Obrigado a Rosanna Calderon, Dominic Shayler e Rosa Sierra pelo aconselhamento técnico. Este estudo foi apoiado em parte por uma doação irrestrita ao Departamento de Oftalmologia da USC Keck School of Medicine de Pesquisa para Prevenir a Cegueira (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira de Pesquisa para Prevenir a Cegueira (AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), e a Fundação Memorial Edward N. e Della L. Thome (AN, KG).

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia. Quatorze (n = 14) coelhos com cinto holandês entre 4 e 6 meses de idade foram utilizados no desenvolvimento deste protocolo. Foram utilizados animais machos e fêmeas. Todos os animais pesavam entre 2,0 e 2,5 kg. Todos os animais foram alojados individualmente. Uma lista de materiais e equipamentos recomendados pode ser encontrada na Tabela de Materiais.
1. Preparação
<ol><li>Preparação do fixador.<ol><li>Prepare paraformaldeído (PFA) a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). No mínimo, são necessários 50 mL de fixador por olho.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação de agente crioprotetor.<ol><li>Prepare 30% em peso por volume (p / v) de sacarose em PBS. Coloque em uma coqueteleira por pelo menos 15 minutos para garantir que a sacarose esteja completamente dissolvida. No mínimo, são necessários 50 mL de agente crioprotetor por olho.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparação do instrumento de dissecação.<ol><li>Reúna dois pares de pinças, uma tesoura curva, uma lâmina de bisturi e uma placa de dissecção de 100 mm e coloque-os perto de um microscópio de dissecação. Um exemplo de configuração é mostrado na Figura 1A.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fixação inicial
<ol><li>Após a enucleação transconjuntival11, coloque imediatamente o olho em pelo menos 50 mL de PFA a 4% em PBS no gelo. Certifique-se de que o olho esteja completamente submerso. Se as bolhas de ar se acumularem na superfície externa do olho, remova-as agitando suavemente.</li>
</ol>3. Remoção da córnea e da íris
<ol><li>Após 15 min, remova o olho de PFA a 4% em PBS e coloque-o em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Encha o prato com PBS para evitar que o olho seque.</li>
	<li>Remova a córnea.<ol><li>Comece fazendo uma incisão com uma lâmina cirúrgica 1 mm anterior ao limbo, paralela ao plano da íris para evitar perfurar acidentalmente as estruturas subjacentes (Figura 1B).</li>
		<li>Insira uma tesoura curva na incisão inicial e continue cortando circunferencialmente, permanecendo a 1 mm do limbo. Use uma pinça para estabilizar o olho durante o corte (Figura 1C).</li>
		<li>Quando o corte circunferencial estiver concluído, remova a córnea com uma pinça e limpe suavemente o excesso de PBS com um lenço de laboratório. Coloque a córnea em solução de sacarose a 30% em temperatura ambiente (RT) para crioproteção ou descarte. A crioproteção é completa quando a córnea afunda, o que normalmente leva menos de 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Remova a íris.<ol><li>Comece fazendo um corte inicial com uma tesoura curva através da íris. Separe completamente a íris do resto do tecido cortando circunferencialmente semelhante à remoção da córnea (Figura 1D).</li>
		<li>Quando o corte circunferencial estiver concluído, remova a íris com uma pinça e limpe suavemente o excesso de PBS com um lenço de laboratório. Coloque a íris em solução de sacarose a 30% em RT para crioproteção ou descarte como acima. A crioproteção é completa quando a íris afunda, o que normalmente leva menos de 30 minutos.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Conclusão da fixação
<ol><li>Com a córnea e a íris removidas, coloque o olho em pelo menos 50 mL de PFA a 4% recém-preparado em PBS e coloque-o em um shaker para agitação suave. Certifique-se de que o olho permaneça submerso durante a agitação.</li>
	<li>Fique de olho em 4% de PFA em PBS a 4 ° C durante a noite. NOTA: Descobrimos que o PFA a 4% resulta em excelente coloração IHC se usado entre 16 h e 24 h a 4 ° C, com durações de fixação mais longas, resultando em aumento da coloração de fundo inespecífica e mascaramento de epítopos.</li>
</ol>5. Remoção da lente
<ol><li>Na manhã seguinte, remova o olho do PFA a 4% em PBS e coloque-o em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Encha o prato com PBS para evitar que o olho seque.</li>
	<li>Remova a lente.<ol><li>Comece segurando cuidadosamente a cápsula anterior do cristalino com uma pinça. NOTA: Tenha muito cuidado para não empurrar ou puxar com força a lente com a pinça, pois isso pode criar um descolamento de retina.</li>
		<li>Insira cuidadosamente a tesoura na câmara posterior com as lâminas curvadas posteriormente ao longo da lente. Faça um corte inicial nas zônulas da lente com uma tesoura curva. NOTA: Tenha muito cuidado para não empurrar ou puxar com força as zônulas com a tesoura, pois isso pode criar um descolamento de retina (Figura 1E).</li>
		<li>Continue a fazer pequenos cortes nas zônulas da lente em um padrão circunferencial. Faça de três a cinco cortes por hora.</li>
		<li>Para verificar se a lente está separada do resto do tecido, segure suavemente a cápsula anterior da lente com uma pinça e tente levantá-la suavemente. Se a lente não levantar imediatamente, não tente puxar mais, pois isso pode criar um descolamento de retina. Em vez disso, faça mais cortes nas zônulas restantes da lente e tente novamente.</li>
		<li>Depois de separado do resto do tecido, coloque o cristalino em solução de sacarose a 30% em RT para crioproteção ou descarte como acima. A crioproteção é completa quando a lente afunda, o que normalmente leva algumas horas.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque o olho em pelo menos 50 mL de sacarose a 30% em PBS a 4 ° C para crioproteção. A crioproteção é completa quando o olho afunda, o que normalmente leva de 24 a 48 horas. Para acelerar a crioproteção, troque a solução inicial de sacarose por uma nova após 8-12 h e/ou mantenha o olho na solução de sacarose em RT.</li>
</ol>6. Incorporação
<ol><li>Quando a crioproteção estiver completa, remova o olho da solução de sacarose a 30% e coloque-o em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Vire cuidadosamente o olho para que fique voltado para baixo para remover o excesso de solução de sacarose da parte interna do olho. NOTA: Não tente remover o excesso de solução da parte interna do olho com um lenço de laboratório, pois o lenço pode grudar no corpo vítreo e resultar em um descolamento de retina.</li>
	<li>Com o olho voltado para baixo, limpe suavemente o excesso de solução de sacarose da parte externa do olho com um lenço.</li>
	<li>Encha um molde de incorporação descartável com composto de temperatura de corte ideal (OCT) a uma profundidade de 0,5-1,0 cm. NOTA: Esta base garante que o olho não toque na parte inferior do molde, o que interfere na criossecção posterior.</li>
	<li>Coloque o olho no molde de incorporação descartável voltado para cima. Encha lentamente a parte interna do olho com OCT, tomando cuidado especial para evitar a formação de bolhas dentro do olho. Se as bolhas se formarem, remova-as com cuidado ou empurre-as para a borda do molde usando uma pinça.</li>
	<li>Termine de encher o molde de incorporação descartável com OCT. Certifique-se de que o olho esteja completamente submerso em OCT e não esteja tocando as superfícies internas do molde ou exposto ao ar. Enrole o molde de incorporação descartável contendo o olho em OCT em parafilme; colocar a 4 °C durante a noite. NOTA: Em nossa experiência, períodos de incubação mais curtos não permitem que a OCT se infiltre completamente no vítreo. Como resultado, uma camada de sacarose geralmente permanece entre a retina e a OCT. Quando isso ocorre, a retina geralmente se desprende ou se desprende completamente do resto do tecido durante a criossecção, pois a sacarose congelada provavelmente fornece menos suporte estrutural do que a OCT congelada, dificultando ou mesmo impossibilitando a obtenção de seções de alta qualidade.</li>
	<li>Na manhã seguinte, colocar o molde de inclusão contendo o olho na OCT em uma placa de dissecção de 100 mm sob um microscópio de dissecação. Confirme se a membrana hialoide posterior parece levantada para cima da retina interna. NOTA: Este levantamento para cima pode obscurecer a visão da retina, dificultando a determinação da orientação.</li>
	<li>Para determinar melhor a orientação do olho, segure cuidadosamente a membrana hialóide posterior anteriormente e tente retirá-la com uma pinça para expor a retina subjacente durante a OCT. NOTA: Às vezes, o canal hialóide pode ser visível, que se liga à cabeça do nervo óptico e pode ser usado para fins de orientação, uma vez que a cabeça do nervo óptico está localizada na porção superior da retina (Figura 2A). Não é necessário remover completamente a membrana hialóide posterior, pois a OCT já se infiltrou no corpo vítreo para revestir a retina interna e qualquer membrana remanescente não afetará a criossecção (Figura 2B). A membrana hialoide posterior só deve ser removida para orientação, se necessário. Outras opções para determinar a orientação incluem a colocação de uma sutura ou outro tipo de marca antes da enucleação.</li>
	<li>Transfira o olho para um novo molde de incorporação com a nova OCT preenchida a uma profundidade de 0.5-1.0 cm e, em seguida, preencha com a nova OCT conforme as etapas 6.3-6.5 para garantir que o meio de incorporação final esteja livre de detritos e/ou outras imperfeições que possam ter se acumulado durante a noite. Se possível, remova suavemente a OCT com um pano de dentro do olho também, embora isso não seja necessário.</li>
	<li>Rotule o molde para fins de orientação (Figura 2C). Orientar o olho com o olho voltado para cima no molde criogênico garante que a OCT revestirá a retina interna. O canal hialóide, que se liga à cabeça do nervo óptico, é um marco importante para determinar a parte superior do olho (Figura 2A).</li>
	<li>Coloque o molde de incorporação rotulado contendo o olho em OCT em cima do gelo seco. Certifique-se de que o olho não esteja tocando em nenhuma das superfícies internas do molde de incorporação ou exposto ao ar. Certifique-se de que o molde esteja tocando diretamente o gelo seco para acelerar o processo de congelamento (Figura 2D).</li>
	<li>Transferir o olhal embebido para um congelador a -80 °C ou directamente para o criostato para seccionamento (figura 2E).</li>
</ol>7. Crioseccionamento
<ol><li>Monte o bloco com a parte superior do olho voltada para cima e a parte inferior do olho voltada para inferiormente, com a córnea e a íris restantes voltadas para a direita (como na Figura 2E) ou para a esquerda (não mostrada). Como alternativa, monte o bloco com uma orientação diferente, conforme desejado. Se necessário, quebre o molde para mobilizar o bloco, quebrando cuidadosamente cada lado do molde, um de cada vez, e marcando o bloco diretamente para não perder a orientação do olho.</li>
	<li>Deixe o bloco se equilibrar à temperatura dentro do criostato por 30-60 min; -20 °C é um bom ponto de partida.</li>
	<li>Uma vez montada, coloque uma lâmina nova no ângulo desejado, normalmente paralelo ao eixo vertical do olho.</li>
	<li>Defina a espessura da seção conforme desejado: seções de 10-20 μm de espessura são um bom ponto de partida. Um exemplo de uma seção de 14 μm de espessura é demonstrado na Figura 3A-C.<ol><li>De maneira lenta e controlada, comece a seccionar o bloco. Certifique-se de que a lâmina está cortando o bloco paralelamente ao eixo vertical do olho. Caso contrário, ajuste o ângulo em que a lâmina entra em contato com o bloco ou a orientação do estágio de acordo.</li>
		<li>Ao seccionar o bloco, evite enrugar ou enrolar a seção com um pincel. Vire rapidamente a seção e aplique uma leve pressão para baixo com uma escova de pêlo comprido para achatar a seção e minimizar o enrugamento ou ondulação. Faça um pincel separado com uma ponta pontiaguda para ajudar na manipulação da seção.</li>
	</ol></li>
	<li>Prenda a seção a uma lâmina de vidro carregada movendo lentamente a corrediça voltada para baixo em direção à seção. Evite que a seção se dobre sobre si mesma ou se distorça durante a fixação, rolando suavemente a lâmina de vidro sobre a seção. NOTA: Não passe o slide diretamente sobre a seção ou pressione-o contra a seção, pois isso pode danificar ou distorcer a seção.</li>
	<li>Deixar as lâminas secarem durante a noite antes de as transferirem para um congelador a -80 °C ou de seguirem directamente para um protocolo de imunofluorescência normalizado.</li>
</ol>

Dissecção e criossecção de olho de coelho para estudos de imuno-histoquímica

<ol>
	<li>Peiffer, R. L., Pohm-Thorsen, L., Corcoran, K., Manning, P. J., Ringler, D. H., Newcomer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+19-Models+in+ophthalmology+and+vision+research.">Chapter 19-Models in ophthalmology and vision research.</a> American College of Laboratory Animal Medicine, The Biology of the Laboratory Rabbit. , 409-433 (1994).</li><li>Davis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anatomy+and+histology+of+the+eye+and+orbit+of+the+rabbit.">The anatomy and histology of the eye and orbit of the rabbit.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 27, 400.2-441 (1929).</li><li>Zernii, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+models+of+ocular+diseases:+New+relevance+for+classical+approaches.">Rabbit models of ocular diseases: New relevance for classical approaches.</a> CNS &amp; Neurological Disorders Drug Targets. 15 (3), 267-291 (2016).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labelled+antigens+and+antibodies.">Labelled antigens and antibodies.</a> Annu Rev Microbiol. 8, 333-352 (1954).</li><li>Coons, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+antibodies+as+histochemical+tools.">Fluorescent antibodies as histochemical tools.</a> Fed Proc. 10 (2), 558-559 (1951).</li><li>Coons, A. H., Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+antigen+in+tissue+cells;+improvements+in+a+method+for+the+detection+of+antigen+by+means+of+fluorescent+antibody.">Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody.</a> J Exp Med. 91 (1), 1-13 (1950).</li><li>Pang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step-by-step+preparation+of+mouse+eye+sections+for+routine+histology,+immunofluorescence,+and+RNA+in+situ+hybridization+multiplexing.">Step-by-step preparation of mouse eye sections for routine histology, immunofluorescence, and RNA in situ hybridization multiplexing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100879 (2021).</li><li>Sorden, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+background+and+procedure-related+microscopic+findings+and+common+artifacts+in+ocular+tissues+of+laboratory+animals+in+ocular+studies.">Spontaneous background and procedure-related microscopic findings and common artifacts in ocular tissues of laboratory animals in ocular studies.</a> Toxicol Pathol. 49 (3), 569-580 (2021).</li><li>Margo, C. E., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fixation+of+whole+eyes:+the+role+of+fixative+osmolarity+in+the+production+of+tissue+artifact.">Fixation of whole eyes: the role of fixative osmolarity in the production of tissue artifact.</a> Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 233 (6), 366-370 (1995).</li><li>Chatterjee, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Artefacts+in+histopathology.">Artefacts in histopathology.</a> J Oral Maxillofac Pathol. 18 (Suppl 1), S111-S116 (2014).</li><li>Mitchell, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enucleation+in+companion+animals.">Enucleation in companion animals.</a> Ir Vet J. 61 (2), 108-114 (2008).</li><li>Kastan, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+inhibitor+of+Lats+kinases+to+promote+regeneration+of+mammalian+organs.">Development of an improved inhibitor of Lats kinases to promote regeneration of mammalian organs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2206113119 (2022).</li><li>Baiza-Dur&#225;n, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+evaluation+after+repeated+intravitreal+injections+of+a+humanized+anti-VEGF-A+monoclonal+antibody+(PRO-169)+versus+ranibizumab+in+New+Zealand+white+rabbits.">Safety and tolerability evaluation after repeated intravitreal injections of a humanized anti-VEGF-A monoclonal antibody (PRO-169) versus ranibizumab in New Zealand white rabbits.</a> Int J Retina Vitreous. 6, 32 (2020).</li><li>Yu, D. Y., Cringle, S. J., Su, E., Yu, P. K., Humayun, M. S., Dorin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-induced+changes+in+intraretinal+oxygen+distribution+in+pigmented+rabbits.">Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 988-999 (2005).</li><li>Faude, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilitation+of+artificial+retinal+detachment+for+macular+translocation+surgery+tested+in+rabbit.">Facilitation of artificial retinal detachment for macular translocation surgery tested in rabbit.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 42 (6), 1328-1337 (2001).</li></ol>

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Antes de implementar o protocolo acima, enfrentamos consistentemente dificuldades com o processamento tecidual de olhos de coelho para IHQ. Adaptamos vários protocolos dos olhos de animais menores, como camundongos, mas descobrimos que eles levavam a uma fixação inadequada e dificuldade de seccionamento do tecido. Existem várias considerações importantes que permitem seções consistentes e de alta qualidade da retina do coelho.
Uma consideração é o grande tamanho do globo do coelho e...

A retina é composta por várias camadas de células especializadas dentro do olho que, juntas, trabalham para converter a luz em sinais neurais. Como a retina desempenha um papel crítico na visão, entender sua estrutura e função pode fornecer informações valiosas sobre algumas das causas mais comuns de perda de visão, como degeneração macular e retinopatia diabética, entre outras.
Os coelhos servem como um modelo animal conveniente na pesquisa da retina, pois oferecem várias vantagens em comparação com outros modelos. Os olhos de coelho são relativamente semelhantes em anatomia aos olhos humanos 1,2. Por exemplo, os coelhos têm uma área de densidade aumentada de fotorreceptores, conhecida como faixa visual horizontal, que é análoga à fóvea em humanos. Outros modelos animais comumente usados, como roedores, não têm um equivalente anatômico. Além disso, em comparação com os roedores, a vasculatura da retina em coelhos é bastante semelhante à dos humanos. Os olhos do coelho também são relativamente grandes. Isso os torna particularmente adequados para estudos que envolvem administração de medicamentos ou intervenção cirúrgica no vítreo ou na retina que, de outra forma, poderiam ser difíceis ou impossíveis em um olho menor3.
A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica amplamente utilizada para estudar a localização de antígenos dentro de um tecido e tem amplas aplicações na pesquisa da retina 4,5,6. Como a retina é uma estrutura delicada, a obtenção de resultados úteis via IHC requer um processamento cuidadoso do tecido. O descolamento de retina e outros artefatos teciduais, como quebras ou dobras da retina, geralmente ocorrem durante o processamento e podem interferir na interpretação dos resultados. O processamento bem-sucedido depende de uma variedade de fatores, incluindo manipulação do tecido, tipo e duração da fixação, tipo de meio de incorporação e técnicas de seccionamento 7,8,9,10. Apesar das vantagens de usar coelhos como modelo animal na pesquisa da retina, existem muito poucos protocolos que descrevem o processamento bem-sucedido do tecido da retina do coelho. Este artigo descreve um método confiável para obter seções retinianas de alta qualidade de olhos inteiros de coelho para uso em IHQ.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353025</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>28-106</td>
			<td>For fixation and cryoprotection (step 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1850</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi 2000-C</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat 488</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse 555</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A-31570</td>
			<td>Diluted 1:1,000 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91150-20</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Slide Cover</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48404-453</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-SOX2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2018</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-profile disposable cryostat blades</td>
			<td>Leica Microsystems Inc.</td>
			<td>14035838926</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>06-666-A</td>
			<td>Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-RPE65</td>
			<td>Novus Bio</td>
			<td>NB100-355SS</td>
			<td>Diluted 1:100 in blocking buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OmniPur Sucrose</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>167117</td>
			<td>Used for cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 20% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15713</td>
			<td>Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep)</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>18646A</td>
			<td>Used as embedding mold (step 6)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline, 1x</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-030-CV</td>
			<td>Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade no. 15</td>
			<td>Feather</td>
			<td>08-916-5D</td>
			<td>Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td>For cryosectioning (step 7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td>Used as embedding media (step 6)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eye 

Este protocolo descreve como obter criossecções retinianas de alta qualidade em animais maiores, como coelhos. Após a enucleação, o olho é brevemente imerso no fixador. Em seguida, a córnea e a íris são removidas e o olho é deixado durante a noite para fixação adicional a 4 °C. Após a fixação, a lente é removida. O olho é então colocado em um criomold e preenchido com um meio de inclusão. Ao remover a lente, o meio de incorporação tem melhor acesso ao vítreo e leva a uma melhor estabilidade da retina. É importante ressaltar que o olho deve ser incubado em meio de incorporação durante a noite para permitir a infiltração completa em todo o vítreo. Após a incubação durante a noite, o olho é congelado em gelo seco e seccionado. Cortes retinianos inteiros podem ser obtidos para uso em imuno-histoquímica. Protocolos de coloração padrão podem ser utilizados para estudar a localização de antígenos no tecido retiniano. A adesão a este protocolo resulta em criossecções retinianas de alta qualidade que podem ser usadas em qualquer experimento que utilize imuno-histoquímica.

The retina is composed of several layers of specialized cells within the eye that together work to convert light into neural signals. Because the retina plays a critical role in vision, understanding its structure and function can provide valuable insights into some of the most common causes of vision loss such as macular degeneration and diabetic retinopathy, among others.
Rabbits serve as a convenient animal model in retinal research as they offer several advantages compared to other models. Rabbit eyes are relatively similar in anatomy to human eyes1,2. For example, rabbits have an area of increased photoreceptor density, known as the horizontal visual streak, that is analogous to the fovea in humans. Other commonly used animal models, such as rodents, do not have an anatomic equivalent. In addition, compared to rodents, the retinal vasculature in rabbits is fairly similar to that in humans. Rabbit eyes are relatively large as well. This makes them particularly suitable for studies that involve drug administration or surgical intervention within the vitreous or retina that may otherwise be difficult or impossible in a smaller eye3.
Immunohistochemistry (IHC) is a widely used technique to study the localization of antigens within a tissue and has broad applications in retinal research4,5,6. Because the retina is a delicate structure, obtaining useful results via IHC requires careful tissue processing. Retinal detachment and other tissue artifacts such as retinal breaks or folds commonly occur during processing and may interfere with the interpretation of results. Successful processing depends on a variety of factors, including tissue manipulation, type and duration of fixation, type of embedding media, and sectioning techniques7,8,9,10. Despite the advantages of using rabbits as an animal model in retinal research, very few protocols describing successful tissue processing of the rabbit retina exist. This paper describes a reliable method for obtaining high-quality retinal sections from whole rabbit eyes for use in IHC.

Autor em destaque: Otimizando o processamento do tecido retiniano para imuno-histoquímica em modelos de coelhos

Obtenção de criosecções de alta qualidade de olho de coelho inteiro 

Our research focuses on novel approaches to regenerating the retinal pigment epithelium. Dysfunction of the retinal pigment epithelium is thought to play a central role in the pathophysiology of many eye diseases, such as macular degeneration, so regenerating this layer of cells is attractive from a therapeutic standpoint. Visualizing the structural anatomy of the retina via immunohistochemistry has wide applications in retinal research.In our laboratory, we found obtaining useful results from rabbit eyes, difficult due to tissue artifacts like retinal attachments and retinal folds. Despite these challenges, there are very few protocols existing that describe successful tissue processing of rabbit retina. This protocol makes several important modifications to standard tissue processing techniques that result in excellent tissue sections of the rabbit retina.This study may allow researchers to obtain better results from their research that involves the use of immunohistochemistry in rabbit models.

Após o processamento do tecido, um protocolo de imunofluorescência padrão pode ser utilizado para investigar qualquer número de processos biológicos dentro da retina. A Figura 3A-C ilustra imagens de fluorescência representativas de uma seção da retina obtidas por microscopia confocal. A secção retiniana foi imunomarcada de acordo com um protocolo previamentedescrito12.
As seções retinianas repr...

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Este protocolo descreve um método confiável para obter criosseções de alta qualidade de olhos inteiros de coelho. Ele detalha os procedimentos de dissecção, fixação, incorporação e seccionamento do olho do coelho, que podem ser facilmente adaptados para uso em qualquer estudo que utilize imuno-histoquímica em olhos maiores.

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed ...

Nossa pesquisa se concentra em novas abordagens para regenerar o epitélio pigmentar da retina. Acredita-se que a disfunção do epitélio pigmentar da retina desempenhe um papel central na fisiopatologia de muitas doenças oculares, como a degeneração macular, portanto, regenerar essa camada de células é atraente do ponto de vista terapêutico. A visualização da anatomia estrutural da retina por meio da imuno-histoquímica tem amplas aplicações na pesquisa da retina.Em nosso laboratório, encontramos a obtenção de resultados úteis de olhos de coelho, difíceis devido a artefatos de tecido como anexos de retina e dobras retinianas. Apesar desses desafios, existem muito poucos protocolos existentes que descrevem o processamento bem-sucedido de tecidos da retina de coelhos. Este protocolo faz várias modificações importantes nas técnicas padrão de processamento de tecidos que resultam em excelentes seções de tecido da retina do coelho.Este estudo pode permitir que os pesquisadores obtenham melhores resultados de suas pesquisas que envolvem o uso de imuno-histoquímica em modelos de coelhos.

obtaining-high-quality-cryosections-of-whole-rabbit-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye 

1.1K visualizações.  University of Southern California. Nossa pesquisa se concentra em novas abordagens para regenerar o epitélio pigmentar da retina. Acredita-se que a disfunção do epitélio pigmentar da retina desempenhe um papel central na fisiopatologia de muitas doenças oculares, como a degeneração macular, portanto, regenerar essa camada de células é atraente do ponto de vista terapêutico. A visualização da anatomia estrutural da retina por meio da imuno-histoquímica tem amplas aplicações na pesquisa da retina.Em nosso l...

Vídeo: Autor em destaque: Otimizando o processamento do tecido retiniano para imuno-histoquímica em modelos de coelhos

This protocol describes how to obtain high-quality retinal cryosections in larger animals, such as rabbits. After enucleation, the eye is briefly immersed in the fixative. Then, the cornea and iris are removed and the eye is left overnight for additional fixation at 4 &#176;C. Following fixation, the lens is removed. The eye is then placed in a cryomold and filled with an embedding medium. By removing the lens, the embedding medium has better access to the vitreous and leads to better retinal stability. Importantly, the eye should be incubated in embedding medium overnight to allow complete infiltration throughout the vitreous. Following overnight incubation, the eye is frozen on dry ice and sectioned. Whole retinal sections may be obtained for use in immunohistochemistry. Standard staining protocols may be utilized to study the localization of antigens within the retinal tissue. Adherence to this protocol results in high-quality retinal cryosections that may be used in any experiment utilizing immunohistochemistry.

This protocol describes a reliable method for obtaining high-quality cryosections of whole rabbit eyes. It details rabbit eye dissection, fixation, embedding, and sectioning procedures, which may be easily adapted for use in any study utilizing immunohistochemistry in larger eyes.

Biologia

Whole Rabbit Eye Dissection and Ocular Tissue Preparation for Histological Analysis

After transconjunctival enucleation of the rabbit eye, immediately place in 50 milliliters of 4%paraformaldehyde and PBS on ice. After 15 minutes, transfer the eye to a 100 millimeter dissection dish and fill the dish with PBS to prevent the eye from drying out. Under a dissection microscope, Using a surgical blade, start making an incision one millimeter anterior to the limbus, keeping it parallel to the iris plane.Insert curved scissors into the initial incision and continue cutting circumferentially, maintaining a one millimeter distance from the limbus. Then remove the cornea with forceps and gently wipe away PBS With a laboratory wipe. Place the cornea in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection.Make an initial cut with curved scissors through the iris. Then cut circumferentially around the eye, similar to the cornea removal, to separate the iris from the rest of the tissue. Remove the iris with forceps and gently wipe away excess PBS with the laboratory wipe.Place the iris in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection. After removing the cornea and iris, place the eye in 50 milliliters of 4%paraformaldehyde and put it on a shaker for gentle agitation. Leave the eye in 4%paraformaldehyde at four degrees Celsius overnight.The next day, place the eye in a dissection dish and fill the dish with PBS. Under the dissection microscope, use forceps to carefully grasp the anterior lens capsule. Then carefully insert the scissors into the posterior chamber, orienting the blades posteriorly along the lens.Make an initial cut through the lens zonules with curved scissors. Continue making small cuts in a circumferential pattern through the lens zonules. To confirm lens removal, gently grasp the anterior lens capsule with forceps and attempt to lift it.Upon separation, place the lens in 30%sucrose solution at room temperature for cryoprotection. Place the eye in 50 milliliters of 30%sucrose and PBS at four degrees Celsius for 24 to 48 hours for cryoprotection. To expedite cryoprotection, replace the initial sucrose solution with a fresh one after eight to 12 hours.

Dissecção do olho de coelho inteiro e preparação do tecido ocular para análise histológica

Ocular Tissue Embedding and Cryosectioning in Optimal Cutting Temperature Compound for Fluorescence Imaging 

After cryo protection of the rabbit eye is complete, transfer it from a 30%sucrose solution to a 100 millimeter dissection dish. Under a dissecting microscope, carefully flip the eye to remove excess sucrose solution from the inner part of the eye. Using a wipe, gently wipe away excess sucrose solution from the outer part of the eye, fill a disposable embedding mold with optimal cutting temperature or OCT compound to a depth of 0.5 to one centimeter.Place the eye in the embedding mold facing upward and slowly fill the inner part of the eye with OCT compound, avoiding bubble formation. Once the eye is emerged in the OCT compound, and does not touch the inner surfaces of the mold, wrap the embedding mold in paraffin and store it at four degrees Celsius overnight. The next day, place the embedding mold in a dissection dish.If possible, gently remove the OCT compound from the inside of the eye with a wipe. Transfer the eye to a new embedding mold filled with fresh OCT compound. Then fill the mold as previously done to ensure the final embedding medium is free of debris or imperfections.Label the mold for orientation purposes. Position the eye upward in the cryo mold, so the OCT compound lines the inner retina. Use the optic nerve head as a landmark for determining the superior part of the eye Place the labeled embedding mold on dry ice, ensuring that the eye is not touching the inner surfaces of the mold or exposed to air.Mount the block on the cryostat with the superior part of the eye facing up and the inferior part down. With the remaining cornea and iris facing to the right or left. Position a fresh blade parallel to the vertical axis of the eye to section it.After cutting the sections and drying overnight, place a slide in a freezer at 80 degrees Celsius. The fluorescence images of a whole retinal cryosection of rabbit eye demonstrated a uniform pigmented retinal pigment epithelium layer without significant detachment from the overlying photoreceptor layer. A bright-field image of the retinal section further demonstrates intact retinal morphology of all layers.