Análise da posição do ciclo celular em células de mamíferos

Resumo

Determinar a posição do ciclo celular de uma população de células, ou a compreensão de como os sinais de afetar a proliferação, pode ser facilmente medido por citometria de fluxo usando esse protocolo. Relatamos uma abordagem simples experimental da coloração células e quantificar a sua posição no ciclo celular.

Resumo

A regulação da proliferação celular é fundamental para a morfogênese do tecido durante o desenvolvimento de organismos multicelulares. Além disso, perda de controle da proliferação celular está subjacente a patologia de doenças como o câncer. Como tal não há grande necessidade de ser capaz de investigar a proliferação celular e quantificar a proporção de células em cada fase do ciclo celular. É também de vital importância para indistinguivelmente identificar as células que replicar seu DNA dentro de uma população maior. Desde a decisão de uma célula a se proliferar é feita na fase G1, imediatamente antes de iniciar a síntese de DNA e progredindo pelo resto do ciclo celular, a detecção da síntese de DNA nesta fase permite uma determinação inequívoca do estado de regulação do crescimento em cultura de células experimentos.

Conteúdo de DNA nas células podem ser facilmente quantificados por citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio, um corante fluorescente intercalando DNA.Da mesma forma, a síntese de DNA ativo pode ser quantificada pela cultura de células na presença de timidina radioativa, a colheita das células, e medir a incorporação de radioatividade em uma fração insolúvel em ácido. Temos uma experiência considerável com a análise do ciclo celular e recomendar uma abordagem diferente. Nós investigamos a proliferação celular usando bromodeoxiuridina / fluorodeoxyuridine (abreviado simplesmente como BrdU) coloração que detecta a incorporação destes análogos timina no DNA recentemente sintetizado. Rotulagem e coloração das células com BrdU, combinado com coloração DNA total de iodeto de propídio e análise por citometria de fluxo oferece ^uma medida mais precisa das células nas várias fases do ciclo celular. É o nosso método preferido porque combina a detecção de síntese de DNA ativo, através da coloração de anticorpos base de BrdU, com conteúdo de DNA total de iodeto de propídio. Isso permite a clara separação de células em G1, da primeira fase S, ou S final da fase G2 / M.Além disso, esta abordagem pode ser utilizada para investigar os efeitos de muitas células diferentes estímulos e agentes farmacológicos sobre a regulamentação da progressão por essas fases diferentes do ciclo celular.

Neste relatório nós descrevemos métodos para a rotulagem e coloração células cultivadas, bem como a sua análise por citometria de fluxo. Nós também incluímos exemplos experimental de como este método pode ser usado para medir os efeitos de sinais que inibem o crescimento de citocinas como TGF-β1, e inibidores da proliferação, tais como o inibidor da quinase ciclina dependente, p27KIP1. Nós também incluímos um protocolo alternativo que permite a análise da posição do ciclo celular em uma subpopulação de células dentro de uma cultura maior ^5. Neste caso, demonstramos como detectar uma parada do ciclo celular em células transfectadas com o gene retinoblastoma, mesmo quando muito ultrapassados ​​pelas células untransfected na mesma cultura. Estes exemplos ilustram as várias maneiras que a coloração do DNA ecitometria de fluxo podem ser utilizados e adaptados para investigar questões fundamentais de controle do ciclo celular de mamíferos.

Protocolo

1. Rotulagem e fixação de células

1. Adicionar 1 mL de Reagente Labeling Proliferação Celular (BrdU) por mL de meio de cultura celular (1-1000 diluição) 1 hora antes da colheita. O período de rotulagem pode precisar ser aumentado para mais lento células de crescimento.
2. Às células colheita, meio de cultura aspirado e lavar cuidadosamente com tampão fosfato salino (PBS). Repita o procedimento para remover completamente os traços de médio porte.
3. Lavar as culturas rapidamente uma terceira vez com PBS contendo EDTA 3mm e aspirar completamente.
4. Adicionar um pequeno volume de PBS contendo EDTA 3mm a cada prato, 0,5 mL de um prato 6 centímetros é o ideal. Incubar a 22 ° C por aproximadamente 5 minutos para separar as células. Transferir para um tubo cônico de 15 mL.
5. Células Centrifugar a 500 xg por 5 minutos para pellet, remover o sobrenadante e ressuspender completamente em 100 L de PBS.
6. Fix células adicionando 5 mL de EtOH 95%, gota a gota, enquanto vórtex. Nesta etapa, as células podem ser armazenadas a 4 ° C durante pelo menos ummês.

2. Desnaturação e coloração de BrdU e DNA

1. Centrifugar a 500 xg células por 5 minutos para as células pellet e remover EtOH 95%. Ressuspender em 1 ml de HCl 2N e 0,5% Tx-100, acrescentando de forma gota sábios quando vórtex. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
2. Centrífuga como antes na seção 2.1 e aspirar cuidadosamente o sobrenadante vez que as células formam um pellet muito solto nesta etapa. Delicadamente ressuspender em 1 ml de 0,1 M NAB ₄ O ₇ (pH 8,5) e incubados por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente.
3. Células pelota como acima na seção 2.1 e ressuspender em 0,5 mL de solução de anticorpos (PBS contendo 1% de BSA e 0,2% Tween-20) com o mouse anti-BrdU anticorpos diluídos 1-50. Incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
4. Células de pelotas de novo e ressuspender em 50 mL de solução contendo anticorpo de coelho anti-rato anticorpos secundários conjugados com FITC diluído 1 a 25. Incubar por 30 minutos embancada e proteger da luz.
5. Células centrífuga vez que uma final e ressuspender em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase (PI-RNAse solução PBS com BSA 1%, 10 mg / mL de iodeto de propídio, 0,25 mg / mL de RNase A) e incubar no escuro a 37 ° C por 30 minutos. Alternativamente RNA pode ser digerido durante a noite a 4 ° C no escuro.
6. Passe solução através de um filtro para remover células agregados e coletar células individuais em um tubo adequado para a captação de exemplo no seu citômetro de fluxo. Novamente, as amostras devem ser protegidas da exposição direta à luz.

3. A análise por citometria de fluxo

1. As células devem ser analisadas por um citômetro de fluxo padrão que é capaz de discriminar doublets (duas células que passam através da célula de fluxo como um) com capacidade de detecção apropriados para propidium iodeto e FITC. Células individuais podem ser detectados no presente pedido de citometria de fluxo pela passagem para eventos baseado em dispersão para a frente e lado pop dispersãolamentos, e usando as propriedades de coloração de DNA pelo iodeto de propídio. A aparência de um gráfico de pontos doublet discriminação varia entre citómetros de fluxo e se baseia em propriedades coloração propidium iodeto, ver suas instalações citometria de fluxo locais para aconselhamento sobre a criação de um discriminador doublet em sua análise. Em geral, em uma população de maneira assíncrona proliferação de células, as células individuais são geralmente os dois picos mais abundante (2N e 4N DNA) na parcela doublet discriminar e um portão deve ser elaborado em torno deles. Isso irá selecionar os eventos única célula que são utilizados para todas as análises subseqüentes abaixo.
2. A primeira amostra a ser analisada deve ser uma cultura de forma assíncrona proliferando que serve como um controle positivo para a coloração e citômetro de fluxo set-up. Ajustar a sensibilidade de tubos fotomultiplicadores para propidium coloração iodeto de tal forma que os picos 2N e 4N a partir de células singlet estão centradas em 200 e 400 (unidades arbitrárias) no eixo-X. Que muitas vezes mancha uma abundante supply dessas células para garantir que todos os parâmetros do citômetro de fluxo foram ajustados de forma adequada sem usar essa amostra. Este controle positivo também é útil para os novos usuários a se familiarizar com o funcionamento do citômetro de fluxo.
3. Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tais que as populações G1 e G2 / M estão acima do fundo. Células BrdU positivas devem ser aproximadamente 10 vezes mais brilhante eo eixo Y deve ser exibido como uma escala logarítmica. Às vezes é útil incluir um controle negativo para a coloração de BrdU (substituindo os anticorpos anti-BrdU com os não-específicos de IgG no passo 2.3 acima) para distinguir claramente células marcadas positivamente.
4. Ajustar a compensação entre propidium iodeto e FITC tal que eventos únicos capturados pelo formulário citômetro de fluxo de um arco de ferradura em forma de G1 no canto inferior esquerdo até S-fase e para baixo no canto inferior direito para o G2 / M. Por favor, consulte a seguinte referência para uma análise mais profunda discussão dos princípios e uso de citometria de fluxo e referências lá para aplicações específicas ^2.

4. A análise dos dados

1. 5 000 a 10 000 eventos única célula com a gama de conteúdo pretendido DNA devem ser coletados para cada amostra, a fim de ter a confiança que a população de células na cultura têm sido exaustivamente amostradas.
2. Uma vez que as células têm sido medidos para propidium iodeto e conteúdo BrdU eles precisam ser atribuídos às fases G1, S ou G2 / M. Faça isso pelo desenho portões em torno das duas populações BrdU negativos centrados em 200 e 400 (G1 e G2 / M, respectivamente). Acima de tudo estas caixas devem ser incluídos em uma única porta que mede S-fase (Fig. 1A). A porcentagem de células em cada porta representa o número relativo de células em G1, S e G2 / M (Figura 1B).

5. Protocolo alternativo para a análise do ciclo celular em uma população mista de células

1. Este protocolo alternativo émais útil quando a transfecção de vetores de expressão rotineiramente resulta em uma baixa percentagem de células que expressam o produto do gene de interesse, ou quando o tratamento medicamentoso para selecionar uma população pura de células é impraticável. Isso resulta em uma proporção relativamente pequena de células de interesse de ser contaminada com uma grande população de células untransduced. Neste caso, co-transfecção de plasmídeos expressando seu gene ou shRNA de interesse juntamente com um plasmídeo que expressa um marcador para a detecção de células transfectadas por citometria de fluxo, como uma membrana ancorada GFP ^3, ou um marcador de superfície externa de células, tais como CD19 ⁴ ou CD20 ^5.
2. Para efeitos do presente protocolo, vamos utilizar coloração CD20 como um exemplo, no entanto, coloração para CD19 é essencialmente idêntica. No caso de transfecção com CD20, não há necessidade de rotular BrdU, simplesmente células colheita conforme descrito nas etapas 1,2-1,5 acima e mancha pela adição de 20 mL FITC conjugado anti-CD20 anticorpos para as células na ice por 20 minutos no escuro. Fix células, como descrito em 1.6 passo. Células podem novamente ser armazenados por pelo menos um mês a 4 ° C no escuro. Para a detecção de GFP, omitir a coloração de anticorpos a partir desta etapa e corrigir e armazenar células como descrito.
3. Re-hidratar as células por peletização na centrífuga a 500 xg por 5 minutos e ressuspensão em 5 mL de PBS contendo BSA 1%.
4. Re-agregar as células a 500 xg por 5 minutos e ressuspender as células em 0,5 mL de iodeto de propídio e solução de RNase, como descrito acima na seção 2.5.
5. Continue a seguir as instruções de preparação de células em 2,6 e análise instruções em 3.1 e 3.2.
6. Ajustar a sensibilidade do tubo fotomultiplicador para detecção FITC tal que não coloridas estão acima do fundo. Idealmente, CD20-FITC células positivas será 10X a 100X mais intensamente manchado do fundo eo eixo Y deste lote deve ser exibido como uma escala logarítmica (Fig. 2A). Células CD20 positivas que são mais brilhantes do que 10X background (e com coloração propidium iodeto de entre 200 e 400) devem ser selecionados para exibição em um iodeto de propídio contra a contagem de células histograma como mostrado na figura. 2C. Para linhagens de células que expressam marcadores que são facilmente coradas intensamente (10X ou seja, a 100X acima do fundo), o CD20 positivo de corte deve ser definido no fundo de 10X. Inclusão de células mais fraca coloração aumenta a variabilidade nesses experimentos, presumivelmente porque o gene de interesse também é fracamente expresso nessas células. Para linhas de celular que só o rendimento fracamente coradas CD20 positivos (ou seja, menos do que o fundo de 10X), determinação de um off corte deve ser feito usando um controle negativo composto por CD20 manchadas, as células untransfected.
7. Pelo menos 1000 CD20 eventos positivos devem ser coletados para cada amostra. Experimentos com menos que 1000 irá produzir eventos alta variabilidade. Pacotes de software, tais como ModFit LT (Verity Software), Multi AV Ciclo (Phoenix Sistemas de Fluxo), e Jo Flow (Árvore Star) utilizar estimativas matemáticas deas populações G1, S e G2 / M que contribuem para a forma da curva em histogramas como os mostrados na figura. 2B e C.

6. Resultados representativos:

Nós fornecemos três exemplos de análises célula experimental, utilizando o ciclo nossas abordagens. O primeiro usa a expressão retroviral inibidor da ciclina dependente p27KIP1 quinase em fibroblastos do ratinho embrionárias. Vinte e quatro horas após a seleção da droga para a infecção viral foi completa, as células foram marcadas com BrdU pulso durante uma hora. Neste experimento expressão ectópica do inibidor é usado para prender a proliferação das células (Fig. 3A e B). Como mostrado na figura. Eventos 3B pouco BrdU positivas são evidentes no portão fase S em resposta a p27. Da mesma forma, a porcentagem de células em fase S de células que expressam p27 é bastante baixo conforme ilustrado na figura. 3C. Este tipo de análise tem sido muito eficaz na caracterização da célula defeitos ciclo de controle em células derivadas de várias cepas de gene-alvo camundongos ^{6, 7, 8.}

No segundo experimento, não transformado células epiteliais mamárias (MCF10A) foram tratadas com a citocina inibitória de crescimento, transformando beta do fator de crescimento de um (TGF-β1) por 24 horas. As células foram marcadas com BrdU por quatro horas imediatamente antes da colheita. Como mostrado na figura. 4 rotulagem BrdU na fase S-células é muito diminuída por TGF-β1 sinalização, a especificidade da nossa coloração também é validado com um controle IgG negativo (Fig. 4C). Quantificação das diferentes fases do ciclo celular confirma que TGF-β1 principalmente inibe a proliferação na fase G1 do ciclo celular, levando a um acúmulo nesta fase.

Em nosso último exemplo, pRB deficiente SAOS-2 células são transfectadas com um vetor CMV-CD20 expressão e quer CMV-RB ou CMV-β-Gal como um controle. Três dias após transfecção as células foram colhidas, coradas e fixo. Análise de citometria de fluxo dessas célulass é mostrado na figura. 5. Isso demonstra a distribuição do ciclo celular de células transfectadas controle negativo (Fig. 5A), em comparação com a seguinte distribuição de 72 horas de expressão PRB (Fig. 5B). Após ajuste de curva por software Ciclo Multi, uma comparação direta da proporção de fases do ciclo celular é mostrado na figura. 5C. Isso revela o acúmulo de células em G1 expressão pRB seguinte eo esgotamento relativo de células das fases S e G2 / M. Temos usado variações sobre este ensaio para sondar mecanismos prisão G1 extensivamente ^{9, 10, 11, 12, 13.}

Estes exemplos demonstram como controle do ciclo celular pode ser medido em resposta a uma variedade de estímulos ou manipulações de células. Esta abordagem pode ser adaptada para muitas aplicações que requerem a mensuração da posição do ciclo celular em experimentos tipo de cultura.

Figura 1. Quantitção das fases do ciclo celular por iodeto de propídio combinado e coloração BrdU (PI-BrdU). (A) Este painel exibe três citometria de fluxo dimensional de iodeto de propídio e células coradas BrdU. Note-se que as células com conteúdo de DNA 2N e 4N estão centradas sobre os 200 e 400 marcas na escala do eixo X para propidium intensidade de coloração de iodeto. BrdU intensidade de coloração é medido em uma escala logarítmica no eixo Y. Observe a posição dos portões usados ​​para quantificar células nas fases G1, S e G2 / M do ciclo celular. (B) A proporção relativa de células em cada um dos portões G1, S e G2 / M de A são mostrados neste gráfico.

Figura 2. Determinação quantitativa de fases do ciclo celular em células selecionadas usando iodeto de propídio ea célula CD20 marcador de superfície. (A) Este painel mostra iodeto de propídio e CD20 coloração para uma mistura de células, algumas das quais ectopicamente expressar CD20 e pRb. Note-se que as células com2N e 4N DNA (as populações mais abundantes) estão centradas sobre os 200 e 400 marcas no eixo-X. A posição do CD20 + portão seleciona as células que estão manchadas pelo menos 10X mais brilhante do que de fundo. (B) Um gráfico de contagens de células versus propidium coloração iodeto é mostrado para CD20 células negativas no painel A que são assincronamente proliferando. (C) Um gráfico semelhante é mostrado para CD20 células positivas a partir do painel A que foram induzidos a prisão com a expressão pRB e contêm células com conteúdo de DNA principalmente 2N. Isso demonstra que um preso sub-população podem ser distinguidos de outras células nesta cultura usando esta técnica de coloração.

Figura 3. Inibição da proliferação celular por p27KIP1. (A) PI-BrdU análise é usado para medir as fases do ciclo celular em uma população de maneira assíncrona proliferação de células que foram transduzidas com um vecto pBABE vazio retroviralr. (B) Uma análise similar das células transduzidas com pBABE-p27. Observe a ausência de células na fase S e maior intensidade de eventos no G1 e G2 / M portões. (C) A determinação quantitativa de células em cada fase do ciclo celular em forma assíncrona proliferação e controle de células que expressam p27.

Figura 4. Inibição da proliferação celular por TGF-β1 (A) análise PI-BrdU de forma assíncrona proliferação de células MCF10A. (B) Análise das células tratadas com 100 pM de TGF-β1 por 24 horas. Observe o acúmulo de células principalmente na fase G1 do ciclo celular. (C) Validação de BrdU coloração, substituindo o anticorpo anti-BrdU primária com um controle de IgG não-específicas em células de forma assíncrona proliferando. (D) quantificação gráfica das fases do ciclo celular respectivos de A e B.

Figura 5. Inibição da proliferação celular por pRb. (A) A contagem de células contra coloração iodeto de propídio de CD20 e gal-ß células transfectadas é mostrado. Este é um controle importante como a transfecção pode sincronizar parcialmente as células, tornando a população untransfected (CD20 - células) como um controle inadequado para o transfectadas sub-população. Células transfectadas precisam ser comparados com outras células transfectadas de forma análoga. (B) A contagem de células contra gráfico iodeto de propídio de CD20 e pRb transfectadas células. Note a presença quase exclusiva de um pico 2N. (C) Representação gráfica de proporções de células determinada fase do ciclo de A para B e usando métodos de ajuste de curva em software Ciclo Multi.

Discussão

Em nossa experiência, o sucesso com estas técnicas é dependente de alguns controles fundamentais e das condições experimentais. Uma delas é estabelecer um controle de forma assíncrona proliferando para uso nesses experimentos. Este controle serve para três propósitos importantes. Primeiro, ele garante que as condições de cultura utilizado para todas as amostras experimentais são adequados para apoiar a proliferação contínua na ausência de tratamento. Este exemplo também serve ao propósito de um controle positivo para a metodologia de coloração para garantir que BrdU ou células CD20 positivo pode ser detectado quando eles estão presentes. Por último, esta amostra é usada para calibrar o citômetro de fluxo. Esta amostra de controlo pode ser usado para ajustar a intensidade da coloração propidium iodeto para detectar células 2N e 4N, 200 e 400, respectivamente. Além disso, a sensibilidade de detecção de BrdU ou CD20 pode ser ajustado de modo que os sinais negativos e positivos estão centradas, como mostrado nas Figuras 1A e 2A. Quando todas as amostras têm uma concentração semelhante de células na PI-RNase solução, então alguns ajustes para o citômetro são necessários como amostras subseqüentes são executados. Isto é importante por razões mostrado na figura. 4B e 5B onde a acumulação G1 forte cria essencialmente um pico G1 única que pudesse ser mal interpretado como G2 / M.

Os experimentos representante também fazer outros pontos importantes. Primeiro de tudo, eles demonstram que BrdU captação e rotulagem podem variar entre os tipos de células. Por esta razão, é importante determinar empiricamente o comprimento do pulso e condições coloração necessária para a boa detectar células em fase S. Em geral, os tipos de células que dupla na cultura em 24 horas ou menos podem ser rotulados com BrdU em uma hora. Tipos de células em crescimento mais lento podem exigir pulsos mais longos e as alterações às condições de anticorpos coloração e duração. MCF10A células são um excelente exemplo a este respeito como eles foram marcados com BrdU por quatro horas e corados com o dobro da concentração padrão de anticorpos para quatro vezes mais tempo. Investigadoresdeve ter cuidado para não exceder 6 horas de BrdU rotulagem mesmo com células muito lentamente crescendo como isso pode erroneamente levar a inclusão de G2 / M células na população S-fase. Em segundo lugar, ao comparar os efeitos da expressão p27KIP1 com os de TGF-β1, é claro que p27 pode induzir um acúmulo em qualquer G1 ou G2 / M fases, enquanto TGF-β1 sinalização induz uma parada G1. Meios tradicionais de detecção de proliferação, tais como incorporação de ³ H-Timidina e contagem de cintilação são incapazes de distinguir essas possibilidades.

Em nosso protocolo alternativo demonstramos a detecção de uma sub-população de células em uma população maior untransfected. É importante determinar empiricamente o repórter mais adequado para a detecção de células transfectadas. Em nossa experiência, quer alguns tipos de células expressam marcadores de superfície celular mal, ou não pode corretamente o tráfego deles para a membrana plasmática, resultando em uma incapacidade de detectar células transfectadas. Likewise, nem todas as células tolerar a forma de membrana ligado de GFP. Seleção do repórter mais adequado deve ser feita através da avaliação da eficiência de transfecção do repórter, bem como a intensidade relativa de expressão comparados aos controles untransfected. Idealmente, expressão heteróloga destas moléculas será bem tolerado e este é sugestivo de que os marcadores têm pouco ou nenhum efeito sobre a distribuição do ciclo celular.

Uma limitação destes tipos de abordagens de citometria de fluxo é que eles só são capazes de estabelecer abundância relativa das fases do ciclo celular em relação um ao outro. Por esta razão, é ambígua se expressão da p27 na Figura 3 realmente induz a uma prisão no G1 e G2 / M, ou se ele apenas retarda a progressão por essas fases em relação ao S-fase. Estas possibilidades podem ser investigada por tratamento de uma amostra paralela de células com um inibidor mitótico, como Nocodazol, ou G1 / S, como inibidor aphidicolin. Uma vez que estas drogas criar uma dominaçãont prisão em M-fase ou fase-S no início, respectivamente, as células proliferam lentamente irá acumular no ponto de parada induzidas por drogas. Por exemplo as células preso em G1 por causa da expressão pRB permanecerá no G1, apesar do tratamento Nocodazol enquanto as células controle irá acumular em fase de ^M-13.

Juntas, essas abordagens experimentais oferecem uma metodologia flexível que pode ser aplicado a uma ampla gama de células de mamíferos questões de investigação ciclo. Eles podem facilmente detectar alterações na progressão do ciclo celular e quantificar as diferenças quando comparados com os controles.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente / equipamentos	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
Célula reagente Labeling Proliferação	GE Amersham	RPN201
Anticorpos anti-BrdU	BD Biosciences	347580
Anticorpos Anti-Mouse FITC conjugado	Vector Labs	FI-2000
Strain Filtros celular	BD Falcon	352235
Anti-CD20 Antibodies	BD Biosciences	347673
Software do Ciclo de vários	Sistemas de Fluxo de Phoenix	N / A