayvanlar tek başına barındırıldı. Önerilen malzeme ve ekipmanların bir listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir.
1. Hazırlık
<ol><li>Fiksatif hazırlık.<ol><li>Fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4 paraformaldehit (PFA) hazırlayın. En azından, göz başına 50 mL fiksatif gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Kriyoprotektif ajan hazırlama.<ol><li>PBS'de hacimce ağırlıkça %30 (a/h) sükroz hazırlayın. Sükrozun tamamen çözüldüğünden emin olmak için en az 15 dakika çalkalayıcı üzerine koyun. En azından, göz başına 50 mL kriyoprotektif ajan gereklidir.</li>
	</ol></li>
	<li>Diseksiyon aletinin hazırlanması.<ol><li>İki çift forseps, bir çift kavisli makas, bir neşter bıçağı ve 100 mm'lik bir diseksiyon kabı toplayın ve bunları bir diseksiyon mikroskobunun yanına yerleştirin. Örnek bir kurulum Şekil 1A'da gösterilmiştir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. İlk fiksasyon
<ol><li>Trans-konjonktival enükleasyonun11 ardından, gözü hemen buz üzerinde PBS'de en az 50 mL %4 PFA'ya yerleştirin. Gözün tamamen suya daldırıldığından emin olun. Gözün dış yüzeyinde hava kabarcıkları birikirse, hafifçe çalkalayarak çıkarın.</li>
</ol>3. Kornea ve iris çıkarma
<ol><li>15 dakika sonra, gözü PBS'deki %4 PFA'dan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün kurumasını önlemek için tabağı PBS ile doldurun.</li>
	<li>Korneayı çıkarın.<ol><li>Alttaki yapıların kazara delinmesini önlemek için limbusun 1 mm önünde, iris düzlemine paralel bir cerrahi bıçakla bir kesi oluşturarak başlayın (Şekil 1B).</li>
		<li>İlk kesiğe kavisli makas sokun ve limbustan 1 mm uzakta kalarak çevresel olarak kesmeye devam edin. Keserken gözü stabilize etmek için forseps kullanın (Şekil 1C).</li>
		<li>Çevresel kesim tamamlandıktan sonra, korneayı forseps ile çıkarın ve fazla PBS'yi bir laboratuvar mendili ile nazikçe silin. Korneayı, kriyoproteksiyon veya atma için oda sıcaklığında (RT) %30 sükroz çözeltisine yerleştirin. Kriyoproteksiyon, kornea battığında tamamlanır ve bu genellikle 1 saatten az sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>İrisi çıkarın.<ol><li>İris boyunca kavisli bir makasla ilk kesimi yaparak başlayın. Korneanın çıkarılmasına benzer şekilde çevresel olarak keserek irisi dokunun geri kalanından tamamen ayırın (Şekil 1D).</li>
		<li>Çevresel kesim tamamlandıktan sonra, irisi forseps ile çıkarın ve fazla PBS'yi bir laboratuvar mendili ile nazikçe silin. İrisi, kriyoproteksiyon için RT'de% 30 sükroz çözeltisine yerleştirin veya yukarıdaki gibi atın. Kriyoproteksiyon, iris battığında tamamlanır ve bu genellikle 30 dakikadan az sürer.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Fiksasyonun tamamlanması
<ol><li>Kornea ve iris çıkarıldıktan sonra, gözü PBS'de en az 50 mL taze hazırlanmış% 4 PFA'ya yerleştirin ve hafif çalkalama için bir çalkalayıcıya koyun. Çalkalama sırasında gözün su altında kaldığından emin olun.</li>
	<li>Gece boyunca 4 ° C'de PBS'de% 4 PFA'da gözünüzü koruyun. NOT: %4 PFA'nın, 4 ° C'de 16 saat ile 24 saat arasında kullanıldığında mükemmel IHC boyaması ile sonuçlandığını, daha uzun fiksasyon sürelerinin spesifik olmayan arka plan boyaması ve epitop maskelemesinin artmasına neden olduğunu bulduk.</li>
</ol>5. Lensin çıkarılması
<ol><li>Ertesi sabah, gözü PBS'deki %4 PFA'dan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün kurumasını önlemek için tabağı PBS ile doldurun.</li>
	<li>Lensi çıkarın.<ol><li>Ön lens kapsülünü forseps ile dikkatlice kavrayarak başlayın. NOT: Retina dekolmanı oluşturabileceğinden, lensi forseps ile zorla itmemeye veya çekmemeye son derece dikkat edin.</li>
		<li>Makasları, bıçaklar lens boyunca arkaya doğru kıvrık olacak şekilde dikkatlice arka odaya yerleştirin. Kavisli makasla lens zonüllerinden ilk kesimi yapın. NOT: Retina dekolmanı oluşturabileceğinden, zonülleri makasla zorla itmemeye veya çekmemeye son derece dikkat edin (Şekil 1E).</li>
		<li>Lens zonüllerinden çevresel bir düzende küçük kesikler yapmaya devam edin. Saat başına üç ila beş kesim yapın.</li>
		<li>Lensin dokunun geri kalanından ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek için, ön lens kapsülünü forseps ile nazikçe kavrayın ve nazikçe kaldırmaya çalışın. Lens hemen kalkmazsa, retina dekolmanı oluşturabileceğinden daha fazla çekmeye çalışmayın. Bunun yerine, kalan lens zonüllerinden daha fazla kesi yapın ve yeniden deneyin.</li>
		<li>Dokunun geri kalanından ayrıldıktan sonra, lensi kriyoproteksiyon için RT'de% 30 sükroz çözeltisine yerleştirin veya yukarıdaki gibi atın. Kriyoproteksiyon, lens battığında tamamlanır ve bu genellikle birkaç saat sürer.</li>
	</ol></li>
	<li>Kriyoproteksiyon için gözü 4 ° C'de PBS'de en az 50 mL %30 sükroz içine yerleştirin. Kriyoproteksiyon, göz battığında tamamlanır ve bu genellikle 24-48 saat sürer. Kriyoproteksiyonu hızlandırmak için, ilk sükroz solüsyonunu 8-12 saat sonra taze bir solüsyonla değiştirin ve/veya gözünüzü RT'de sakaroz solüsyonunda tutun.</li>
</ol>6. Gömme
<ol><li>Kriyoproteksiyon tamamlandıktan sonra, gözü %30 sükroz solüsyonundan çıkarın ve diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Gözün iç kısmındaki fazla sakaroz solüsyonunu çıkarmak için gözü aşağı bakacak şekilde dikkatlice çevirin. NOT: Mendil vitreus gövdesine yapışabileceğinden ve retina dekolmanı ile sonuçlanabileceğinden, gözün iç kısmındaki fazla solüsyonu laboratuvar mendiliyle çıkarmaya çalışmayın.</li>
	<li>Göz aşağı bakacak şekilde, bir mendil kullanarak gözün dış kısmındaki fazla sükroz solüsyonunu nazikçe silin.</li>
	<li>Tek kullanımlık bir gömme kalıbını 0,5-1,0 cm derinliğe kadar optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurun. NOT: Bu taban, gözün kalıbın altına temas etmemesini sağlar, bu da daha sonra kriyoseksiyona müdahale eder.</li>
	<li>Gözü yukarı bakacak şekilde tek kullanımlık gömme kalıbına yerleştirin. Göz içinde kabarcık oluşumunu önlemek için özel dikkat göstererek gözün iç kısmını yavaşça OCT ile doldurun. Kabarcıklar oluşursa, bunları dikkatlice çıkarın veya forseps kullanarak kalıbın kenarına itin.</li>
	<li>Tek kullanımlık gömme kalıbını OCT ile doldurmayı bitirin. Gözün tamamen OCT'ye batırıldığından ve kalıbın iç yüzeylerine temas etmediğinden veya havaya maruz kalmadığından emin olun. Gözü OCT'de içeren tek kullanımlık gömme kalıbını parafilme sarın; gece boyunca 4 °C'ye koyun. NOT: Deneyimlerimize göre, daha kısa kuluçka süreleri OCT'nin vitreusa tamamen sızmasına izin vermez. Sonuç olarak, retina ile OCT arasında genellikle bir sükroz tabakası kalır. Bu meydana geldiğinde, donmuş sükroz muhtemelen donmuş OCT'den daha az yapısal destek sağladığından, kriyoseksiyon sırasında retina genellikle dokunun geri kalanından ayrılır veya tamamen yırtılır, bu da yüksek kaliteli kesitlerin elde edilmesini zorlaştırır ve hatta imkansız hale getirir.</li>
	<li>Ertesi sabah, gözü OCT'de içeren gömme kalıbını diseksiyon mikroskobu altında 100 mm'lik bir diseksiyon kabına yerleştirin. Arka hyaloid zarın iç retinadan yukarı doğru kalkmış göründüğünü onaylayın. NOT: Bu yukarı kaldırma, retinanın görünümünü engelleyebilir ve yönün belirlenmesini zorlaştırabilir.</li>
	<li>Gözün yönünü daha iyi belirlemek için, posterior hyaloid membranı öne doğru dikkatlice kavrayın ve OCT sırasında alttaki retinayı ortaya çıkarmak için forseps ile soymaya çalışın. NOT: Bazen, optik sinir kafasına yapışan ve optik sinir başı retinanın üst kısmında yer aldığından yönlendirme amacıyla kullanılabilen hyaloid kanal görülebilir (Şekil 2A). Posterior hyaloid membranın tamamen çıkarılması gerekli değildir, çünkü OCT iç retinayı hizalamak için vitreus gövdesine zaten sızmıştır ve kalan herhangi bir membran kriyoseksiyonu etkilemeyecektir (Şekil 2B). Posterior hyaloid membran sadece gerekirse oryantasyon için çıkarılmalıdır. Oryantasyonu belirlemek için diğer seçenekler arasında, enükleasyondan önce bir sütür veya başka bir tür işaret yerleştirilmesi yer alır.</li>
	<li>Gözü 0,5-1,0 cm derinliğe kadar doldurulmuş yeni OCT ile yeni bir gömme kalıbına aktarın ve ardından son gömme ortamının kalıntı ve/veya gece boyunca birikmiş olabilecek diğer kusurlardan arınmış olduğundan emin olmak için 6.3-6.5 adımlarındaki gibi yeni OCT ile doldurun. Mümkünse, OCT'yi gözün içinden de bir mendille nazikçe çıkarın, ancak bu gerekli değildir.</li>
	<li>Kalıbı oryantasyon amacıyla etiketleyin (Şekil 2C). Kriyo kalıbında göz yukarı bakacak şekilde gözü yönlendirmek, OCT'nin iç retinayı kaplamasını sağlar. Optik sinir başına yapışan hyaloid kanal, gözün üst kısmının belirlenmesinde önemli bir dönüm noktasıdır (Şekil 2A).</li>
	<li>Gözü OCT olarak içeren etiketli gömme kalıbını kuru buzun üzerine yerleştirin. Gözün gömme kalıbının iç yüzeylerinden hiçbirine temas etmediğinden veya havaya maruz kalmadığından emin olun. Dondurma işlemini hızlandırmak için kalıbın doğrudan kuru buza temas ettiğinden emin olun (Şekil 2D).</li>
	<li>Gömülü gözü -80 °C'lik bir dondurucuya veya kesit almak için doğrudan kriyostata aktarın (Şekil 2E).</li>
</ol>7. Kriyoseksiyon
<ol><li>Bloğu, gözün üst kısmı üste ve gözün alt kısmı aşağıya bakacak şekilde, kalan kornea ve iris sağa ( Şekil 2E'deki gibi) veya sola (gösterilmemiştir) bakacak şekilde monte edin. Alternatif olarak, bloğu istediğiniz gibi farklı bir yönde monte edin. Gerekirse, kalıbın her iki tarafını birer birer dikkatlice kırarak ve gözün yönünü kaybetmemek için bloğu doğrudan işaretleyerek bloğu harekete geçirmek için kalıbı kırın.</li>
	<li>Bloğun kriyostat içindeki sıcaklığa 30-60 dakika dengelenmesine izin verin; -20 °C iyi bir başlangıç noktasıdır.</li>
	<li>Monte edildikten sonra, istenen açıda, tipik olarak gözün dikey eksenine paralel olarak yeni bir bıçak yerleştirin.</li>
	<li>Kesit kalınlığını istediğiniz gibi ayarlayın: 10-20 μm kalınlığındaki kesitler iyi bir başlangıç noktasıdır. 14 μm kalınlığındaki bir kesit örneği Şekil 3A-C'de gösterilmiştir.<ol><li>Yavaş ve kontrollü bir şekilde, bloğu bölümlere ayırmaya başlayın. Bıçağın bloğu gözün dikey eksenine paralel olarak kestiğinden emin olun. Değilse, bıçağın bloğa temas açısını veya sahne yönünü buna göre ayarlayın.</li>
		<li>Bloğu bölümlere ayırırken, bölümün bir fırça ile kırışmasını veya kıvrılmasını önleyin. Bölümü hızlı bir şekilde ters çevirin ve bölümü düzleştirmek ve kırışmayı veya kıvrılmayı en aza indirmek için uzun tüylü bir fırça ile aşağı doğru hafif bir baskı uygulayın. Bölümün manipülasyonuna yardımcı olmak için sivri uçlu ayrı bir fırça oluşturun.</li>
	</ol></li>
	<li>Slaytı aşağıya doğru bölüme doğru yavaşça hareket ettirerek bölümü yüklü bir cam slayta takın. Cam sürgüyü bölümün üzerinde hafifçe yuvarlayarak bölümün kendi üzerine katlanmasını veya takma sırasında başka bir şekilde kendini bozmasını önleyin. NOT: Slaytı doğrudan bölümün üzerine getirmeyin veya bölüme doğru bastırmayın, çünkü bu bölüme zarar verebilir veya deforme olabilir.</li>
	<li>-80 °C'lik bir dondurucuya aktarmadan veya doğrudan standart bir immünofloresan protokolüne geçmeden önce slaytların gece boyunca kurumasını bekleyin.</li>
</ol>

İmmünohistokimya Çalışmaları için Tavşan Gözü Diseksiyonu ve Kriyoseksiyonu

<ol>
	<li>Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19-Models+in+ophthalmology+and+vision+research.">Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research.</a> American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).</li><li>Davis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+and+histology+of+the+eye+and+orbit+of+the+rabbit.">The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).</li><li>Zernii, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+models+of+ocular+diseases:+New+relevance+for+classical+approaches.">Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches.</a> CNS &amp; Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Pang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+preparation+of+mouse+eye+sections+for+routine+histology,+immunofluorescence,+and+RNA+in+situ+hybridization+multiplexing.">Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).</li><li>Sorden, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+background+and+procedure-related+microscopic+findings+and+common+artifacts+in+ocular+tissues+of+laboratory+animals+in+ocular+studies.">Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies.</a> Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Mitchell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+in+companion+animals.">Enucleation in companion animals.</a> Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).</li><li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs.">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).</li><li>Baiza-Dur&#225;n, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+(PRO-169)+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits.">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits.">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li><li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit.">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li></ol>

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Yukarıdaki protokolü uygulamadan önce, IHC için tavşan gözlerinin doku işlemesinde sürekli olarak zorluklarla karşılaştık. Fareler gibi daha küçük hayvanların gözlerinden birkaç protokol uyarladık, ancak bunların yetersiz fiksasyona ve doku kesitinde zorluğa yol açtığını gördük. Tavşan retinasının tutarlı, yüksek kaliteli bölümlerine izin veren birkaç önemli husus vardır.
Dikkate alınması gereken bir husus, kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan di?...

Retina, göz içinde ışığı nöral sinyallere dönüştürmek için birlikte çalışan birkaç özel hücre katmanından oluşur. Retina görmede kritik bir rol oynadığından, yapısını ve işlevini anlamak, diğerlerinin yanı sıra makula dejenerasyonu ve diyabetik retinopati gibi görme kaybının en yaygın nedenlerinden bazıları hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Tavşanlar, diğer modellere kıyasla çeşitli avantajlar sundukları için retina araştırmalarında uygun bir hayvan modeli olarak hizmet eder. Tavşan gözleri anatomik olarak insan gözlerine nispeten benzer 1,2. Örneğin, tavşanlar, insanlardaki foveaya benzer şekilde, yatay görsel çizgi olarak bilinen artmış bir fotoreseptör yoğunluğu alanına sahiptir. Kemirgenler gibi yaygın olarak kullanılan diğer hayvan modellerinin anatomik bir eşdeğeri yoktur. Ek olarak, kemirgenlerle karşılaştırıldığında, tavşanlardaki retina damar sistemi insanlardakine oldukça benzer. Tavşan gözleri de nispeten büyüktür. Bu, onları vitreus veya retina içinde ilaç uygulamasını veya cerrahi müdahaleyi içeren çalışmalar için özellikle uygun hale getirir, aksi takdirde daha küçük bir gözde zor veya imkansız olabilir3.
İmmünohistokimya (IHC), bir doku içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve retina araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir 4,5,6. Retina hassas bir yapı olduğundan, IHC ile faydalı sonuçlar elde etmek dikkatli bir doku işlemi gerektirir. Retina dekolmanı ve retina kırılmaları veya kıvrımları gibi diğer doku artefaktları genellikle işleme sırasında ortaya çıkar ve sonuçların yorumlanmasını engelleyebilir. Başarılı işleme, doku manipülasyonu, fiksasyonun türü ve süresi, gömme ortamının türü ve kesit alma teknikleri 7,8,9,10 dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Retina araştırmalarında tavşanların bir hayvan modeli olarak kullanılmasının avantajlarına rağmen, tavşan retinasının başarılı doku işlemesini tanımlayan çok az protokol mevcuttur. Bu makale, IHC'de kullanılmak üzere bütün tavşan gözlerinden yüksek kaliteli retina kesitleri elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklamaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-106</td>
			<td>For fixation and cryoprotection (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Cover</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SOX2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2018</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-profile disposable cryostat blades</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>14035838926</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td>Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-RPE65</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NB100-355SS</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>167117</td>
			<td>Used for cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td>Used as embedding mold (step 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 15</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Used as embedding media (step 6)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eye 

Bu protokol, tavşanlar gibi daha büyük hayvanlarda yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonların nasıl elde edileceğini açıklar. Enükleasyondan sonra, göz kısa bir süre fiksatife daldırılır. Daha sonra kornea ve iris çıkarılır ve göz 4 °C'de ek fiksasyon için gece boyunca bırakılır. Sabitlemeyi takiben lens çıkarılır. Göz daha sonra bir kriyokalıba yerleştirilir ve bir gömme ortamı ile doldurulur. Lensi çıkararak, gömme ortamı vitreusa daha iyi erişebilir ve daha iyi retina stabilitesine yol açar. Daha da önemlisi, vitreus boyunca tam sızmaya izin vermek için göz gece boyunca gömme ortamında inkübe edilmelidir. Gece boyunca inkübasyondan sonra göz kuru buz üzerinde dondurulur ve kesitlere ayrılır. İmmünohistokimyada kullanılmak üzere tüm retina kesitleri elde edilebilir. Retina dokusu içindeki antijenlerin lokalizasyonunu incelemek için standart boyama protokolleri kullanılabilir. Bu protokole uyulması, immünohistokimya kullanan herhangi bir deneyde kullanılabilecek yüksek kaliteli retinal kriyoseksiyonlar ile sonuçlanır.

The retina is composed of several layers of specialized cells within the eye that together work to convert light into neural signals. Because the retina plays a critical role in vision, understanding its structure and function can provide valuable insights into some of the most common causes of vision loss such as macular degeneration and diabetic retinopathy, among others.
Rabbits serve as a convenient animal model in retinal research as they offer several advantages compared to other models. Rabbit eyes are relatively similar in anatomy to human eyes1,2. For example, rabbits have an area of increased photoreceptor density, known as the horizontal visual streak, that is analogous to the fovea in humans. Other commonly used animal models, such as rodents, do not have an anatomic equivalent. In addition, compared to rodents, the retinal vasculature in rabbits is fairly similar to that in humans. Rabbit eyes are relatively large as well. This makes them particularly suitable for studies that involve drug administration or surgical intervention within the vitreous or retina that may otherwise be difficult or impossible in a smaller eye3.
Immunohistochemistry (IHC) is a widely used technique to study the localization of antigens within a tissue and has broad applications in retinal research4,5,6. Because the retina is a delicate structure, obtaining useful results via IHC requires careful tissue processing. Retinal detachment and other tissue artifacts such as retinal breaks or folds commonly occur during processing and may interfere with the interpretation of results. Successful processing depends on a variety of factors, including tissue manipulation, type and duration of fixation, type of embedding media, and sectioning techniques7,8,9,10. Despite the advantages of using rabbits as an animal model in retinal research, very few protocols describing successful tissue processing of the rabbit retina exist. This paper describes a reliable method for obtaining high-quality retinal sections from whole rabbit eyes for use in IHC.

Yazar Spotlight: Tavşan Modellerinde İmmünohistokimya için Retina Dokusu İşlemesinin Optimize Edilmesi

Bütün tavşan gözünün yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarının elde edilmesi 

Our research focuses on novel approaches to regenerating the retinal pigment epithelium. Dysfunction of the retinal pigment epithelium is thought to play a central role in the pathophysiology of many eye diseases, such as macular degeneration, so regenerating this layer of cells is attractive from a therapeutic standpoint. Visualizing the structural anatomy of the retina via immunohistochemistry has wide applications in retinal research.In our laboratory, we found obtaining useful results from rabbit eyes, difficult due to tissue artifacts like retinal attachments and retinal folds. Despite these challenges, there are very few protocols existing that describe successful tissue processing of rabbit retina. This protocol makes several important modifications to standard tissue processing techniques that result in excellent tissue sections of the rabbit retina.This study may allow researchers to obtain better results from their research that involves the use of immunohistochemistry in rabbit models.

Doku işlemeden sonra, retina içindeki herhangi bir sayıda biyolojik süreci araştırmak için standart bir immünofloresan protokolü kullanılabilir. Şekil 3A-C, konfokal mikroskopi ile elde edilen bir retina bölümünün temsili floresan görüntülerini göstermektedir. Retina bölümü daha önce tarif edilen bir protokol12'ye göre immün boyandı.
Şekil 3A-...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Optimizing Retinal Tissue Processing for Immunohistochemistry in Rabbit Models at JoVE.com

Bu protokol, bütün tavşan gözlerinin yüksek kaliteli kriyoseksiyonlarını elde etmek için güvenilir bir yöntemi açıklar. Daha büyük gözlerde immünohistokimya kullanan herhangi bir çalışmada kullanım için kolayca uyarlanabilen tavşan gözü diseksiyonu, fiksasyonu, gömme ve kesit alma prosedürlerini detaylandırır.

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

Araştırmamız, retina pigment epitelinin yenilenmesine yönelik yeni yaklaşımlara odaklanmaktadır. Retina pigment epitelinin disfonksiyonunun, makula dejenerasyonu gibi birçok göz hastalığının patofizyolojisinde merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir, bu nedenle bu hücre tabakasının yenilenmesi terapötik açıdan çekicidir. İmmünohistokimya yoluyla retinanın yapısal anatomisinin görüntülenmesi, retina araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir.Laboratuvarımızda, retina ekleri ve retina kıvrımları gibi doku artefaktları nedeniyle tavşan gözlerinden faydalı sonuçlar elde etmenin zor olduğunu gördük. Bu zorluklara rağmen, tavşan retinasının başarılı doku işlemesini tanımlayan çok az protokol mevcuttur. Bu protokol, tavşan retinasının mükemmel doku kesitleri ile sonuçlanan standart doku işleme tekniklerinde birkaç önemli değişiklik yapar.Bu çalışma, araştırmacıların tavşan modellerinde immünohistokimyanın kullanımını içeren araştırmalarından daha iyi sonuçlar elde etmelerini sağlayabilir.

obtaining-high-quality-cryosections-of-whole-rabbit-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye 

1.1K Görüntüleme.  University of Southern California. Araştırmamız, retina pigment epitelinin yenilenmesine yönelik yeni yaklaşımlara odaklanmaktadır. Retina pigment epitelinin disfonksiyonunun, makula dejenerasyonu gibi birçok göz hastalığının patofizyolojisinde merkezi bir rol oynadığı düşünülmektedir, bu nedenle bu hücre tabakasının yenilenmesi terapötik açıdan çekicidir. İmmünohistokimya yoluyla retinanın yapısal anatomisinin görüntülenmesi, retina araştırmalarında geniş uygulamalara sahiptir.Labo...