ザリガニ腹部の筋肉の受容体の臓器：固有感覚の学生の研究室の演習

要約

この実験の主な目的は、一次感覚ニューロンは、動物のための固有感覚情報として関節の動きと位置の情報を伝える方法を理解することです。このレポートの追加の目的は、現在の解剖顕微鏡下でニューロンの解剖して参照することによって、準備の解剖学です。

要約

この実験の主な目的は、動物のための固有感覚情報として関節の動きと位置の情報を伝える一次感覚ニューロンを示すことです。この実験の追加の目的は、解剖顕微鏡下で染色、解剖と神経細胞と感覚の構造の観察により、準備の解剖学を学ぶことです。これは、共同体の器官や染色技術から電気的活動を記録するための基本的な神経生理学的機器を使用して実行されます。ザリガニの筋肉の受容体の器官（MRO）のシステムは、電気生理学的記録のためのより容易にアクセス可能な比較モデルとしてのを助ける哺乳類の錘内筋紡錘、に似ています。さらに、これらは準備の間で識別可能な感覚ニューロンである。準備は、学生の実験演習のための従順である時間のための最小限の生理食塩水で実行可能です。 MROは、システムで変更することができますゲインとともに動きと静止位置の動的な信号の調節作用との統合のサイトに興味深い質問を促す神経調節の影響を受けやすくなります。

プロトコル

1）はじめに

Proprioceptorsは関節の位置、方向、速度、および筋肉のストレッチを検出するニューロンです。 proprioceptorsが本体内ではなく、外の世界からinteroceptorsと感覚刺激であるため、固有感覚は、独特の感覚モダリティです。

脊椎動物のシステムでは、それは共同と緊張の受容体の多くは総固有感覚情報を検出するために必要ではないことが表示されます。筋線維上annulospiralとflowerspray（感覚神経終末）受容体は固有感覚（バージェスら見直し、1982用）に必要な2つの重要な受容体のグループであることがアブレーションだけでなく、振動と麻酔薬の研究によって示されている。しかし、それは動きの微調整に使用されるような関節のような他の受容体、、で収集された冗長な情報があることは注目に値する。脊椎動物のような節足動物では、関節でつながった腕を持っている。したがって、脊椎動物で説明proprioceptorsは節足動物の手足と関節での対応を持っていることは驚くべきことではない。

カニの振動や音響に反応する臓器の解剖学的配置は、機能に応じて個々のニューロンの分析を行うことができます。さらに、発達質問は、動物の成長に合わせて対処または動物の四肢（クーパーとGovind、1991;ハートマンとクーパー、1993）を再生成するときにすることができます。カニのいくつかの共同振動や音響に反応する臓器は、一次感覚ニューロンの数百（クーパー、2008）が含まれており、これらのニューロンは、関節の動きと位置の範囲の分画の側面を監視します。関節の動きと位置を監視するの少ない複雑な固有受容システムは、ザリガニの腹部の筋肉の受容体の器官（MROs）（;マッカーシーとマクミラン、1995エッカート、1961a、b）である。ザリガニの腹部のMROsの機械受容には段階的受容体の潜在的に、筋肉に埋め込まれた感覚終末のストレッチ刺激を、形質導入。電位がしきい値を超えると、活動電位は軸索のベースになります。これは、神経生物学における"スパイク発生の部位"として定義されていると知られているものです。このシステムでは細胞体には、監視対象の筋肉に近い同格に存在します。ストレッチ受容体の異なる2つのタイプがこの感覚システム内に存在している：ゆっくり、適応と急速に適応受容体。活動はメカニカルストレッチの強さに依存しています。ザリガニのMROシステムは、哺乳動物における錘内筋紡錘に類似しており、筋肉はまた、哺乳動物における錘内筋のために知られているように筋肉の緊張した性質を維持するために遠心性に制御することができます。

哺乳類の筋紡錘感覚ニューロンが原因感覚終末の小さい性質の電気生理学的に調査するために挑戦しています。それは彼らの末梢終末に後根神経節に細胞体の位置を追跡することも困難です。比較では、ザリガニのMROのニューロンは、長期的な録音のための細胞外および細胞内電極のために容易にアクセス可能です。 MRO感覚ニューロンの細胞体（直径50〜100μmの）相対的に大きいです。 。Edwardsら、1981;。エルクスレーベン、1989感覚ニューロンは、また、神経細胞の機能におけるチャネル、感覚ニューロンのイオンの流れ、チャネルの分布、および密度（Brown ら 、1978を"ストレッチがアクティブに"どのように対処する上でモデルを務めている。ハントら、1978;。PuraliとRydqvist、1992; RydqvistとPurali、1991; RydqvistとSwerup、1991; Cooper ら、2003）。。 1つのセグメント内のMROからの感覚入力の統合は、他の隣接するセグメントを（エッカート、1961a、b）に影響を与えることができます。からの感覚入力の調節には、いくつかの報告があるMRO（パーストルとマクミラン、1990;。Cooperら 、2003）。神経回路の変調は、基礎科学の将来の調査のための豊かな地域であり、この準備は、脊椎動物の脊髄に潜在的に、将来のアプリケーションのための哺乳類の基盤として機能することができます（ロシニョールら、2001、2002;。Donnelan、2009）

1.1）学習の成果

この室内実験では、一つはザリガニの腹部を解剖し、MROの関連する解剖学、生理学を学ぶことができます。一つは、細胞外記録と神経活動を監視するために、共通の電気機器を使用する方法を学習します。一つは、グラフおよび提供の感覚刺激に基づいて得られたデータを解釈します。感覚刺激が静的な位置だけでなく、監視対象のセグメントのダイナミックな動きの範囲になります。一つは、この感覚システムとその意義における固有感覚の概念に対処します。感覚適応は、一連の実験で観察される。重要性だけでなく、感覚的適応の背後にある潜在的なメカニズムは、学生が解決される予定です。

2）方法

2.1）材料

1. ファラデー箱
2. マニピュレーター
3. 吸引電極
4. 解剖顕微鏡
5. 高輝度の照明装置（光源）
6. 顕微鏡プラットフォーム
7. AC / DC差動アンプ（AMシステムズ社モデル3000）
8. PowerLab 26T（ADインスツルメンツ）
9. ヘッドステージ
10. LabChart 7（ADIインスツルメンツ、コロラドスプリングズ、コロラド州、米国）
11. ザリガニ生理食塩水（MM：205のNaCl、5.3 KClを、13.5のCaCl ₂ · 2H ₂ O、2.45のMgCl _{2 · 6H 2} O、5 HEPES pH7.4に調整）
12. メチレンブルー：これは、0.25％の濃度でザリガニの生理食塩水で作られています
13. Sylgardコートディッシュ（ダウコーニング、SYLGARD 184シリコーンエラストマーのキット、ダウコーニング社、ミッドランド、MI米国。）
14. 解剖ツール
15. 虫ピン

2.2）のセットアップ

図1：機器のセットアップ

1. ファラデーケージをセットアップします。顕微鏡、高輝度の照明、マイクロマニピュレータ、および生理食塩水浴をすべて（ファラデーケージは電気録音を妨げる可能性のある外部の電界を遮断するために使用されている）ケージの内部に設定されます。
2. それは顕微鏡のステージを見下ろすている位置に顕微鏡をセットアップします。
3. 便利な位置に高輝度の照明を配置します。
4. Sylgard皿の中でザリガニの生理食塩水を用いて生理食塩水槽を準備し、（解剖ザリガニの腹部が配置される場所これは）顕微鏡の下に置きます。
5. 吸引電極を生理食塩水槽に簡単にアクセスできる位置にマニピュレータを配置します。
6. まで生理食塩水吸引は、吸引電極内部の銀線に接触しているまで。電極の先端に近い吸引電極のカット面で他の線をアレンジなので、両方のワイヤには、生理食塩水浴との接触になります。
7. パワーラボ26TにAC / DC差動アンプ（増幅器）を接続します。 PowerLab 26Tで入力1からアンプの出力に適切な電源コードを接続することによってこれを行います。
   • アンプのインストゥルメントのコントロールは、次の設定に設定する必要があります。
     • ハイパス- DC
     • ノッチフィルタ- OFF
     • パススルー20kHz低
     • 容量コンプ.-反
     • DCオフセットノブを反時計ファインとコース
     • DCオフセット（+ OFF -） - OFF
     • ゲインつまみ- 50
     • 入力（DIFF MONO GND） - DIFF
     • MODE（STIM - GATE - REC） - REC
     • ΩTEST- OFF
8. アンプの"入力プローブ"にヘッドステージを接続します。
9. 吸引電極からのヘッドステージに電線を接続します。線が緑に（地面）黒（ネガティブ下部、中央に、左上の（正の）赤に接続してください。これは、図2に示されています。アース線はちょうど生理食塩水浴に置くことができます。
   
   図2：ヘッドステージの設定
10. 今PowerLabの26TからラップトップにUSBコードを接続します。アンプとPowerLab26T両方が接続され、コンピュータ上LabChart7を開く前に電源が入っているか確認します。
11. LabChart7を開きます。
    • LabChartウェルカムセンターボックスが開いているポップアップ表示されます。それを閉じます。
    • セットアップをクリックしてください
    • チャンネルの設定をクリックしてください。 [OK]を押す（ボックスの左下）を1にチャネル数を変更します。
    • チャートの左上に約2kに秒あたりのサイクル数を設定します。約500または200mVにボルト（y軸）を設定します。
    • チャートの右側にチャンネル1をクリックしてください。入力アンプをクリックしてください。シングルエンド、AC結合、および反転（必要に応じて信号を反転します）、およびアンチエイリアス、チェックされます：。設定がいることを確認してください
    • 記録のプレススタートを開始する。

2.3）解剖

1. ボディの長さが6〜10センチメートルを測定ザリガニ（Procamarus clarkii）はすでに解剖が始まる前に、動物を麻酔するために氷の上に配置する必要があります。
2. 片手で爪の背後から麻酔ザリガニを保持する。迅速に、目のソケットから両側頭部の中央にカットし、ザリガニ（注：準備から血液が完了したときときに乾くので、ツールを洗うスティッキーになるだろう）を刎ねる。
   
   図3：ザリガニの斬首
3. 一度ザリガニは腹側の胸部と腹部（尾部）間でカット、斬首されています。それは、胸部から腹部を分離する簡単なはずです。注：ザリガニが、男性の場合は、stylをカット腹部と胸部を分離する前にオフETS（雄の生殖の部分）。 （図4Aに下図参照）。
4. 
   図4：腹部の分離
5. 外側縁に沿って切断した片足腹部内部のはさみの刃、と離れての準備からポインティングはさみのヒントと、。反対側に繰り返します。
   
   図5：腹部の縦切開
6. ピンセットのバックエンド（＃3）を取ると離れての準備の背側から筋肉や消化管を押してください。筋肉にプッシュダウンしないことを確認してください。
7. 尾の腹側を削除するには、最後のリブ（側面への側面）を介してカット。
   
   図6：腹部の腹側部分の除去
8. ザリガニ生理食塩水（修正ヴァンHarreveldのソリューション）の準備をemergeしてください。
9. 顕微鏡下で準備を見ると、深い伸内側の筋肉（DEM）は、線形繊維とそのらせんでツイスト繊維、そして深い伸側面の筋肉、と見つけることができます（付録の図1と2を参照）区別することができます。第一および第二リブ（図7）上にDEMの筋肉の間に腹部の遠位部での正中矢状領域内の場所つのピン。
   
   図7：感覚MROの神経を含む神経を記録するための準備を保護。
10. クチクラ（図7）の隣に横方向のエッジに沿って実行から記録するために使用される神経の束。 （これは準備に吹くか、その動きが神経を見つけるためにスポイトを用いて浴中に生理食塩水をドロップすることが必要な場合があります）

注：

各腹節には、右と左hemisegments上で急速にゆっくりと、適応MROsの2つのセットを持っています。関連付けられている神経の束は、キューティクルの隣に横方向のエッジに沿って実行する。これは、1つから録音されることを神経の束である。一つは、彼らはDEL1、2筋（付録の図1と2）の下に配置されているためMROsを表示することができなくなります。図8は、腹部を分離するために行われる解剖の概要を説明します。

図8：腹部を分離する一般的な解剖の概要。 、B、およびCは、ザリガニの解剖の一連のステップです。

3）結果

3.1）の記録

ストレッチをストレッチし、維持しながら、ゆっくりと急速に適応MROsから得られた一般化された応答は、図9に示されている。その軸索は同じ神経束に含まれているとしてこの演習では、1つは一緒に両方MROsから録音されます。

図9：ザリガニは、MROの神経細胞の2種類があります。高速モータの軸索、および遅いモータ軸索によって支配されている強壮剤によって支配されている相の、。 （a）はトニックの受容体が刺激されると、徐々に刺激に適応し、活動電位の安定した発火パターンを続けています。 （B）相の受容体が刺激されると、急速に刺激に適応し、唯一の活動電位の短いパターンを発生させます。

運動感覚神経を含む全体の神経が（図10）から記録されます。しかし1は、モータ駆動が動物の腹側神経索から切断されているとして感覚ニューロンを検出します。

図10：記録電極に吸い取られる神経の束。 （A）自由神経は解剖腹部に浮かん示されています。 （B）神経束と神経によるプラスチック吸引電極の近くに概説します。 （C）分節神経が青色に記載されている吸引電極、に取り込まれます。

一つは、今MROsから電気的応答を記録する準備ができています。

1. 解剖のスコープの下準備を置き、設定の記録を準備する。
2. 電気バスと共通のグランドに、もう一方の端に銀塩化アース線を配置することによって、バスを接地してください。注：時々、これは記録中に電気的なノイズが発生する可能性があります。このような場合はバスを接地しないでください。
3. 記録されることに神経を見つけるために顕微鏡を使用して、
   注：ほとんどのアクセス可能な神経を持つセグメントを探します。神経は白、または神経の周りに食塩水を散布するピペットを用いて見ることができます。軽く準備に吹き付けること。これは、神経の周りに移動させると、それが容易に識別できるようになります。
4. 今すぐ神経が直接神経を介しマイクロマニピュレータ（図10）から吸引電極を位置同定されていること。
5. ゆっくりと電極（一顕微鏡を用いて電極に吸引されている神経を見ることができる）に神経を描画するために注射器を引っ張る。
6. Labscop​​e7上でスタートボタンを押してください。
7. ピンセットを使用すると、静かに180から45と90の角度からザリガニの尾を上下に移動します。それぞれ異なる角度での録音の違いに注目してください。 （角度の位置を変更する場合は、画面上の関連する神経活動との角度の変化をメモしておいてください。これはソフトウェアでコメントマーカーを使用して行うことができます。）
8. 下のチャートの様々な静的な動きに応答の動きを記録します。
   • 15秒のため45 °でザリ​​ガニの尾を保持する。
   • LabChart7画面で停止押してください。記録された最後の秒に発生した活動電位の数を記録。
   • 1分間45 °でザリ​​ガニの尾を保持する。
   • LabChart7画面で停止押してください。記録された最後の秒に発生した活動電位の数を記録。
   説明：ラボのチャート画面は対秒ミリボルト（y軸）（x軸）になって動くグラフです。それは一定の時間に何回発生したら活動電位を測定します。また、各活動電位や細胞外電場電位の電圧の振幅を測定します。振幅は、細胞外記録した活動電位の異なるサイズがあるかどうかを判断するために使用できる相対的な尺度です。細胞外電場電位が記録した活動電位は、"スパイク"と呼ばれています。遠く神経から小さなスパイクがなります。緩い吸引でフィッティングは、現在は神経の束の周りの低シール抵抗と吸引電極の開口部に失われるので、小さなスパイクがなる電極。

チャート1：

角度（°）	＃3秒1秒後の活動電位の	＃10秒後に1秒の活動電位の
180 °（フラット）
45 °
90 °

これらの実験を行いながら、考えるための質問は以下のとおりです。ジョイントの拡張と屈曲の動きにパターンと一貫性のある応答はありますか？応答のどのような種類は、さまざまな固定位置に尾節を固定または保持することによって誘発される？繰り返すと、その応答は一致している？

観察された応答の種類を慎重にノートを作る。あなたがあなたの観察に満足された後、データファイルを保存することにより、この活動の恒久的な記録を作る。一度セグメント3で行った観測に満足し、活動を観察するためにセグメントを4または5でまたはセグメント3の反対側の神経からさらにレコーディングに移ります。

一つは、神経修飾物質（オクトパミン、セロトニン、及びproctolin）または他の化合物または生理食塩水のイオン性質に変化した組成が定義されている生理食塩水で得られたものから様々な応答を生成するかどうかを判断したい場合があります。

3.2）メチレンブルーで染色

一つは、染色技術でMROsを表示するには（付録を参照）筋肉を解剖することができます。準備を取るとザリガニの生理食塩水を注ぐ。静かに準備して数分のためのスワール皿をにメチレンブルー溶液の約5 MLSを置きます。その後、廃棄物容器に過剰メチレンブルーを注ぐと準備の上に新鮮な生理食塩水を注ぐ。今MROsを表示するには、筋肉を解剖開始するために顕微鏡下で皿を置きます。筋肉の下にはさみの一部を配置して、筋肉に沿って切断したとして引き上げて、肋骨（正中矢状の外側）に沿ってセグメントをカット。一度DEL 1と2の筋肉が筋肉のバック剥離してカットされ、筋肉の薄い層（SEM）を観察する必要があります。 MROsは、らせんの筋肉（図11）に平行に横たわっている最後の二つの内側繊維である。

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図11：腹部セグメントの概略は、筋肉群を示す（）とメチレンブルー（B）で染色した準備が無傷の準備のための筋群の輪郭を描くのに役立ちます。の概説領域は拡大図とBに示されています。回路図の下半分に示すようにAに示すようにBで、DEL1、2筋群が離れてカットされていません

学生の演習用のものは学生が次の質問に答えることを望む可能性があります。

1. 内受容の受容体とは何ですか？
2. どのように内受容の受容体は、proprioceptorsに関連していますか？
3. 感覚適応とどのようにこの研究室に関連することができますを説明する。
4. 範囲の分画とは何ですか？何それはCNSが行うことができますか？
5. ニューロンでは、一過性または強直型のニューロンを記録したか。なぜ？
   （ヒント：あなたが運動ニューロンの活動が無傷の動物の中で感覚神経活動との関係でどのように見えるのかを仮定するでしょう）
6. 別紙に、APの周波数対ザリガニの尾の角度のグラフを描く。
7. あなたがグラフで観察する可能性のある傾向を説明する

ディスカッション

関連するムービーとテキストで提供される詳細情報は十分にその場でザリガニのMROの活動を記録するために重要なステップを提供している。私たちの報告書の一つの目標は、感覚生理学の基本概念を教えるための調査研究室を実行する学生で、この準備のための可能性の意識を高めることです。最小限の生理食塩水を浴びている間の準備は実行可能性に非常に堅牢です。

MROの筋肉のモータ制御は、識別が伝送における規制とシナプス可塑性の潜在的なだけでなく、興奮性と抑制性ニューロンの伝送の有効性は、調査のための空地のままされています（Elekesとフローリー、1987A、B、フローリーとフローリー、1955カフラー、1954年、カフラーとEyzaguirre、1955）。

この製剤は、優れた一次調査だけでなく、デモンストレーションではMROの生物学を理解するために動物内での実験条件の数だけでなく、運動の自然な範囲を調査するために使用することができます。 Edwards ら、1981;。Purali、1997; RydqvistとPurali、1991; Rydqvistこれらの感覚ニューロンの生物物理学的特性は、部分的に維持刺激（Brownら、1978と神経活動の適応の彼らの自然の中で解決されていますとSwerup、1991）。しかし、これらの感覚受容器とそれに関連する筋線維（Cooper ら、2003;パーストルとマクミラン、1990）上でわずか数レポートのアドレス神経調節。レポートは、体液中に存在することが知られている多くの化合物のほんの一部を扱う。変調器の多くの変調器とカクテルは、MROの複合体（筋肉や神経細胞）で検査されずに残っている。パーストルとマクミラン（1990）は、様々な甲殻類の種間MROsの活動に神経修飾物質5 - HTとオクトパミンを検討し、種の違いがあることを指摘しました。彼らは詳細にこれらの神経修飾物質の長期的な影響もMROの異なる静的な位置での活動への影響を調べていませんでした。

。ラビンら、2009;。マリノら準備のこのタイプの運動単位のabnormities（パテルら 、2009と人間のためのリハビリテーションと疾患管理において重要である神経処理の知覚と制御の基礎を理解するのに役立ちます。、2010）。アクセス可能な無脊椎動物の調製品で関節の動きを監視するための入力と発火パターンの様々な種類のロボット/プロテーゼ（マクミランとPatullo、2001）で使用することができます。いくつかの方法で有益であることができるこの準備のための答えを待っている多くの疑問が残っています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
PowerLab 26T	ADInstruments
LabChart 7	ADI Instruments, Colorado Springs, CO, USA