微小循環の生体内イメージングのためのマウス精巣挙筋の準備

要約

組織の準備を可視化し、生活の微小循環の実験的操作のために説明されています。麻酔雄マウスでは、薄く、非常に血管形成精巣挙筋は細動脈、毛細血管と細静脈を含む微小血管のネットワークを研究する生体顕微鏡検査用に準備されています。この製剤は、容易にラットとハムスターに適合されている。

要約

体全体に、恒常性の維持は、酸素と副産物代謝の除去との併用栄養素の一定の供給を必要とします。このバランスは、すべての組織や器官全体の血管供給の最小の枝を包含する微小循環を介して血液の運動によって達成される。密接に実質細胞に関連付けられている毛細血管の多数に流入酸素血液の分布と大きさを制御するネットワークを形成する動脈から動脈の枝。毛細血管は、組織細胞と血液供給の間に拡散交換のための大きな表面積を提供しています。小静脈は毛細管の流出物を収集し、それらが心臓に向かって非酸素化血液を戻すように収束する。リアルタイムでこれらのプロセスを観察するには、生活の微小循環を可視化し、操作するための実験的アプローチが必要です。

ラットの精巣挙筋は、最初に組織学と電子顕微鏡死後^1,2を使用して炎症を研究するためのモデルとして使用されました。露出無傷のラットの精巣挙筋のin vivoでの報告の最初は、反射光^3を使用して血管作用薬に微小血管の反応を調べた。しかし、焦点を絞った照明の筋肉と不足の曲率は、本製剤の有用性を制限。大きな突破口は、筋肉を開いて睾丸からそれを切り離すと複合顕微鏡⁴で透視のための平らなシートとして放射状に広がって伴いました。ラット⁵とハムスター⁶の微小循環の生理機能を研究する貴重な準備であることが示されているが、マウス⁷の精巣挙筋は、微小血管の機能^8-11と細胞間のリアルタイム画像処理の制御に関与する細胞経路を解剖に特に役立っています¹²シグナリング。

睾丸が鼠径管¹³を通って降りるように精巣挙筋は、内部の斜めや横方向の腹の筋肉から導出されます。と精巣の温度を維持する：それはサポート（クレマスター=サスペンダーギリシャ語）に提供しています。ここで説明したように、精巣挙筋は、優れた光学分割のための薄い平らなシートとして調製される。マウスが安定した体温と麻酔の面で維持したまま、手術の準備は、生理食塩水で連続して、それを灌漑しながら、周囲の組織や精巣から筋肉を解放シラスティックゴムの透明な台座の上に拡散し、虫ピンでエッジを確保する関係。現在のプロトコルは、細動脈内皮細胞でGCaMP2を発現するトランスジェニックマウスを利用しています。 GCaMP2は遺伝的に符号化された蛍光カルシウム指示薬の分子の¹²です。広視野イメージングと激化電荷結合素子カメラは、細動脈内皮におけるカルシウムシグナルのin vivo試験で有効。

プロトコル

1。マウスボード、筋肉の台座、本体のウェッジと灌流液

1. マウスボード：透明な長方形のプレキシグラス板は（6"ワイドX 8"長いX 3 / 16"厚さ）顕微鏡のステージに収まるように作られています。"麻酔マウスがの手術の準備中に確保されている場所にマウスボード"が精巣挙筋。
2. 筋肉の台座：透明なシラスティックゴム台座は、メーカー° Sの指示にしたがって混合してSylgard 184、から調製される。便利な金型は15 mm厚× 50 mmの直径の直径使い捨てペトリ皿で​​す。 Sylgardのブロックは、かみそりの刃（図1Cを参照してください。）で所望の形状にカットされます。透明な防水シリコーン接着剤の薄層は、マウスボードにSylgardのブロックを保護するために使用されます。役に立つヒント：時間のための真空チャンバ内で脱ガス、ペトリ皿にSylgardを注入後の気泡を除去し、透明性を向上させる。 Sylgardのための時間が50 ° Cで数時間のために実験室のオーブンに皿を置くことによって短縮された硬化、脱気の後。
3. 体のくさびと加熱プラットフォーム：マウスの​​下にと台座に対する位置付けウェッジ（2"X 4"X 15 °）は、その原点から台座を介して精巣挙筋を拡張容易前方に体を傾斜させる。表面にアルミのプラットフォームを組み込むことにより、導電性の熱を提供します。プラットフォームは、DC電源装置（図1A）に接続された抵抗によって加熱される。プラットフォームの温度をキャリブレーション〜40 ° C〜37食道温度を維持℃にそうでない場合は、ランプからの輻射熱が使用されます。
4. ピン。台座の精巣挙筋を確保するために、ピンは"L"の形に曲げられている0.15ミリメートルの昆虫ピンから調製される。
5. 生理食塩水（PSS）。製剤は、超高純度（MΩ18.2）H _{2 O}で調製された重炭酸塩-緩衝PSSで連続的に（灌漑）灌流されていますストック溶液は20倍、最終的な作業濃度で調製し、0.2μmのフィルターを通して滅菌する。 4℃で保存した場合、ストック溶液は、数週間のための良いまま重炭酸塩とは別に塩を準備し、実験当日に希釈してこれらを組み合わせて使用​​すると、重炭酸カルシウムの沈殿を防ぐことができます。株式の塩の溶液（ミリモル/ Lで）で構成されています：2638のNaCl、94のKCl、40 MgS0 _4、23.4 CaCl _2を 。株式の炭酸は360のNaHCO ₃です。実験日に、それぞれのソリューションは、メスフラスコで最終容量（通常は特定の実験のための2リットル）に運ばれ、〜37℃の水浴に入れ5％CO ₂でPSSを平衡化/ガス分散器を用いて〜15分間95％のN _2〜7.4にpHを調整し、沈殿を防ぐことができます。 PSSは、5％CO ₂ /実験を通して95％のN ₂で連続的にバブリングする。最終的な作業溶液組成は、（ミリモル/ Lの）です：132のNaCl、4.7 KClを、1.2 MgS0 _4、2のCaCl _2、18のNaHCO _3。

2。麻酔と手術の準備

1. 動物実験用の委員会の承認に続いて、少なくとも12週齢の雄マウスが使用されます。マウスは、腹腔内（ip）注射を介してペントバルビタールナトリウム（60 mg / kg）で麻酔です。拘束チューブは最初の注射の間は、マウスを確保するための有用証明する。外科的処置および実験的なプロトコルを通じて、麻酔は必要に応じてサプリメント（最初の注射の10-20％は、ip）（;つま先や尾のピンチに撤退の反応によって示される毎に30〜60分）によって維持されています。ヒント：注入が過剰摂取の可能性を軽減する前に滅菌生理食塩水にペントバルビタール10 mg / mlのを希釈。
2. マウスはすぐに最初の注射後に保温されている必要がありますので、麻酔は、体温調節が損なわれます。加熱プレートの上に（換気アルミバスケット）は、金属製のフレームにマウスを置く（〜37 ° Cに校正された）うまく動作します。また、熱のランプは、マウスから適切な距離でそれを配置することに注意しながら使用することができます。麻酔の適切なレベルを（つま先やテールピンチに撤退の欠如）が達成されるまでマウスを5〜10分を監視する必要があります。補足投与量は15〜20分後に必要になることがあります。患者になると、特に肥満や老齢動物で、過剰摂取を避けるために慎重に進めるのが最善です。
3. 髪の毛は、慎重にそれぞれの領域を削って下腹部、腰、陰嚢と脚から削除されます。特に注意が特に精巣挙筋を傷つけるだろう陰嚢と精巣への外傷を避けるために注意する必要があります。新鮮アルコール綿棒で抜け毛を削除します。
4. 膀胱がいっぱいになっている場合には、腹壁を通って小さなブドウのように感じるでしょう。実験中にクレの準備に排尿からマウスを防ぐために穏やかな圧力を使用して膀胱を空にします。キムワイプはcollecに効果のスポンジです。トン尿。
5. その足は台座をまたいでくさびの上に横たわる、その背中にマウスを合わせます。各足に結び付けられて絹の縫合糸は、（4-0または5-0）台座に対して、その股間にマウスを保護するためのテザーを提供します。胸に緩く置かれたとウエッジに固定されたテープの部分は、全体のボディの位置を維持します。顕微解剖用はさみと角度の鉗子を用いて実体顕微鏡を通して見ながら外科手術が行われます。

3。オープン精巣挙筋の手術の準備

1. ピンは、陰嚢の頂部（左側または右側）を介して配置され、皮膚の緊張を置く台座に固定されています。 PSS（34〜35 ° C）で灌流は、術野を介して開始され、曝露された組織は、暖かく湿った保つために解剖していても維持されます。陰嚢と真空ラインの他の隣の隣の一端に配置さ芯は（キムワイプで作られた）排水PSSを削除します。シリコーンシーラントのビーズプレキシグラス板に付着し、完全にウェッジと台座を囲むには、顕微鏡にPSS漏れを防ぐために効果的な予防策として、吸い出されていないすべてのPSSを収集する"堀"の役割を果たします。
2. 切開は、陰嚢の腹側表面に沿って行われます。睾丸が腹腔内に精巣挙筋によって撤回されている場合は、下腹部で穏やかな圧力は、嚢に睾丸を指示します。睾丸を覆う精巣挙筋の表面は、この時点で識別する必要があります。陰嚢皮膚と精巣挙筋の間に結合組織は、慎重に周囲の組織から精巣挙筋を解放するために削除されます。
3. 陰嚢皮膚を穏やかに台座の近位端の後ろに後退し、ピンとそれぞれの側に固定されています。精巣挙筋の表面の外面は、結合組織がクリアされます。解剖の水和物の結合組織中に連続灌流、可視性と除去を容易にする。
4. 精巣挙筋の頂点を介してピンが縦張力の下に配置するために使用されます。縦切開は、血管供給の中断を最小限に抑えるために取ら細心の注意を払って筋肉の腹側表面を介して行われます。準備の周囲の近くに血流のダイナミクスは、この組織損傷¹⁴で変更されます。そのため、最小限に抑えるためにこれらは、イメージングおよび生理学的研究に使用されるデータの収集、準備の中心付近の血管に影響を与えます。
5. 精巣挙筋は、睾丸の下にある精巣上体に薄い靭帯によって接続されている。片側に睾丸を反映して慎重に精巣上体から分離されているこの靭帯を、公開します。精巣挙筋の頂点付近で精巣上体に接続する小型の動脈と静脈です。鉗子とそれらを引くことが離れて出血を最小限に抑えるとの間でこれらの血管を閉塞する。睾丸、精巣上体、精巣動脈と静脈は、関連する鼠径脂肪パッドと一緒に（精巣摘出術）、（4-0または5から0絹縫合糸）近位に連結し、切断して破棄されます。また、睾丸を優しく腹腔内に押し戻さと綿またはキムワイプの一部を保持することができます。精巣摘出術は腹腔内に戻って睾丸を押すと組織することが可能外傷を避けるために提供しています。我々は手順^7,15のいずれかを使用してクレマスター微小循環の準備の質の顕著な違いを（3.8節を参照）見つかっていない。
6. 精巣挙筋の外部表面は、残りの結合組織がクリアしてから、台座の表面に放射状に広がっている。エッジはそのまま微小循環と横紋筋の平らなシートを作成するために5〜6箇所にピン（1.4項を参照）で固定されています。
7. 完成した製剤は、連続的に灌流（3〜5 ml /分、34 ° C）と30分間平衡化、生体顕微鏡のステージに転送されます。
8. クレマスターの準備の整合性はいくつかの基準に従って評価されます。最小限の外科的外傷による自発的な血管運動神経性緊張は、細動脈と細静脈の接着白血球の不足で活発なフローで示されます。応答準備中の最も敏感なインデックスは、5〜10分間の灌流液の酸素含有量を高めるために細動脈の収縮です。この、21％O ₂でそれを平衡化することによって行われます（対5％O _2、1.5節を参照して、すべて5％CO _2、バランスN _2）。細動脈における白血球の存在、毛細血管を流れる赤血球の有無、および/または白血球細静脈に蓄積し、周囲の組織は、組織の損傷や炎症の徴候です。

4。精巣挙筋の微小循環の生体内イメージング

1. 生体イメージングは​​、オリンパスMVX10ステレオズームプラットフォームに基づいてカスタム顕微鏡で実行されます。 MVX10顕微鏡本体明視野（ケーラー）イメージングのための透視（ハロゲンランプ）とし、蛍光イメージングのための落射照明（水銀灯）を装備したMVX10ハイブリッドスタンドにマウントされています。落射照明を使用して、GCaMP2は35分の520 nmで収集されたエミッションと30分の472 nmで励起される。パーソナルコンピュータ上でパイパーコントロールソフトウェア（SPI）を介して、XR/Mega-10激化、デジタルカメラ（SPIスタンフォードフォトニクス株式会社）を用いて、画像はMV PLAPO 2XCレンズ（オリンパス開口数= 0.50）を介して取得されます。このシステムでは、視野（FOV）の観測されたフィールドは、22ミリメートル× 18ミリメートル〜553μmからX 442ミクロンを変化させることができます。
2. 生体内イメージング実験が完了すると、麻酔マウスは頚椎脱臼に続くペントバルビタールの過剰投与で安楽死されています。

5。代表的な結果

マウス精巣挙の準備の生体内イメージングのための図1。マウスボード。 A）アルミプラットフォームとボディウェッジは（黄色のプラスチックで絶縁）底部から見た。プラットフォームの下面に固定された発熱抵抗体は熱伝導を提供しています。 B）加熱プラットフォームは、プラスチック製のくさびにかかっている。 C）身体のウェッジは、手術と生体顕微鏡のステージへの後続の転送用のプレキシガラスのボード上に配置されます。 Sylgard台座は赤い矢印で示されています。防水シリコーンのビーズは、顕微鏡に滴下からそれを防止する、生体内の手順の間に漏出する可能性のあるソリューションを含むように全体の準備を取り囲んでいる。

図2。広視野イメージングのためのカスタムMacroZoom顕微鏡。 ）XR/Mega-10 ICCDカメラ（スタンフォードフォトニクス）とMVX10顕微鏡本体（オリンパス）は、三眼鏡ポートに取り付け。顕微鏡本体のB）クローズアップビュー。 （A）ズームコントロール（0.63〜6.3X）、（b）のフィルタホイール、（c）の画像ダブラ（25倍光学倍率とNA = 0.50）。明視野（ケーラー）照明（コンデンサーNA = 0.55、作動距離= 27 mm）のC）サブステージのコンデンサー。

図3は、マウス精巣挙の準備を完了。暖かいビニール被覆アルミニウムプラットフォーム（黄色）上の仰臥位で麻酔マウス。体の位置は、テープで固定されています。精巣挙筋は、透明なシラスティックゴムの台座の上に放射状に広げ、端部に固定されます。灌流液は、プラスチック製のドリッパー（白矢印）を介して近位端に導入される。真空ライン（白矢印）は、キムワイプの芯を経由してソリューションを削除します。二つのマイクロピペットは、組織内のそれらの先端に位置し表示されます。参照電極（銀線）は、精巣挙筋の下端に固定されています。

図4。内皮にGCaMP2を表現する細動脈のネットワークを視覚化するための倍率の範囲を図示。 A））蛍光とB明視野像は、ビデオモニタ上で総合倍率= 42Xのために3.2倍の光学倍率で撮影。 [ビューのフィールド（FOV）= 4375 X 3470程度]。スケールバー= 500μmの。この倍率で作業する任意位置でのマイクロピペットの配置を容易にします。総合倍率のための6.4xはの光学倍率で撮影したC）蛍光およびD）明視野像= 83X（FOV = 2,200 × 1759μmの）。スケールバー= 200μmの。総合倍率については12.6Xの光学倍率で撮影したE）蛍光とF）明視野像= 165X（FOV = 1,100 X 885ミクロン）。スケールバー= 100μmの。 G）の画像ダブラ、光学倍率= 25.2Xと。スケールバー= 50μmの。

ディスカッション

ここでは、 生体内で微小循環を観察するためにマウスのオープン精巣挙筋の準備方法を説明します。この手順は、まずラット⁴に記載の"オープン"クレマスターの準備の後にモデル化されています。練習すれば全体の外科的処置は1時間以内で完了することができます。この準備の多様性は、実験操作のさまざまなことができ、容易に同様の方法で研究する実験モデルのさまざまなを可能にする、ハムスターだけでなく、ラットに適応される。製剤は、雄の動物との測定値に制限されて筋肉¹⁴のエッジ付近の損傷領域を避け、組織の中心に向かってなされるべきである。また、圧力と流量分布が精巣挙筋の相互接続の船が^16をカットしているときに変更されている間に、微小血管の応答性と再現性のデータ収集に適して残っている、ことを認識すべきである。精巣挙筋の微小循環を可視化するために主な制約は、特にラットでもハムスターで、成熟した動物と大きさの増加などの結合組織の蓄積です。さらに、動物が脂肪を取るにつれて、それは、ペントバルビタールは親油性であり、脂肪組織に吸収されるので、麻酔を制御することがより困難になる。続行するための最良の方法は、動物° S体温が〜37に維持されることを保証する一方で、患者であることによって℃に露出しながら組織は、PSSで連続的に灌漑されている。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬またはデバイスの名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化ナトリウム	フィッシャー	S642 - 212
塩化カリウム	シグマ	P9541
硫酸マグネシウム	シグマ	M2643
塩化カルシウム	シグマ	C1016
重炭酸ナトリウム	フィッシャー	S233
ネンブタールナトリウム溶液	ルンドベック	NDC 67386-501-55	また、ペントバルビタールナトリウムとも呼ば
温度コントローラ	ワーナーインスツルメンツ	TC - 344B	代替：調節可能な12V DC電源
シリーズ20プラットフォームヒーターキットRH - 2	ワーナーインスツルメンツ	64から0274	特注のアルミ板が必要です
メガ- 10カメラ	スタンフォードフォトニクス	XR/Mega-10
MVX10	オリンポス
MV PLAPO 2XCレンズ	オリンポス
MVX10ハイブリッドスタンド	リーズ	LBX -ハイブリッド
パイパーコントロールソフトウェア	スタンフォードフォトニクス		メガ- 10カメラのためのプログラム
ステレオ顕微鏡	ニコン	SMZ645
防水シリコーンシーリング材（クリア）	ゼネラルエレクトリック	47970〜72643 - LW​​5000	他の透明なシリコーンシーラントでも動作する
60 × 15ミリメートルシャーレ	フィッシャー	08から757 - 13A
Sylgard	ダウコーニング	184
顕微解剖用はさみ	ファイン科学ツール	15003〜08
デュモン鉗子	ファイン科学ツール	＃45分の5
GPミリポアエクスプレスプラスメンブレン	ミリポア	SCGPT05RE
Minutiens虫ピン	アウステルリッツ	Mサイズ0.15ミリメートル
コンパクトペットトリマー	ウォールクリッパーコーポレーション	モデル9966	それぞれの使用後に清掃してください