Receptor Organi muscolare all'addome gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti in propriocezione

Riepilogo

Lo scopo principale di questo esperimento è quello di capire in che modo i neuroni sensoriali primari trasmettere informazioni di movimenti e posizioni comuni, come informazioni propriocettive per un animale. Un ulteriore obiettivo di questa relazione è presente l'anatomia della preparazione di dissezione e la visualizzazione dei neuroni sotto un microscopio da dissezione.

Abstract

Lo scopo principale di questo esperimento è quello di dimostrare primario informazioni sensoriali neuroni trasporto di movimenti e posizioni comuni, come informazioni propriocettive per un animale. Un ulteriore obiettivo di questo esperimento è quello di imparare l'anatomia della preparazione di colorazione, la dissezione e la visualizzazione dei neuroni sensoriali e le strutture sotto un microscopio da dissezione. Questa operazione viene eseguita utilizzando attrezzature di base neurofisiologica per registrare l'attività elettrica di un organo recettore comune e tecniche di colorazione. Il recettore muscolare organo (MRO) sistema il gambero di fiume è analogo al fuso muscolare intrafusali nei mammiferi, il che aiuta a servire come un modello comparativo che è più facilmente accessibile per le registrazioni elettrofisiologiche. In aggiunta, questi sono identificabili neuroni sensoriali tra preparativi. La preparazione è vitale in una soluzione salina minimo di ore che è suscettibile di esercitazioni di laboratorio degli studenti. Il MRO è anche suscettibile di neuromodulazione che incoraggia domande intriganti nei siti di azione di modulazione e l'integrazione dei segnali dinamici di movimenti e posizione statica con un guadagno che può essere cambiato nel nostro sistema.

Protocollo

1) INTRODUZIONE

Propriocettori sono i neuroni che rilevano la posizione comune, direzione, velocità e stiramento muscolare. Propriocezione è una modalità sensoriale unica, perché propriocettori sono interocettori e stimoli sensoriali all'interno del corpo invece che dal mondo esterno.

Nel sistema dei vertebrati, sembra che molti dei recettori articolari e le tensioni non sono necessari per rilevare lordo informazioni propriocettive. Il annulospiral e flowerspray (terminazioni nervose sensoriali) recettori sulle fibre muscolari hanno dimostrato di ablazione e gli studi di vibratorio e anestetico da due gruppi di recettori essenziali per la propriocezione (Burgess et al. Per una rassegna, 1982). Tuttavia, è da notare che ci sono le informazioni ridondanti raccolte da altri recettori, come quelli nelle articolazioni, che vengono utilizzati per un controllo preciso dei movimenti. Artropodi come i vertebrati hanno appendici articolate. Pertanto, non sorprende che il propriocettori descritto per i vertebrati hanno le loro controparti in artropodi arti e le articolazioni.

La disposizione anatomica degli organi cordotonali in granchi permette l'analisi di ogni singolo neurone in base alla funzione. Inoltre, le domande di sviluppo può essere affrontata come l'animale cresce o quando l'animale si rigenera un arto (Cooper e Govind, 1991; Hartman e Cooper, 1993). Alcuni organi comuni cordotonali in granchi contenere centinaia di neuroni sensoriali primarie (Cooper, 2008) e questi neuroni monitorare gli aspetti del frazionamento gamma di movimenti e posizioni del giunto. Un sistema meno complesso propriocettivo per monitorare i flussi comuni e posizioni è il muscolo organi recettori (ORP) nell'addome di gamberi (Eckert, 1961a, b; McCarthy e MacMillan, 1995). I meccanorecettori nelle ORP addome gamberi trasdurre uno stimolo tratto nelle terminazioni sensoriali, inserita in un muscolo, in un potenziale del recettore classificato. Quando il potenziale supera una soglia, un potenziale d'azione si tradurrà alla base degli assoni. Questo è ciò che è definito e conosciuto come "il sito di picco iniziazione" in neurobiologia. In questo sistema il corpo cellulare risiede nella apposizione vicino al muscolo esso controllato. Due tipi distinti di recettori presenti in questo sistema sensoriale: un lento adattamento e un recettore in rapida adattamento. L'attività è dipendente dalla forza del tratto meccanica. Il sistema di MRO nel gambero è analogo al fuso muscolare intrafusali nei mammiferi ed i muscoli anche il controllo efferenti per garantire il carattere tesa dei muscoli, come noto per i muscoli intrafusali nei mammiferi.

I neuroni sensoriali del muscolo mandrino nei mammiferi sono difficili da indagare elettrofisiologico a causa della natura piccola delle terminazioni sensoriali. E 'anche difficile tenere traccia della posizione dei corpi cellulari nei gangli delle radici dorsali alle loro terminazioni periferiche. In confronto, i neuroni MRO in gamberi sono facilmente accessibili per gli elettrodi extracellulari e intracellulari per le registrazioni a lungo termine. I corpi cellulari dei neuroni sensoriali MRO sono relativamente grandi (50-100 micron di diametro). Neuroni sensoriali hanno anche servito come modello per affrontare come "tratto attivato" canali in funzione dei neuroni, il flusso ionico, canale di distribuzione e la densità dei neuroni sensoriali (Brown et al, 1978;. Edwards et al, 1981;. Erxleben, 1989; Hunt et al, 1978;. Purali e Rydqvist, 1992; Rydqvist e Purali, 1991; Rydqvist e Swerup, 1991; Cooper et al, 2003).. L'integrazione degli input sensoriali dal MRO in un segmento può influenzare gli altri segmenti contigui (Eckert, 1961a, b). Ci sono alcuni rapporti sulla modulazione degli stimoli sensoriali dal MRO (Pasztor e Macmillan, 1990;. Cooper et al, 2003). Modulazione dei circuiti neurali è una zona ricca per le indagini futuro della scienza di base e questa preparazione può servire come fondamento nei mammiferi per future applicazioni, potenzialmente nel midollo spinale di vertebrati (Rossignol et al, 2001, 2002;. Donnelan, 2009)

1.1) I risultati di apprendimento

In questo esperimento di laboratorio, ci si sezionare un addome gamberi e imparare l'anatomia e la fisiologia associati del MRO. Un impareranno a monitorare l'attività neuronale con registrazioni extracellulari e di uso comune apparecchiature elettrofisiologiche. Uno sarà grafico e interpretare i dati ottenuti sulla base degli stimoli sensoriali in dotazione. La stimolazione sensoriale va da posizioni statiche e movimenti dinamici del segmento monitorato. Un affronterà il concetto di propriocezione in questo sistema sensoriale e il suo significato. Adattamento sensoriale sarà osservato in una serie di esperimenti. L'importanza e il potenziale meccanismo alla base di adattamento sensoriale saranno affrontati dagli studenti.

2) METODI

2.1) Materiali

1. Gabbia di Faraday
2. Micromanipolatore
3. Aspirazione elettrodi
4. Microscopio da dissezione
5. Illuminatore ad alta intensità (sorgente luminosa)
6. Microscopio Piattaforma
7. AC / DC amplificatore differenziale (AM Systems Inc. Modello 3000)
8. PowerLab 26T (Strumenti dC)
9. Testa stadio
10. LabChart 7 (ADI Instruments, Colorado Springs, CO, USA)
11. Gambero di fiume Saline (mM: 205 NaCl, 5.3 KCl; 13,5 CaCl ₂ .2 H ₂ O; 2,45 MgCl ₂ .6 H ₂ O, 5 HEPES regolato a pH 7,4)
12. Blu di metilene: Questa è fatta di soluzione salina gamberi ad una concentrazione di 0,25%
13. Piatti Sylgard patinata (Dow Corning, SYLGARD 184 kit di elastomero di silicone;. Dow Corning Corporation, Midland, MI USA)
14. Strumenti di dissezione
15. Perni di insetti

2.2) Impostazione

Figura 1: L'attrezzatura impostare

1. Imposta la gabbia di Faraday. Il microscopio, illuminatore ad alta intensità, micromanipolatore, e il bagno salino saranno tutti allestita all'interno della gabbia (La gabbia di Faraday è usato per bloccare i campi elettrici esterni che potrebbero interferire con la registrazione elettrica).
2. Imposta il microscopio in una posizione in cui si affaccia la fase microscopio.
3. Posizionare l'illuminatore ad alta intensità in una posizione comoda.
4. Preparare un bagno con una soluzione fisiologica salina gamberi in un piatto Sylgard e mettetelo sotto il microscopio (è qui che l'addome gamberi sezionato sarà posta).
5. Posizionare il micromanipolatore in una posizione in cui l'elettrodo di aspirazione ha un facile accesso al bagno salino.
6. Aspirazione fino salina fino a quando non è in contatto con il filo d'argento all'interno dell'elettrodo di aspirazione. Disporre l'altro filo sul taglio sul lato di aspirazione elettrodi vicino alla punta di elettrodo, in modo da entrambi i cavi saranno in contatto con il bagno salino.
7. Collegare l'alimentatore AC / DC amplificatore differenziale (amplificatore) a 26T Lab il Potere. Per fare ciò, collegare il cavo corretto da ingresso 1 sulla 26T PowerLab all'uscita dell'amplificatore.
   • I controlli amplificatore strumento deve essere impostato per le seguenti impostazioni:
     • High Pass-DC
     • Notch Filter-OFF
     • Passa-basso-20kHz
     • Capacità Comp .- antiorario
     • DC Offset fine e Corso-manopola in senso antiorario
     • DC Offset (+ OFF-) - OFF
     • Manopola di guadagno-50
     • Ingresso (DIFF MONO GND) - DIFF
     • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
     • ΩTEST-OFF
8. Collegare la fase di testa al 'input-sonda' sull'amplificatore.
9. Collegare i fili elettrici dall'elettrodo aspirazione alla fase testa. I fili devono essere collegati con il rosso (positivo) in alto a sinistra, verde (terra) al centro, nero (negativo in basso. Questo è indicato in Figura 2. Il cavo di terra può solo essere messo nella vasca da bagno salino.
   
   Figura 2: fase di configurazione di testa
10. Ora collegare il cavo USB dal 26T PowerLab al computer portatile. Assicurare che sia l'amplificatore e PowerLab26T siano collegati e accesi prima di aprire LabChart7 sul computer.
11. Aperto LabChart7.
    • Il Welcome casella Centro LabChart si aprirà. Chiuderlo.
    • Fare clic su Setup
    • Clicca sulle impostazioni dei canali. Modificare il numero di canali a 1 (in basso a sinistra della scatola) premere OK.
    • In alto a sinistra del grafico di cicli al secondo a circa 2k. Impostare il volt (asse y) a circa 500 o 200 mV.
    • Clicca sul canale 1 sulla destra del grafico. Clicca su amplificatore di ingresso. Assicurarsi che le impostazioni: single-ended, accoppiamento AC, e invertire (inverte il segnale, se necessario), e anti-alias, sono controllati.
    • Per iniziare la stampa avviare la registrazione.

2.3) La dissezione

1. Gamberi (Procamarus clarkii) misura 6-10 cm in lunghezza del corpo deve essere già immessi sul ghiaccio per anestetizzare l'animale prima della dissezione comincia.
2. Tenere il gambero anestetizzato da dietro le unghie con una sola mano. Rapidamente, tagliato dalla presa occhio al centro della testa su entrambi i lati, e poi decapitare i gamberi (Nota: il sangue dalla preparazione sarà appiccicoso quando si asciuga, quindi lavare gli attrezzi una volta completato).
   
   Figura 3: Decollazione di gamberi
3. Una volta che il gambero di fiume viene decapitato, tagliato tra il torace e l'addome (coda) sul lato ventrale. Dovrebbe essere facile per separare l'addome dal torace. Nota: se il gambero è maschio, tagliare il Stylets (maschio parti riproduttive) prima di separare l'addome e il torace. (Illustrato di seguito nella figura 4A).
4. 
   Figura 4: Isolamento di addome
5. Luogo una lama delle forbici all'interno dell'addome, e con le punte forbice che punta lontano dalla preparazione, tagliare lungo il bordo laterale. Ripetere sul lato opposto.
   
   Figura 5: dissezione longitudinale dell'addome
6. Prendere l'estremità posteriore della pinzetta (# 3) e spingere i muscoli e del tratto GI di distanza dal lato dorsale della preparazione. Assicuratevi di non spingere verso il basso i muscoli.
7. Trasversali (laterale a laterale) l'ultima costola per rimuovere la parte ventrale della coda.
   
   Figura 6: rimozione della parte ventrale dell'addome
8. Emerge la preparazione di gamberi salina (soluzione di una versione modificata di Van Harreveld).
9. Guardando il preparato al microscopio, il profondo muscolo estensore mediale (DEM) può essere localizzato con le sue fibre intrecciati a spirale, e la profonda muscoli estensori laterali, con fibre lineari possono essere distinte (vedi figure Appendice 1 e 2). Posto due spine nella regione medio-sagittale nella parte distale del ventre tra i muscoli DEM sulle costole prima e la seconda (Figura 7).
   
   Figura 7: Garantire la preparazione per la registrazione il nervo che contiene il nervo sensitivo MRO.
10. I fasci nervosi che verrà utilizzato per registrare da correre lungo il bordo laterale vicino alla cuticola (Figura 7). (Può essere necessario soffiare sulla preparazione o far cadere salina nel bagno con un contagocce per individuare il nervo dal suo movimento)

Nota:

Ogni segmento addominale ha due serie di ORP rapidamente e lentamente adeguare sul hemisegments destra e sinistra. I fasci nervosi associati correre lungo il bordo laterale vicino alla cuticola. Questo è il fascio nervo che uno sarà la registrazione. Non sarà in grado di visualizzare le ORP perché si trovano sotto il DEL1 e 2 muscoli (figure Appendice 1 e 2). Figura 8 fornisce una panoramica delle dissezioni da effettuare al fine di isolare l'addome.

Figura 8: panoramica generale di dissezione per isolare l'addome. A, B e C sono la serie di passi a dissezionare il gambero di fiume.

3) I RISULTATI

3.1) Registrazione

Risposte generalizzate ottenuto dalla lenta e rapida adattamento ORP mentre stretching e il mantenimento di un tratto sono rappresentate in Figura 9. In questo esercizio uno sarà la registrazione sia da ORP insieme, come i loro assoni sono contenuti nel bundle stesso nervo.

Figura 9: Il gambero ha due tipi di neuroni nel MRO. Il fasica, che sono innervati dal veloce assoni motori, e il tonico, che sono innervati da assoni motori lenti. (A) Quando un recettore viene stimolato tonico lentamente si adatta allo stimolo e continua un andamento costante lancio di potenziali d'azione. (B) Quando un recettore viene stimolato fasica si adatta rapidamente allo stimolo e gli incendi solo un modello corto di potenziali d'azione.

Il nervo intero che contiene i neuroni motori e sensoriali vengono registrati da (Figura 10). Tuttavia si rileva solo i neuroni sensoriali come il motore si è staccato dal cordone nervoso ventrale dell'animale.

Figura 10: Il bundle coraggio di essere risucchiato l'elettrodo di registrazione. (A) Il nervo libero è mostrato fluttuante sopra l'addome sezionato. (B), descrive il fascio dei nervi e la plastica vicino elettrodo di aspirazione dal nervo. (C) Il nervo segmentale è tirato in l'elettrodo di aspirazione, che è delineata in blu.

Uno è pronto per registrare le risposte elettriche dal ORP.

1. Mettere la preparazione nel campo d'applicazione dissezione e preparare il set up di registrazione.
2. Elettricamente a terra il bagno mettendo un argento-cloruro di filo di terra nella vasca da bagno e l'altra estremità ad un terreno comune. Nota: A volte questo può provocare disturbi elettrici durante la registrazione. Se ciò accade non a terra il bagno.
3. Usate il microscopio per trovare il coraggio di essere registrati
   Nota: Cercare il segmento con il nervo più accessibile. Il nervo è bianco, e può essere visto utilizzando la pipetta di soluzione fisiologica spray intorno al nervo o con una leggera che soffia sulla preparazione. Questo fa sì che il coraggio di muoversi e rende più facile da identificare.
4. Ora che il nervo è stato identificato posto l'elettrodo di aspirazione dal micromanipolatore direttamente sopra il nervo (Figura 10).
5. Tirare delicatamente la siringa per disegnare il nervo nel elettrodo (si può vedere il nervo viene risucchiata l'elettrodo con l'uso del microscopio).
6. Premere il pulsante di avvio sul Labscope7.
7. Utilizzando le pinzette delicatamente spostare la coda del gambero su e giù per 180-45 e 90 angoli. Notare la differenza nelle registrazioni ad ogni angolo diverso. (Quando si cambia la posizione degli angoli assicurarsi di notare i cambiamenti angolo con la relativa attività neuronale sullo schermo. Questo può essere fatto sia usando l'indicatore di commento nel software.)
8. Registrare i movimenti risposta a vari movimenti statici nella tabella sottostante.
   • Tenere la coda di gambero a 45 ° per quindici secondi.
   • Spingere fermare sullo schermo LabChart7. Registrare il numero di potenziali d'azione che si sono verificati durante la seconda registrata.
   • Tenere la coda di gambero a 45 ° per un minuto.
   • Spingere fermare sullo schermo LabChart7. Registrare il numero di potenziali d'azione che si sono verificati durante la seconda registrata.
   Spiegazione: Lo schermo Grafico Lab è un grafico in movimento che è in millivolt (asse y) vs secondi (asse x). Esso misura il numero di potenziali d'azione si verificano in un certo periodo di tempo. Esso misura anche l'ampiezza in volt di ogni potenziale d'azione o un potenziale campo extracellulare. L'ampiezza è una misura relativa che può essere utilizzato per determinare se di dimensioni diverse extracellulare potenziali d'azione registrate sono presenti. Un potenziale d'azione registrata da un potenziale campo extracellulare è indicato come un "picco". Il più lontano dal nervo più piccolo è il picco sarà. Il perdente raccordo sul aspirazione elettrodo più piccolo è il picco sarà come la corrente si perde con la resistenza di tenuta bassa intorno al fascio nervoso e l'apertura degli elettrodi di aspirazione.

Grafico 1:

Angolo (°)	# Dei potenziali d'azione in 1 secondo dopo 3 secondi	# Dei potenziali d'azione in 1 secondo dopo 10 secondi
180 ° (piatto)
45 °
90 °

Domande a cui pensare durante la conduzione di questi esperimenti sono: C'è un modello e una risposta coerente alla estensione e movimenti di flessione del giunto? Che tipo di risposte sono evocati da pinning o tenendo premuto il telson in varie posizioni fisse? È che la risposta coerente quando ripete?

Prendere appunti attenta del tipo di risposte osservate. Quando si è soddisfatti con le vostre osservazioni, fare dischi permanente di questa attività salvando i file di dati. Una volta soddisfatti con le osservazioni che avete fatto nel segmento 3, passare ad ulteriori registrazioni di nervi in ​​segmenti di 4 o 5 o dall'altra parte del segmento da 3 a osservare l'attività.

Si può desiderare per determinare se neuromodulatori (octopamina, serotonina, e proctolin) o altri composti o una composizione alterata nella natura ionica della soluzione salina produce risposte diverse da quelle ottenute in soluzione salina definito.

3.2) La colorazione con blu di metilene

Si può essere in grado di sezionare i muscoli (vedi appendice) per visualizzare le ORP con una tecnica di colorazione. Prendere la preparazione e versare il fuori salina gamberi. Posto a circa 5 ml di soluzione di blu di metilene nella preparazione e capovolgere delicatamente il piatto per qualche minuto. Versare quindi il blu di metilene in eccesso nel contenitore e versare salina fresca sulla preparazione. Ora posto il piatto sotto il microscopio per iniziare dissezione del muscolo per visualizzare le ORP. Tagliare il segmento lungo la costola (laterale di medio-sagittale) mettendo una parte delle forbici sotto il muscolo e tirando su come si taglia lungo il muscolo. Una volta che l'DEL 1 e 2 muscoli vengono tagliati poi sbucciare la parte posteriore del muscolo e un sottile strato di muscolo (SEM) dovrebbe essere rispettato. Le ORP sono le ultime due fibre mediale è parallela al muscolo elica (Figura 11).

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Figura 11: Lo schema di un segmento addominale illustra i principali gruppi muscolari (A) e una preparazione colorati con blu di metilene (B), aiuta a delineare i gruppi muscolari in una preparazione intatto. L'area delineata in A è mostrato in B con una vista ingrandita. In B, il DEL1 e 2 gruppi di muscoli non vengono tagliati via come mostrato nella metà inferiore dello schema, come illustrato in A.

Per le esercitazioni degli studenti si potrebbe desiderare di avere gli studenti rispondere alle seguenti domande:

1. Che cosa è un recettore interocettivi?
2. Come i recettori interocettivi riguardano propriocettori?
3. Spiega adattamento sensoriale e come potrebbe riferirsi a questo laboratorio.
4. Che cosa è di frazionamento gamma? Che cosa abilitare il sistema nervoso centrale da fare?
5. È il neurone è registrato un neurone di tipo fasico o tonico? Perché?
   (Suggerimento: Che cosa postulare l'attività del neurone motore sarà simile in relazione con l'attività dei neuroni sensoriali all'interno di un animale intatto)
6. Su un foglio di carta da disegnare un grafico dell'angolo di coda gambero rispetto alla frequenza di AP.
7. Spiega qualsiasi tendenza che si potrebbe osservare nel grafico

Discussione

I dati forniti nel film associati e testo hanno fornito passaggi chiave al fine di registrare l'attività sufficientemente nella ORP del gambero in situ. Uno degli obiettivi della nostra relazione è quello di aumentare la consapevolezza del potenziale di questa preparazione dello studente in corsa laboratori investigativi per insegnare concetti fondamentali nella fisiologia sensoriale. I preparativi sono molto robuste della redditività pur essendo immersi in una soluzione salina minimo.

Il controllo del motore sui muscoli MRO è stato identificato, ma il regolamento in trasmissione e le potenzialità della plasticità sinaptica e l'efficacia di trasmissione per i neuroni eccitatori e inibitori rimane uno spazio aperto per le indagini (Elekes e Florey, 1987a, b; Florey e Florey, 1955; Kuffler, 1954; Kuffler e Eyzaguirre, 1955).

Questa preparazione può essere utilizzato per indagare su una serie di condizioni sperimentali come pure l'area naturale di locomozione all'interno l'animale per comprendere meglio la biologia del MRO per la ricerca primaria e dimostrative. Le proprietà biofisiche di questi neuroni sensoriali è in parte stato affrontato nella loro natura di adattamento nelle attività neurale con uno stimolo mantenuto (Brown et al, 1978; Edwards et al, 1981;. Purali, 1997; Rydqvist e Purali, 1991; Rydqvist e Swerup, 1991). Tuttavia, solo pochi neuromodulazione indirizzo rapporti su questi recettori sensoriali e fibre muscolari associati (Cooper et al, 2003;. Pasztor e Macmillan, 1990). Le relazioni trattano solo alcuni dei molti composti che sono noti per essere presenti nella emolinfa. Modulatori molti e cocktail di modulatori rimangono da esaminare sul complesso MRO (muscoli e neuroni). Pasztor e Macmillan (1990) ha esaminato i neuromodulatori 5-HT e octopamina sull'attività di ORP tra le varie specie di crostacei e ha notato che ci sono differenze di specie. Essi non ha esaminato nel dettaglio le influenze a lungo termine di questi neuromodulatori, né gli effetti sulle attività in diverse posizioni statiche del MRO.

Questo tipo di preparazione può aiutare a comprendere le basi della percezione sensoriale e la regolazione dei processi neurali che è importante nella riabilitazione e gestione della malattia per l'uomo con anormalità blocco motore (Patel et al, 2009;. Rabin et al, 2009;. Marino et al ., 2010). I vari tipi di input e modelli di cottura per il controllo dei movimenti congiunta accessibile preparati invertebrati possono essere usati in robotica / protesi (Macmillan e Patullo, 2001). Ci sono ancora molte domande in attesa di risposte in questa preparazione che può essere utile in molti modi.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
PowerLab 26T	ADInstruments
LabChart 7	ADI Instruments, Colorado Springs, CO, USA