Мышцы рецепторов органов в Раки Живот: Упражнение студенческой лаборатории в Проприоцепция

Резюме

Основной целью этого эксперимента является понять, как первичные сенсорные нейроны передают информацию совместных движений и позиций проприоцептивной информации для животных. Дополнительной целью настоящего доклада является настоящим анатомии подготовки вскрытия и просмотра нейронов при вскрытии микроскопом.

Аннотация

Основной целью этого эксперимента является демонстрация первичных сенсорных нейронов передачи информации совместных движений и позиций проприоцептивной информации для животных. Дополнительной целью этого эксперимента является изучение анатомии подготовки окрашиванием, рассечение и просмотра нейронов и сенсорных структур при вскрытии микроскопом. Это осуществляется с использованием основных нейрофизиологических аппаратуры для записи электрической активности от совместного органа рецепторов и окрашивания техники. Орган мышцы рецепторов (MRO) системы в раков аналогично интрафузальный шпинделя мышц у млекопитающих, которая помогает в выступающей в качестве сравнительной модели, более доступными для электрофизиологических записей. Кроме того, эти могут быть идентифицированы сенсорных нейронов среди препаратов. Препарат жизнеспособными в минимальный физиологический раствор в течение часа, поддается для занятий студент лаборатории. MRO также восприимчивы к нейромодуляции которая поощряет интригующих вопросов в местах действия модулирующего и интеграции динамических сигналов движений и статическое положение наряду с усиления, которое может быть изменено в системе.

протокол

1) Введение

Проприорецепторов являются нейронами, которые обнаруживают общую позицию, направление, скорость и мышцы растягиваться. Проприоцепция является уникальной сенсорной модальности, так как являются проприорецепторов интерорецепторов и чувство стимулы внутри тела, а не из внешнего мира.

В системе позвоночных, похоже, что многие из сустава и растяжение рецепторов не являются необходимыми для выявления валового проприоцептивной информации. Annulospiral и flowerspray (чувствительных нервных окончаний) рецепторы мышечных волокон, как было показано при абляции, а также вибрационные и обезболивающий исследования, которые будут две основные группы рецепторов необходима для проприоцепции (Burgess и соавт. Для обзора, 1982). Тем не менее, следует отметить, что существует избыточная информация собранная другие рецепторы, например, в суставах, которые используются для тонкого управления движениями. Членистоногие как позвоночных сформулировали придатков. Поэтому не удивительно, что проприорецепторов описано для позвоночных их коллеги в членистоногих конечности и суставы.

Анатомического расположения органов в хордотональные крабов позволяет проводить анализ каждого отдельного нейрона в зависимости от функции. Кроме того, вопросы развития могут быть решены, как растет или животное, когда животное восстанавливает конечности (Купер и Говинд, 1991; Хартман и Купер, 1993). Некоторые совместные хордотональные органов крабы содержат сотни первичных сенсорных нейронов (Cooper, 2008), и эти нейроны монитор аспекты в диапазоне фракционирования в движениях и позиции сустава. Менее сложной проприоцептивной системы мониторинга совместных движений и позиций мышцы рецепторов органов (MROs) в брюшной полости раков (Эккерт, 1961а, б; Маккарти и Макмиллан, 1995). Механорецепторов MROs раков живота преобразовывать растянуть стимула в сенсорных окончаний, встроенные в мышцах, в градуированную потенциальных рецепторов. Когда потенциальные превышает порог, потенциал действия приведут в основании аксона. Это то, что определено и известно как "сайт шип посвящения» в нейробиологии. В этой системе тело клетки находится в тесной прикладывание к мышце он контролирует. Два различных типа стрейч рецепторы существуют в этой сенсорной системы: медленно адаптации и быстро адаптации рецепторов. Деятельности зависит от силы механического растяжения. Система ТОиР в раков аналогично интрафузальный шпинделя мышц у млекопитающих и мышцы также эфферентного контроля для поддержания тугой характер мышцы, как известно интрафузальный мышцы у млекопитающих.

Мышцы шпинделя сенсорных нейронов у млекопитающих являются сложными для расследования электрофизиологически из-за малого характер сенсорных окончаний. Кроме того, трудно отслеживать расположение тела клеток в спинной ганглий корень их периферических окончаний. Для сравнения, MRO нейронов в раки были легко доступны для внеклеточных и внутриклеточных электродов для записи длинный срок. Клеточных тел MRO сенсорных нейронов относительно крупные (50-100 мкм в диаметре). Сенсорные нейроны имеют также служил в качестве модели при решении как "растянуть активирована" каналов в функции нейронов, ионных потоков, каналов распределения и плотность сенсорных нейронов (Brown и др., 1978;. Эдвардс и др., 1981;. Erxleben, 1989; Хант и др., 1978;. Purali и Rydqvist, 1992; Rydqvist и Purali, 1991; Rydqvist и Swerup, 1991; Cooper и др., 2003).. Интеграции сенсорной информации от MRO в одном сегменте может влиять на других смежных сегментов (Эккерт, 1961а, б). Есть несколько докладов по модуляция сенсорной информации от MRO (Паштор и Macmillan, 1990;. Cooper и др., 2003). Модуляция нейронных цепей богатая область для дальнейших исследований фундаментальной науки, и этот препарат может служить основой для млекопитающих для использования в будущем, возможно, в спинной мозг позвоночных (Rossignol и др., 2001, 2002;. Доннеллан, 2009)

1.1) Результаты обучения

В этом лабораторный эксперимент, он будет рассекать раков брюшной полости и узнать связанные анатомии и физиологии MRO. Один узнаете, как монитор активности нейронов с внеклеточной записей и использовать общие электрофизиологическим оборудованием. Один будет граф и интерпретировать данные, полученные на основе сенсорной стимуляции предусмотрено. Сенсорной стимуляции будет варьироваться от статических позиций, а также динамические движения сегмента проводится мониторинг. Один будет заниматься концепцией проприоцепция в этой сенсорной системы и его значение. Сенсорная адаптация будет наблюдаться в серии экспериментов. Значение, а также потенциальных механизмов, ответственных за сенсорно адаптации, будут рассмотрены студентов.

2) методы

2,1) Материалы

Экранированная камера

Микроманипулятор

Всасывающая Электрод

Препаровальная лупа

Высокая интенсивность осветитель (источник света)

Микроскоп платформы

AC / DC дифференциального усилителя (АМ Systems, Inc Модель 3000)

PowerLab 26Т (AD Instruments)

Глава стадии

LabChart 7 (ADI Instruments, Колорадо-Спрингс, Колорадо, США)

Раки Saline (мм: 205 NaCl, 5,3 KCl; 13,5 CaCl ₂ · 2H ₂ O; 2,45 MgCl ₂ 6H ₂ O, 5 HEPES доводили до рН 7,4)

Метиленовый синий: Это стало раков солевым в концентрации 0,25%

Sylgard покрытием блюд (Dow Corning, SYLGARD 184 силиконового эластомера комплект;. Dow Corning Corporation, Midland, MI США)

Пройдя инструменты

Насекомые контакты

2.2) Установка

Рисунок 1: настройки оборудования

1. Установка до клетку Фарадея. Микроскоп, осветитель высокой интенсивности, микроманипулятора и солевые ванны все будут созданы внутри клетки (клетки Фарадея используется для блокировки внешних электрических полей, которые могут помешать электрической записи).
2. Установка микроскопа в положении, когда он с видом на столик микроскопа.
3. Расположите осветитель высокой интенсивности в удобном положении.
4. Подготовка солевые ванны раков использованием физиологического раствора в блюдо Sylgard и поместить его под микроскопом (это где расчлененные раков брюшной полости будет размещена).
5. Позиция микроманипулятора в положении, когда всасывающий электрод имеет легкий доступ к солевые ванны.
6. Всасывающая до солевой пока он находится в контакте с серебряной проволокой внутри всасывающего электрода. Упорядочить другой провод на разрезе стороне всасывания электрода близко к кончику электрода, так как провода будут находиться в контакте с солевые ванны.
7. Подключите AC / DC дифференциальный усилитель (усилитель) к 26Т Мощность Lab. Сделайте это путем подключения надлежащего питания от входа 1 на PowerLab 26Т с выходом на усилитель.
   • Управления усилителем инструмент должен быть установлен на следующие параметры:
     • ВЧ-DC
     • Notch Filter-OFF
     • НЧ-20кГц
     • Емкость Comp .- против часовой стрелки
     • Постоянное смещение изобразительного и курс ручку против часовой стрелки-
     • Постоянное смещение (+ OFF-) - OFF
     • Усиление ручки-50
     • Вход (DIFF MONO GND) - DIFF
     • MODE (STIM-GATE-REC) - REC
     • ΩTEST-OFF
8. Подключите голову этапе "вход-зонд" на усилителе.
9. Подключение электрических проводов от всасывающего электрода к голове сцены. Провода должны быть связаны с красного (положительного) в левом верхнем углу, зеленый (земля) в середине, черный (отрицательный внизу. Это показано на рисунке 2. Провод заземления можно просто положить в солевой ванне.
   
   Рисунок 2: Конфигурация глава этапе
10. Теперь подключите USB шнур от 26Т PowerLab для ноутбука. Убедитесь, что оба усилителя и PowerLab26T подключены и включены перед открытием LabChart7 на компьютере.
11. Открытое LabChart7.
    • Добро пожаловать LabChart окне появится Центр открыт. Закройте ее.
    • Нажмите на установки
    • Нажмите на настройки канала. Изменение числа каналов до 1 (нижней левой части окна) нажмите OK.
    • В верхней левой части графика набора циклов в секунду до примерно 2к. Установить вольт (у-оси) до примерно 500 или 200 мВ.
    • Нажмите на канал 1 на правом графике. Нажмите на вход усилителя. Убедитесь, что настройки: несимметричный, по переменному току, и инвертировать (инвертирует сигнал, если это необходимо), и сглаживание, проверяются.
    • Для начала начать запись прессы.

2.3) Препарирование

1. Раки (Procamarus clarkii) размером 6-10 см, длина туловища должна быть уже были помещены на лед, чтобы обезболить животное до вскрытия начинается.
2. Держите под наркозом раков из-за когтями одной рукой. Быстро, вырезать из глазницы к середине головы с обеих сторон, а затем обезглавить раков (Примечание: кровь из подготовки будет липким, когда она высыхает, поэтому мойте инструмент после его завершения).
   
   Рисунок 3: Обезглавливание раков
3. Как только раков обезглавлен, разрез между грудной клетки и брюшной полости (хвост) на брюшной стороне. Оно должно быть легко отделить живот от грудной клетки. Обратите внимание: если раков мужчин, вырезать StylETS (мужской репродуктивной части) перед отделением от живота и грудной клетки. (Показан на рисунке 4A).
4. 
   Рисунок 4: Выделение живота
5. Разместите один лезвие ножниц внутри брюшной полости, а также с ножницами советы направлен от подготовки, разрезать вдоль боковой границы. Повторите на противоположной стороне.
   
   Рисунок 5: продольное рассечение живота
6. Возьмите в задней части пинцет (# 3) и нажать мышцы и желудочно-кишечный тракт от спинной стороны подготовки. Убедитесь, что не нажимайте на мышцы.
7. Вырезать поперек (сбоку от боковой стороны) последнего ребра, чтобы удалить вентральной стороне хвоста.
   
   Рисунок 6: удаление вентральной части живота
8. Emerge препарата в раков физиологического раствора (раствор изменение Ван Harreveld в).
9. Глядя на препарат под микроскопом, глубоких разгибателей медиальной мышцы (DEM) могут быть расположены по ее волокон скручены в спираль, и глубокие разгибателей боковых мышц, с линейными волокна могут быть выделены (см. Приложение рисунках 1 и 2). Поставьте две булавки в midsagittal области на дистальной части живота между мышцами DEM на первом и втором ребра (рис. 7).
   
   Рисунок 7: Обеспечение подготовки к записи нерва содержащие чувствительного нерва MRO.
10. Нервных пучков, который будет использоваться для записи с бегите вдоль бокового края рядом с кутикулой (рис. 7). (Это могут быть необходимы для удара по подготовке или падение солевые ванны в использовании капельницы, чтобы найти нерв его движения)

Примечание:

Каждый сегмент брюшка имеет два набора быстро и медленно-адаптации MROs на правой и левой hemisegments. Связанные пучки нервов проходят по боковому краю рядом с кутикулой. Это нервный пучок, что один будет запись. Никто не будет в состоянии рассмотреть MROs, потому что они находятся под Del1 и 2 мышцы (Приложение рисунках 1 и 2). На рисунке 8 представлен обзор вскрытия должны быть сделаны для того, чтобы изолировать живота.

Рисунок 8: Обзор общих вскрытие, чтобы изолировать живота. , В и С являются ряд шагов в рассекает раков.

3) РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1) Запись

Обобщенные ответы получены из медленно и быстро-адаптации MROs при растяжении и поддержание растянуть изображены на рисунке 9. В этом упражнении можно будет запись с обеих MROs вместе, как их аксоны, содержащихся в одной связке нерва.

Рисунок 9: раков имеет два типа нейронов в MRO. Фазный, которые иннервируются быстро аксонов двигатель, и тоник которые иннервируются медленным аксонов двигателя. () Если тоник рецепторов стимулируется медленно адаптируется к стимула и продолжает устойчивый образец стрельбы потенциалов действия. (Б) Когда фазовый рецепторов стимулируется он быстро адаптируется к стимула и пожары в нескольких минутах картина потенциалов действия.

Весь нерв, который содержит двигательные и чувствительные нейроны записывается с (рис. 10). Однако один только обнаружить сенсорных нейронов, как двигатель был отделен от брюшной нервной животного.

Рисунок 10: нервный пучок будет выбрасываться в записи электрода. (А) свободный нерва показано парит над расчлененные части живота. (B) очертания пучок нервов и пластиковые близко электрода всасывания нерва. (C) сегментарный нерв втягивается всасывающим электродом, который описан в синий цвет.

Один из них в настоящее время готовы к записи электрических ответов от MROs.

1. Место препарата под рассечение сферу и подготовить запись создана.
2. Электрически землю ванну, поставив серебристо-хлорида провод заземления в ванной, а другой конец к общей позиции. Примечание: Иногда это может привести к электрическим помехам во время записи. Если это произойдет, не землю ванну.
3. Используйте микроскоп, чтобы найти нерв, чтобы быть записаны
   Примечание: Посмотрите на сегмент с наиболее доступной нерва. Нерв белый, и его можно увидеть с помощью пипетки для распыления солевого вокруг нерва или Слегка дует на подготовку. Это вызывает нервный передвигаться и делает его легче идентифицировать.
4. Теперь, когда нервы были определены места всасывания электрода от микроманипулятора прямо над нерва (рис. 10).
5. Осторожно потяните за шприц, чтобы привлечь нерва в электрод (можно увидеть нерв втягиваться в электрод с использованием микроскопа).
6. Пресс кнопку запуска Labscope7.
7. Использование пинцета осторожно двигаться хвостом раков вверх и вниз от 180 до 45 и 90 углов. Обратите внимание на разницу в записях на каждом под другим углом. (При изменении положения углов не забудьте отметить изменение угла с соответствующим нейронной активности на экране. Это может быть сделано использовать комментарии маркером в программном обеспечении.)
8. Запись ответа движений различных статических движений в таблице ниже.
   • Держите хвост раков на 45 ° в течение пятнадцати секунд.
   • Нажмите останавливаться на LabChart7 экране. Запись числа потенциалов действия, которые произошли в последнюю секунду регистрируются.
   • Держите хвост раков на 45 ° в течение одной минуты.
   • Нажмите останавливаться на LabChart7 экране. Запись числа потенциалов действия, которые произошли в последнюю секунду регистрируются.
   Объяснение: экран Лаборатории Диаграмма перемещения граф, в милливольтах (ось у) против секунд (оси Х). Он измеряет, сколько потенциалов действия происходят в определенное время. Он также измеряет амплитуду в вольтах каждого потенциального действия или внеклеточной потенциальном поле. Амплитуда является относительной мерой, которая может быть использована для определения, если другой размер внеклеточного записал потенциалы действия присутствуют. Потенциал действия записаны внеклеточной потенциальном поле называется "шип". Чем дальше от нервов меньше скачка цен будут. Слабее установку на всасывании электрода меньше скачка цен будут в качестве текущего теряется с низким сопротивлением уплотнение вокруг нерва расслоение и открытия всасывающего электрода.

График 1:

Угол обзора (°)	# Потенциалов действия в 1 секунду через 3 секунды	# Потенциалов действия в 1 секунду после 10 секунд
180 ° (плоская)
45 °
90 °

Вопросов для размышлений при проведении этих экспериментов: Есть картины и последовательного ответа на расширение и сгибание движения совместных? Какие ответы вызванные пиннинга или проведения тельсона при различных фиксированных позиций? Разве это ответ последовательной когда повторится?

Сделать осторожны ноты виды ответов наблюдается. После того как вы удовлетворены вашим наблюдениям, делают постоянные записи этой деятельности путем сохранения файлов данных. Как только удовлетворены наблюдений, которые вы сделали в сегмент 3, переходите к дальнейшему записи с нервами в сегментах 4 или 5, или на другой стороне сегмент 3 для наблюдения активности.

Один может пожелать, чтобы определить, нейромодуляторов (октопамин, серотонин и proctolin) или другие соединения или изменение состава в ионных характер солевого производит разнообразные ответы, полученные в определенный физиологический раствор.

3,2) окрашивания метиленовым синим

Один может быть в состоянии рассекать из мышц (см. приложение) для просмотра MROs с окрашиванием техники. Возьмите подготовки и вылейте из раков физиологического раствора. Поместите приблизительно 5 мл метиленового синего раствора в подготовке и осторожно вращать блюдо в течение нескольких минут. Затем влить избыток синего метилена в контейнер для отходов и залить свежим солевым на подготовку. Теперь поместите блюдо под микроскопом, чтобы начать рассекает мышцы, чтобы посмотреть MROs. Вырезать сегменте вдоль ребра (сбоку от midsagittal), поместив одну часть ножницами под мышцу и потянув вверх, как вы разрезать вдоль мышцы. После DEL 1 и 2 мышцы вырезать то кожура мышц спины и тонкий слой мышц (SEM), должны быть соблюдены. MROs последние две медиальные волокна лежать параллельно спирали мышцы (рис. 11).

"ALT =" Рисунок 11 "/>
Рисунок 11: Схема сегмента брюшка иллюстрирует группы мышц () и окрашивали препарат с метиленового синего (B) позволяет разграничить группы мышц в подготовке нетронутыми. Выделенной области в показана на Б с расширенного просмотра. В B, Del1 и 2 групп мышц не срезать, как показано на нижней половине схемы, как показано на А.

Студенту упражнения можно хотите иметь студентам ответить на следующие вопросы:

1. Что такое интероцептивные рецепторов?
2. Как интероцептивные рецепторы связаны с проприорецепторов?
3. Объясните сенсорной адаптации и как она может относиться к этой лаборатории.
4. Каков диапазон фракционирования? Что это позволяют ЦНС делать?
5. Является ли нейрон записанные фазовый или тоником тип нейрона? Почему?
   (Подсказка: Что бы вы постулат двигательной активности нейрона будет выглядеть по отношению к сенсорной активности нейронов в интактных животных)
6. На отдельном листе бумаги нарисовать график угла раки хвостом по сравнению с частотой AP.
7. Объясните тенденции, которые вы можете наблюдать на графике

Обсуждение

Информацию, указанную в соответствующем фильме и текст предоставили ключевые шаги для того, чтобы достаточно рекорд активности в MRO из раков на месте. Одной из целей нашего доклада является повышение осведомленности в потенциал этого препарата в студенческих лабораториях запустить следственных преподавать фундаментальные понятия в сенсорной физиологии. Препараты очень надежные в жизнеспособности в то же время купались в минимальном физиологическом растворе.

Управления двигателем на мышцы MRO был идентифицирован, но регулирование в передаче и потенциальных синаптической пластичности, а также эффективность передачи для возбуждающих и тормозных нейронов остается открытое пространство для исследования (Elekes и Флори, 1987а, б; Флори и Флори, 1955; Kuffler, 1954; Kuffler и Eyzaguirre, 1955).

Этот препарат может быть использован для исследования ряда экспериментальных условий, а также естественного ареала передвижения внутри животного, чтобы лучше понять биологию MRO для первичных исследований, а также демонстративное целей. Биофизические свойства этих сенсорных нейронов частично были решены в их природе адаптации в нейронной активности с поддерживаться стимул (Brown и др., 1978; Эдвардс и др., 1981;. Purali, 1997; Rydqvist и Purali, 1991; Rydqvist и Swerup, 1991). Однако, только несколько адресов отчеты нейромодуляции на этих чувствительных рецепторов и связанных с ним мышечные волокна (Cooper и др., 2003;. Паштор и Macmillan, 1990). Докладах рассматриваются только некоторые из многих соединений, которые, как известно, присутствуют в гемолимфе. Многие модуляторов и коктейли модуляторов остаются должны быть рассмотрены на MRO комплекса (мышц и нейронов). Паштор и Макмиллан (1990) сделал изучить нейромодуляторов 5-НТ и октопамин о деятельности MROs среди различных видов ракообразных, и отметил, что Есть видовые различия. Они не рассматривали подробно долгосрочного влияния этих нейромодуляторов, ни влияния на деятельность в различных статических позиций MRO.

Этот вид подготовки может помочь в понимании основе чувственного восприятия и регулирования нейронной обработки, которая играет важную роль в реабилитации и болезней для людей с блок двигателя abnormities (Патель и др., 2009;. Рабин и др., 2009;. Марино и др. ., 2010). Различных типов входных и увольнения шаблоны для совместного мониторинга перемещений в доступных беспозвоночных препараты могут быть использованы в робототехнике / протез (Макмиллан и Патулло, 2001). Есть еще много вопросов, ожидающих ответа в этом препарате, который может быть полезным в ряде направлений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
PowerLab 26T	ADInstruments
LabChart 7	ADI Instruments, Colorado Springs, CO, USA