Siamo impegnati nello studio del meccanismo di fusione delle membrane intracellulari. In questo protocollo, miriamo a realizzare le dinamiche conformazionali della proteina di fusione della membrana del reticolo endoplasmatico atlastina durante il suo ciclo di idrolisi GTP mediante smFRET. L'atlastina può esistere come monomero o dimero nel ciclo di idrolisi del GTP.
Negli esperimenti su singole molecole, è difficile trovare strategie appropriate di marcatura e immobilizzazione delle proteine, e quanto segue presenta le dinamiche conformazionali dell'atlastina durante il ciclo di idrolisi del GTP. Rispetto a bulk FRET, smFRET è in grado di monitorare con precisione le conformazioni proteiche in diversi stati di carico nucleotidico, fornendo così una visione diretta del comportamento delle molecole modulatrici. Abbiamo utilizzato smFRET per risolvere completamente il ciclo di idrolisi GTP dell'atlastina durante diverse strategie di posizione.
Riteniamo che i nostri risultati promuoveranno una maggiore dinamica conformazionale nello studio delle proteine di idrolisi GTP e forniranno nuove interpretazioni di processi biologici rari. Per pulire la superficie del vetrino coprioggetti, usa una pinzetta per raccogliere otto vetrini coprioggetti e mettili in un barattolo per colorare. Aggiungere 50 millilitri di acetone per coprire i vetrini coprioggetto e mettere il barattolo di colorazione in un pulitore a ultrasuoni per 30 minuti.
Sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte con acqua distillata e lavarli con metanolo in un pulitore a ultrasuoni. Quindi, aggiungi la soluzione di piranha al barattolo di colorazione e scaldalo in un bollitore a bagnomaria a 95 gradi Celsius per due ore. Dopo aver raffreddato il barattolo a temperatura ambiente, sciacquare i vetrini coprioggetti sei volte con acqua distillata due volte.
Aggiungere la soluzione di metossido di sodio nel barattolo di colorazione e metterla nel pulitore a ultrasuoni per 15 minuti. Dopo aver risciacquato i vetrini coprioggetti con acqua, aggiungere acqua distillata doppia al barattolo di colorazione e metterlo nel pulitore a ultrasuoni per 15 minuti. Fissare i vetrini coprioggetti nel barattolo di colorazione e asciugarli con azoto.
Trasferisci i vetrini coprioggetto essiccati in un altro barattolo di colorazione e cuoci il barattolo in un forno di essiccazione a 120 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, raffreddare il barattolo a temperatura ambiente in un essiccatore. Aggiungere 47,5 millilitri di metanolo, 2,5 millilitri di acido acetico e 0,5 millilitri di trietossisilano in un becher e mescolare uniformemente.
Trasferire la miscela nel barattolo di colorazione e incubare per 10 minuti. Sciacquare i vetrini coprioggetti tre volte con acqua distillata nel barattolo di colorazione e sonicare per cinque minuti. Dopo aver sciacquato i vetrini coprioggetti con acqua e averli asciugati con azoto come dimostrato, posizionare i vetrini coprioggetti in una capsula di Petri di 10 centimetri di diametro.
Sciogliere SVA-mPEG e SVA-mPEG-Biotina nella soluzione ad alto contenuto di sale in un rapporto di 1:100. Far cadere la miscela preparata su un vetrino coprioggetti e coprirlo con un altro vetrino coprioggetti. Incubare i vetrini coprioggetti con un'umidità adeguata per due ore o durante la notte.
Dopo la modifica, separare i vetrini, sciacquarli con acqua deionizzata e asciugare con azoto. Posizionare con cura il vetrino coprioggetti modificato in un tubo da 50 millilitri. Dopo aver purificato il dominio GTPasi della proteina dinamina atlastina o ATL espressa nelle cellule di Rosetta E.coli, cambiare il tampone proteico con il tampone di biotinilazione proteica utilizzando un filtro centrifugo da 10 kilodalton.
Per la biotinilazione delle proteine, mescolare 100 microlitri ciascuno di ATP da 100 millimolari, 100 millimolari di acetato di magnesio e 500 micromolari di D-biotina, 10 microlitri di biotina ligasi BirA da 100 micromolari e 50 micromolari di proteine fino a un volume finale di un millilitro. Incubare la miscela per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, rimuovere la D-biotina libera utilizzando un filtro centrifugo di taglio del peso molecolare da 10 kilodalton.
Incubare 20 microlitri di proteina biotinilata con 20 microlitri di streptavidina 15-micromolare per 20 minuti con ghiaccio. Rileva l'efficienza della biotinilazione delle proteine utilizzando SDS-PAGE. Sciogliere i fluorofori LD555 e LD655 in dimetilsolfossido a una concentrazione finale di cinque millimolari.
Per preparare il tampone di marcatura, mescolare 25 millimolari di HEPES, 150 millimolari di cloruro di potassio e cinque millimolari di cloruro di magnesio. Sostituire il tampone proteico con il tampone di marcatura utilizzando un filtro centrifugo da 10 kilodalton. Per i saggi intramolecolari smFRET, miscelare ATL1cyto-TK con LD555 e LD655 in un rapporto di 1:1,2:1,2 per un volume finale di 100 microlitri.
Incubare la miscela per cinque ore a quattro gradi Celsius. Per i saggi intermolecolari smFRET, incubare ATL1cyto-K con LD555 e ATL1cyto-K biotinilato con LD655 per cinque ore a quattro gradi Celsius. Per preparare la camera di immobilizzazione delle proteine, incollare con cura il vetrino coprioggetti modificato e il vetrino da microscopio con nastro biadesivo personalizzato.
Installare tubi flessibili e punte per formare una camera microfluidica con sei canali. Per le correzioni di mappatura, aggiungere 10 microlitri di particelle di polistirene al 10% su un vetrino da microscopio e coprirlo con un vetrino coprioggetti. Quindi, sotto un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale, selezionare un campo visivo contenente particelle di polistirene e catturare un video in modalità campo chiaro.
Utilizza uno script personalizzato per allineare la posizione centrale della stessa particella di polistirene sia nel canale donatore che in quello accettore. Salva il file della mappa come file TXT. Per gli esperimenti intermolecolari smFRET, mescolare ATL1cyto-K marcato con LD555 con ATL1cyto-K-biotina marcato con LD655 in un rapporto uno a uno con una concentrazione finale di un millimolare di GTP-gamma-S.
Incubare la miscela su ghiaccio per un'ora per dimerizzare le proteine. Mescolare ATL1cyto-T marcato con LD555 con ATL1cyto-K-biotina marcato con LD655 in un rapporto uno-a-uno con un millimolare di GTP-gamma-S per esperimenti intermolecolari smFRET ATL1cyto-T e ATL1cyto-K. Incubare la miscela su ghiaccio per un'ora per ottenere proteine dimerizzate.
Quindi, per i saggi intramolecolari smFRET, incubare ATL1cyto-TK marcato con LD555 e LD655 con un millimolare di GDP su ghiaccio per un'ora. Per gli esperimenti intermolecolari, incubare 10 microgrammi per millilitro di streptavidina per 10 minuti per immobilizzare le proteine. Per i saggi intramolecolari, aggiungere 10 microgrammi per millilitro di anticorpo anti-His biotinilato e incubare per 10 minuti per immobilizzare le proteine.
Dopo l'incubazione, aggiungere il dimero ATL1 diluito alla proteina nel canale e lasciarlo immobilizzare per 10 minuti. Lavare il canale due volte con un tampone di incubazione. Aggiungere acido benzoico e PCD al canale ad una concentrazione finale di 2,5 millimolari.
Seleziona il laser a 532 nanometri come sorgente luminosa di eccitazione. Impostare la fotocamera EMCCD per registrare i dati a un intervallo di fotogrammi di 30 millisecondi. Salvare i filmati registrati in formato TIFF a 16 bit.
Dopo l'acquisizione dei dati, estrarre le tracce FRET dai filmati registrati. Seleziona e salva le tracce FRET in formato TXT. Estrai i dati dai file TXT e calcola i valori FRET utilizzando gli script fatti in casa in MATLAB.
Adattare i dati smFRET di GaussAmp in Origin per ottenere l'istogramma di distribuzione.
