哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

要約

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。

要約

細胞増殖の調節には、多細胞生物の開発中に組織の形態形成の中心です。さらに、細胞増殖の制御の喪失は、癌のような疾患の病態の根底にある。このように細胞増殖を調査し、細胞周期の各期の細胞の割合を定量することができるように偉大な必要性がある。それは何時の間にか大きな集団の中で自分のDNAを複製している細胞を同定するために極めて重要なもです。増殖する細胞の決定はDNA合成を開始し、細胞周期の残りの部分を進行する前にすぐにG1期に作られているので、この段階でDNA合成の検出は、細胞培養における増殖制御の状態をはっきりと判定することができます実験。

細胞内のDNA含量は、容易にヨウ化プロピジウムで染色した細胞のフローサイトメトリー、蛍光DNAインターカレート色素によって定量することができる。同様に、アクティブなDNA合成は、細胞を採取し、酸不溶画分に放射能の取り込みを測定、放射性チミジンの存在下で細胞を培養することによって定量することができる。我々は、細胞周期の解析でかなりの専門知識を持ち、異なるアプローチをお勧めします。我々は最近合成されたDNAの中にこれらのチミン類似体の取り込みを検出するブロモデオキシウリジン/ fluorodeoxyuridine（BrdUのように単に略す）染色を用いて細胞増殖を調査。ラベル付けと染色細胞をBrdUで、フローサイトメトリー¹で、ヨウ化プロピジウムおよび分析によって全DNAの染色と組み合わせると、細胞周期の様々な段階での細胞の最も正確な尺度を提供しています。それはアクティブなDNA合成の検出を組み合わせたので、ヨウ化プロピジウムから総DNA含量と、BrdUの抗体ベースの染色を通して、私たちの推奨される方法です。これは初期のS期からG1の細胞の明確な分離、またはG2 / Mから後期S相を可能にさらに、このアプローチは、これらの異なる細胞周期の段階を経て進行の調節に多くの異なる細胞の刺激と薬理学的薬剤の効果を調べるために利用することができます。

本報告書では、フローサイトメトリーによって培養細胞、並びにそれらの分析をラベリングし、染色するための方法を説明します。我々はまた、このメソッドはそのようなそのようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのTGF -β1、および増殖阻害剤などのサイトカイン、p27KIP1からの成長を阻害する信号の影響を測定するためにどのように使用できるかの実験例が含まれています。我々はまた、より大きな文化⁵内の細胞の亜集団の細胞周期の位置の分析ができるように代替プロトコルが含まれています。このケースでは、我々は非常に同じ文化の中でトランスフェクトされていない細胞で劣勢であっても網膜芽腫遺伝子をトランスフェクションした細胞で細胞周期の停止を検出する方法を示します。これらの例は、そのDNAの染色多くの方法を説明し、フローサイトメトリーを利用し、哺乳類の細胞周期制御の基本的な問題を調査するために適応させることができます。

プロトコル

1。細胞の標識と固定

1. 細胞増殖の標識試薬（BrdU）の1mLあたりの細胞培養培地（1〜1000希釈）収穫前に1時間の1μLを加える。標識期間が遅く増殖する細胞のために長くする必要があります。
2. 収穫の細胞に、吸引培養液とリン酸塩で十分に洗浄は生理食塩水（PBS）を。徹底的に培地のトレースを削除する繰り返します。
3. すぐにPBSが3mmのEDTAを含むと三度目の文化を洗い、よく吸引除去する。
4. 各ディッシュに3mmのEDTAを含むPBSの小さなボリュームを追加、6 cmディッシュ用0.5 mLのが理想的です。 ° C、細胞を分離するために約5分間、22でインキュベートする。 15 mLコニカルチューブに移す。
5. ペレットに5分間500 × gで細胞を遠心、上清を除去し、PBS 100μLで徹底的に再懸濁します。
6. ボルテックスしながら、95％エタノール、滴下5 mLを加えることによって細胞を固定する。このステップでは、細胞は少なくとも4℃で保存することができます月。

2。 BrdUとDNAの変性と染色

1. 細胞をペレット化まで5分間500 × gで細胞を遠心分離し、95％EtOHを削除します。ボルテックスしながら滴下方式で追加することで、2NのHClを1 mLおよび0.5％TX - 100で再懸濁します。 30分間室温でインキュベートする。
2. セクション2.1で以前と同様に遠心し、細胞がこの段階では非常に緩いペレットを形成するので、慎重に上清を吸引除去する。優しく0.1M NAB ₄ O ₇液（pH8.5）1mlに再懸濁し、室温で少なくとも30分間インキュベート。
3. 上記のセクション2.1およびマウス抗BrdU抗体を用いた抗体の溶液0.5mL（PBS、1％BSAおよび0.2％Tween - 20を含む）に再懸濁させるなど、細胞をペレット化は、1から50件を希釈。 30分間室温でインキュベートする。
4. 細胞をペレット化は、再びとFITCに結合したウサギ抗マウス二次抗体を含む抗体溶液50mLに再懸濁し25対1に希釈。上で30分間インキュベートベンチトップと光から保護する。
5. 遠心細胞ヨウ化プロピジウムおよびRNase溶液0.5mL（1％BSA、10 mg / mLのヨウ化プロピジウム、0.25 mg / mLのRNase Aを持つPI - RNase A液、PBS）で最終的な時間と再懸をし、37℃暗所でインキュベートします30分間。またRNAは、4℃で一晩消化することができます℃の暗所で。
6. 凝集物を除去して、フローサイトメーターでサンプルの取り込みのための適切なチューブに単一細胞を収集するために、セルストレーナーを通してソリューションを渡します。再び、サンプルは光を直接浴びることから保護する必要があります。

3。フローサイトメトリーによる解析

1. 細胞はヨウ化プロピジウムおよびFITCのための適切な検出機能を備えた二重線（一つとしてフローセルを通過する2セル）を差別することができる標準的なフローサイトメーターで分析する必要があります。単一の細胞は前方散乱と側方散乱のポップに基づいてイベントのゲーティングすることで、このフローサイトメトリーのアプリケーションで検出することができますulations、およびヨウ化プロピジウムによってDNA染色のプロパティを使用します。二重特異なドットプロットの外観は、フローサイトメーターの間で変化すると、ヨウ化プロピジウム染色の特性に依存している、あなたの分析でダブレット識別器のセットアップのアドバイスについては、地域のフローサイトメトリー機能を参照してください。一般的に、細胞の非同期的に増殖人口で、単一の細胞は通常、二重特異なプロットの中で、最も豊富なピーク（2Nと4N DNA）であり、ゲートは、その周りに描画する必要があります。これは、以下のすべてのその後の分析に使用される単一のセルのイベントを選択します。
2. 分析する最初のサンプルは、染色とフローサイトメーターのセットアップのためのポジティブコントロールとして機能する非同期で増殖して文化にする必要があります。一細胞から2Nと4NのピークがX軸上に200〜400（任意単位）を中心としているように、ヨウ化プロピジウム染色に光電子増倍管の感度を調整します。私たちはしばしば豊富なのを染色フローサイトメーターのすべてのパラメータが、このサンプルを使用することなく適切に調整されていることを保証するためにこれらの細胞のupply。新しいユーザーはフローサイトメーターの操作に慣れるためには、このポジティブコントロールにも便利です。
3. G1とG2 / M集団がバックグラウンドより上になるようにFITC検出用光電子増倍管の感度を調整します。のBrdU陽性細胞は約10倍明るくし、Y軸を対数目盛として表示する必要があるはずです。それは明らかに陽性染色細胞を区別するために、BrdU染色用のネガティブコントロールを（上記の手順2.3で非特異的IgGと抗BrdU抗体を置き換えることによって）インクルードすると便利な場合があります。
4. 単一のイベントがG2 / Mの右下にS相とダウンするまでの左下にあるフローサイトメーターの形でG1から馬蹄形の弧をキャプチャするような、ヨウ化プロピジウムとFITCとの間の補償を調整する深さDISの詳細については、次のリファレンスを参照してください。特定のアプリケーション²の中のあるフローサイトメトリーおよび参照の原理と使用のcussion。

4。データ分析

1. DNA含有量の所望の範囲で5 000〜10 000単セルのイベントは、培養中の細胞の集団が徹底的にサンプリングされているという自信を持たせるために、各サンプルのために収集する必要があります。
2. 一度細胞が彼らはG1、S、またはG2 / M期に割り当てる必要がヨウ化プロピジウムとBrdUのコンテンツのために測定されている。 200および400（それぞれG1及びG2 / M）を中心とtwoのBrdU陰性の集団の周囲にゲートを描画することによってこれを行います。これらのボックスの上のすべては、S相（図1A）を測定する単一のゲートに含まれるべきです。各ゲートの細胞の割合は、G1、S、およびG2 / M（図1B）における細胞の相対数を表します。

5。細胞の混合集団における細胞周期の分析のための代替プロトコル

1. この代替プロトコルは、最も有用な時に細胞の純粋な集団を選択するために薬物治療が不可能な発現ベクターのトランスフェクションは、日常的に関心の遺伝子産物を発現する細胞の割合が低いの結果、または。 untransduced細胞の大集団で汚染されている目的の細胞の比較的小さな割合でこの結果。そのようなGFP ^3をアンカー膜、またはそのようなCD19 ⁴などの外国の細胞表面マーカーとして、フローサイトメトリーでトランスフェクトした細胞を検出するためのマーカーを発現するプラスミドと共にあなたの遺伝子や関心のshRNAを発現するこの場合は、同時トランスフェクションプラスミド、またはCD20 ^5。
2. このプロトコルの目的のために我々は例として、CD20染色を使用する、しかし、CD19についての染色は基本的に同じです。 CD20とトランスフェクションの場合、i上のセルに20μLFITC結合抗CD20抗体を加えることによって1.2から1.5まで上記の手順で説明したように、単に収穫の細胞、のBrdUラベルする必要があると汚れはありません暗所で20分間CE。として、ステップ1.6で説明されているセルを修正。細胞を再び4℃で1か月間保存することができます。·ダークのC。 GFPの検出のために、このステップと修正から抗体染色を省略して説明したように細胞を保存する。
3. 5分間500 × gで遠心分離でペレット化し、PBS、1％BSAを含む5mLに懸濁することにより再水和物細胞。
4. セクション2.5で説明したように、ヨウ化プロピジウムおよびRNase溶液0.5 mLを5分間再懸濁します細胞500 × gで再ペレット細胞。
5. 3.1と3.2で2.6のセルの準備手順と解析の指示に従って続行。
6. 未染色細胞が背景より上になるようにFITC検出用光電子増倍管の感度を調整します。理想的には、CD20 - FITC陽性細胞は100倍より強く染色されたバックグラウンドよりも最大10倍となり、このプロットのY軸は対数目盛（図2A）として表示されます。 backgより10倍明るいCD20陽性細胞図に示すように円形に（と200と400の間にヨウ化プロピジウム染色による）ヒストグラム、ヨウ化プロピジウムとセル数で表示するために選択する必要があります。 2C。容易に（100倍背景上記のすなわち10倍）明るく染色されているマーカーを発現する細胞株の場合はCD20陽性カットオフは、10Xの背景に設定する必要があります。目的の遺伝子をも弱く、これらの細胞で発現されているため、弱い染色細胞の包含は、おそらく、これらの実験でばらつきが増大します。だけ弱く染色されたCD20陽性を（10X背景未満すなわち）を得た細胞株の場合は、カットオフの決定は、CD20染色した、トランスフェクトされていない細胞から成るネガティブコントロールを使用して行う必要があります。
7. 少なくとも1000 CD20陽性のイベントは、各サンプルのために収集する必要があります。 1000イベントは、高い変動性を生み出すことが少ないとの実験。このようなModFit LT（Verityのソフトウェア）、マルチサイクルのAV（フェニックスフローシステム）、およびフロージョー（木スター）などのソフトウェアパッケージは、数学的な推定値を使用このような図に示すようなヒストグラムのカーブの形状に寄与G1、S、およびG2 / M集団。 2BとC.

6。代表的な結果：

私達は私達のアプローチを使用して実験的な細胞周期の分析の3つの例を提供します。最初は、マウス胚性線維芽細胞におけるサイクリン依存性キナーゼ阻害剤のp27KIP1のレトロウイルス発現を使用しています。ウイルス感染のための薬剤の選択が完了した二十四時間後、細胞は、パルスが1時間のBrdUで標識した。この実験では阻害剤の異所性発現は、細胞（図3AとB）の増殖を阻止するために使用されます。図に示す。 3B少しBrdUのポジティブイベントはP27に対応してS期のゲートで顕著となっている。図diagramedとして同様に、p27の発現細胞のS相の細胞の割合はかなり低いです。 3C。このタイプの分析では、gの様々な系統由来の細胞における細胞周期制御の欠陥を特徴付けるに非常に効果的であったマウス^6、7、8 -エンを対象。

第二の実験では、非形質転換乳腺上皮細胞（MCF10A）は24時間成長因子ベータつ（TGF -β1）を変換する、増殖抑制サイトカインで処理した。細胞は、収穫の直前に四時間のBrdUで標識した。図に示す。 S期細胞の4 BrdUラベリングが大幅にTGF -β1シグナリングによって減少され、私たちの染色の特異性は、IgG抗体陰性対照（図4C）で検証されます。細胞周期の異なる相の定量化は、TGF -β1は、主にこの段階での蓄積につながる、細胞周期のG1期で増殖を阻害する確認する。

私たちの最後の例では、pRBの欠損SaOS - 2細胞は、CMV - CD20発現ベクター及びCMV - RBまたは対照としてCMV -β- Galのいずれかでトランスフェクトされる。三日後、次のトランスフェクション細胞を染色し、収穫、そして修正されました。これらの細胞のフローサイトメトリー分析のを図に示します。 5。これはpRBの発現（図5B）の72時間以下のディストリビューションと比較して、ネガティブコントロール、トランスフェクト細胞（図5A）の細胞周期の分布を示しています。マルチサイクルソフトウェアによるカーブフィッティングに続いて、細胞周期の比率の直接比較をFig。 5C。これはG1以下pRBの発現における細胞の蓄積とS及びG2 / M期からの細胞の相対的な枯渇を明らかにする。我々は、G1期停止機構広範囲に^{9、10、11、12、13を}プローブするために、このアッセイのバリエーションを使用している。

これらの例は、細胞周期の制御が刺激や細胞の操作、様々に対応して測定できる方法を示しています。このアプローチは、したがって、文化の型の実験における細胞周期の位置の測定を必要とする多くのアプリケーションに適合させることができます。

図1。Quantit複合ヨウ化プロピジウムおよびBrdU染色（PI - BrdU）のによる細胞周期のフェーズについて注意深く検討する必要があります。 （A）このパネルには、ヨウ化プロピジウムおよびBrdU染色された細胞の三次元フローサイトメトリーを表示します。 2Nと4N DNA含量を持つ細胞はヨウ化プロピジウム染色強度のX軸のスケール上で200と400マークの中心にされることに注意してください。 BrdUの染色強度をY軸に対数目盛で測定されます。細胞周期のG1、S、およびG2 / M期で細胞を定量するために使用するゲートの位置に注意してください。 （B）からG1、S、およびG2 / Mゲートのそれぞれの細胞の相対的な割合は、このグラフに示されています。

図2。ヨウ化プロピジウムと細胞表面マーカーCD20を使用して、選択した細胞における細胞周期相の定量。 （A）このパネルには、ヨウ化プロピジウムおよび異所性にCD20とpRBのを表現するそのうちのいくつかの細胞、の混合物のためのCD20染色を示す。なお、ある細胞2Nと4NのDNA（最も豊富な集団）がX軸上に200と400符以上集中している。 CD20 +ゲートの位置は、バックグラウンドより少なくとも10倍以上の明るく染色されているセルを選択します。 （B）ヨウ化プロピジウム染色対細胞数のグラフは、非同期的に増殖しているパネルのCD20陰性細胞のために示されています。 （C）のようなグラフは、pRBの発現を阻止し、主に2NのDNA含量と細胞を含むように誘導されているパネルからのCD20陽性細胞のために示されています。これは、この染色の技法を使用してこの文化の中で他の細胞と区別することができます逮捕されたサブ母集団ことを示している。

p27KIP1による細胞増殖の図3。抑制。 （A）PI - BrdUの分析は、空のpBABEレトロウイルスvectoで形質導入した細胞の非同期的に増殖集団における細胞周期の段階を測定するために使用されるR. （B）細胞の同様の分析は、pBABE - P27で形質導入。 S期とG1とG2 / Mゲートでのイベントの大きい強度で細胞の有無に注意してください。非同期的に増殖制御とp27の発現細胞における細胞周期の各相における細胞の（C）定量。

図4。TGF -β1による細胞増殖の阻害非同期MCF10A細胞を増殖さの（）PI - BrdUの分析。 24時間TGF -β1の100 pMので処理した細胞の（B）の分析。主に細胞周期のG1期の細胞の蓄積に注意してください。非同期的に増殖する細胞の非特異的IgGコントロールと抗BrdU一次抗体を置き換えることにより、BrdU染色の（C）検証。 AとBからそれぞれの細胞周期の（D）グラフィカル定量

図5。pRBのによる細胞増殖の阻害。 （）CD20のヨウ化プロピジウム染色とβ- galをトランスフェクトされた細胞対細胞数が表示されます。亜集団トランスフェクトするための不適切なコントロールとして - トランスフェクションは、部分的にトランスフェクトされていない人口（細胞CD20）をレンダリング、セルを同期できるので、これは重要なコントロールです。トランスフェクションされた細胞は、他の同様にトランスフェクトされた細胞と比較する必要があります。 （B）細胞数に対するCD20とpRBのトランスフェクション細胞のヨウ化プロピジウムのグラフ。 2Nピークのほぼ排他的な存在に注意してください。 （C）細胞周期の位相の割合のグラフィカル表示は、マルチサイクルのソフトウェアでカーブフィッティング方法を使用してAとBから決定。

ディスカッション

我々の経験では、これらの技術の成功は、いくつかの重要なコントロールや実験条件に依存しています。一つは、これらの実験で使用するために非同期的に増殖制御を確立しています。このコントロールは、次の3つの重要な役割を果たします。最初、それはすべての実験サンプルに使用される培養条件は、治療の不在で継続的な増殖をサポートするために適切であることを保証します。また、このサンプルでは、​​彼らが存在しているときのBrdUまたはCD20陽性細胞を検出することができることを保証するために染色の方法論のためのポジティブコントロールの目的を果たします。最後に、このサンプルは、フローサイトメーターを校正するために使用されます。このコントロールのサンプルは、それぞれ200および400℃で2Nと4Nの細胞を検出するために、ヨウ化プロピジウム染色強度を調整するために使用することができます。また、BrdUをまたはCD20の検出感度は、負と正の信号がとして、図1Aおよび2Aに示すように中央に配置されるように調整することができます。すべてのサンプルでは、​​PI - Rの細胞の同じような濃度を持っているときに次のサンプルが実行されるようにNaseのソリューションは、その後サイトメーターにいくつかの調整が必要とされています。これは図に示す理由から重要である。強力なG1の蓄積は、本質的にG2 / Mと間違って解釈される可能性単G1ピークを作成4Bおよび5B

代表的な実験はまた、他の重要なポイントを作る。まず第一に、彼らはBrdUの取り込みとラベリングが細胞型間で異なることを示しています。このため、経験的に十分にS期に細胞を検出するために必要なパルスや染色条件の長さを決定することが重要です。一般的には、細胞型未満24時間以上の培養でその二重は、時間でのBrdUで標識することができます。遅い成長している細胞の種類は、抗体染色の条件と期間に長いパルスと変化が必要な場合があります。彼らは4回限りのための抗体の倍標準濃度で4時間で染色するためのBrdUで標識されたとしてMCF10A細胞は、この点で素晴​​らしい例です。調べではこれは、誤ってS期の人口のG2 / M細胞を含むことにつながることができるようにも非常にゆっくり増殖する細胞を用いて標識BrdUの6時間を超えないように注意する必要があります。第二に、TGF -β1のものとp27KIP1発現の効果を比較することで、それはTGF -β1シグナル伝達がG1停止を誘導しながらP27はG1またはG2 / M期のいずれかで蓄積を誘導できることは明らかである。例えば^、3 H -チミジン取り込みとシンチレーション計数として増殖を検出する従来の手段は、これらの可能性を区別することはできません。

私たちの別のプロトコルでは、大規模なトランスフェクトされていない集団における細胞の亜集団の検出を示しています。経験的にトランスフェクトした細胞を検出するための最も適切なレポーターを決定することが重要です。我々の経験ではいくつかの細胞型のいずれかの明示細胞表面マーカーが不十分、または形質膜へのトラフィック、それらを、トランスフェクションされた細胞を検出不能になり正しくできません。 Likewise、すべての細胞がGFPの膜結合形態を容認しない。最も適切なレポーターの選択は、トランスフェクションレポーターの効率だけでなく、トランスフェクトされていないコントロールと比較して発現の相対強度を評価することによってなされるべきである。理想的には、これらの分子の異種発現の忍容性は良好とこれは、マーカーが細胞周期の分布に影響を与えずに少しを持っていることを示唆するものであることになります。

フローサイトメトリーのアプローチこ​​れらの種類の制限の一つとして、彼らは1つだけ別のに比べて細胞周期相の相対的存在量を確立することができることです。図3のp27の発現は、真のG1およびG2 / Mで停止を誘導する場合、またはそれだけでS期への相対これらの段階を経て進行を遅くする場合は、このような理由からそれがあいまいです。これらの可能性は、有糸分裂などノコダゾールなどの阻害剤、またはアフィジコリンのようなG1 / S阻害剤と細胞のパラレルサンプルを処理することにより、さらに検討することができる。これらの薬剤は、ドミナを作成するのでNTのM期で停止またはそれぞれS期初期では、徐々に増殖する細胞は、薬物誘導逮捕の時点で蓄積される。コントロール細胞は、M -相¹³に蓄積される一方例えばので、pRBの発現のG1で停止した細胞は、ノコダゾールの治療にもかかわらずG1のままになります。

一緒に、これらの実験的アプローチは、哺乳類細胞周期の研究の問題の広い範囲に適用できる柔軟な方法論を提供します。彼らは容易に細胞周期の進行に変化を検出し、コントロールと比較して相違点を定量することができる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/装置の名前	会社	カタログ番号	コメント（省略可能）
細胞増殖の標識試薬	GEアマシャム	RPN201
抗BrdU抗体	BDバイオサイエンス	347580
抗マウスFITC標識抗体	ベクトル研究所	FI - 2000
細胞株のフィルタ	BDファルコン	352235
抗CD20抗体	BDバイオサイエンス	347673
マルチサイクルソフトウェア	フェニックスフローシステム	N /