哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析

要約

我々はH1リンカーヒストンの発現レベルを分析するためのアッセイのセットを記述します。 H1ヒストンのタンパク質定量をHPLC分析することによって達成される一方、個々のH1遺伝子のmRNAを定量的、リアルタイムPCRに続いてランダムプライマーに基づいて逆転写反応によって測定される。

要約

リンカーヒストンH1は高次構造にクロマチンの折り畳みを促進する、ヌクレオソームコア粒子とリンカーDNAに結合する。 H1は、哺乳動物の開発¹に必須であり、 生体内 ^2-4 に 、特定の遺伝子発現を調節する。高度に保存されたヒストンタンパク質のうち、H1リンカーヒストンの家族は最も異質グループです。差動、開発中に、異なる種類の細胞で規制されている哺乳類の11のH1サブタイプがあります。これらのH1サブタイプは、5体H1S（H1A-E）、交換H1 ^0、4生殖細胞特異的H1サブタイプ、およびH1x ^5があり^ます 。 DNA結合親和性とクロマチンの圧縮能力^6-9に異なる複数のH1サブタイプの存在は、クロマチン機能の変調の追加レベルを提供します。したがって、個々のH1サブタイプの定量的な発現解析、mRNAとタンパク質の両方が、それ以上の規制をより良く理解するために必要です注文クロマチンの構造と機能。

ここでは、個々のH1サブタイプ（ 図1）の発現レベルを分析するために設計されたアッセイのセットを記述する。様々なH1バリアント遺伝子のmRNAの発現は、より速くより正確に、ノーザンブロット分析の代替的アプローチと比べてはるかに少ないサンプルを必要とする高感度かつ定量的逆転写-PCR（定量RT-PCR）アッセイのセットにより測定されます。他のほとんどの細胞mRNAのメッセージとは異なり、H1遺伝子の大部分を含むほとんどのヒストン遺伝子、のmRNAは、長いポリAテールを欠いているが、3 '非翻訳領域^（UTR）10時ステム-ループ構造が含まれています。したがって、cDNAをランダムプライマーの代わりにオリゴdTプライマーを用いて逆転写によって全RNAから調製されています。各H1サブタイプに特異的なプライマー（ 表1）リアルタイムPCRアッセイは、個々のH1サブタイプのmRNAレベルの高い定量的な測定を得るために実行されます。だ。ハウスキーピング遺伝子の発現が正常化するためのコントロールとして解析されています。

各H1亜型とコアヒストンのタンパク質の相対量は^{、11月13日} 、哺乳動物細胞から抽出した全ヒストンの逆相高速液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）解析によって得られます。 HPLC法と溶出条件は、マウスのH1サブタイプの最適分離を与えるここで説明する。 HPLCプロファイルを定量化することによって、我々はH1ファミリー内の個々のH1サブタイプの相対的な割合を計算し、同様に細胞内でヌクレオソーム比にH1を決定します。

プロトコル

1。サンプルの調製とRNA抽出

1. RNA抽出前に、すべての作業面とピペットを70％エタノールで拭いされるべきであり、そのようなRNaseのザップなどのRNase汚染除去溶液で処理した。この方法は、RNaseのコンタミネーションやRNAの分解の可能性を減らすことができます。すべての手順については、手袋を着用してください。
2. マウス組織からRNAを抽出するには、安楽死させたマウスからの関心の器官を解剖し、氷冷リン酸で組織を洗浄（PBS：0.13 MのNaCl、5mMのリン酸ナトリウム、二塩基性水和物、5mMのリン酸二水素ナトリウム水和物、pH7.4）で緩衝生理食塩水。ステップ1.4で抽出RNAに即座に進みます。新鮮な組織はRNA抽出のために処理しない場合は、組織サンプルは、直ちに液体窒素中で凍結スナップインである必要があり、°C、後で使用するために-80℃で保存することができます。
3. RNAは、接着細胞培養物から抽出する場合は、培地を吸引し、PBSに十分な量ですすぎ、およびTRIzol試薬（体外を追加するプレート上世代）および1.4に進みます。懸濁液中で培養した細胞については、遠心分離によって細胞と細胞をペレット化を収穫。 、メディアを破棄し、PBSで簡単にペレットをリンスし、ペレットを遠心分離で細胞。 Trizol試薬を追加し、1.4に進みます。
4. 十分Trizol試薬は、高品質のRNAを得るために必要である。 100 mgの組織、 - 5 - 10×10 ⁶細胞（懸濁培養の場合）または3.5 cmのプレート当たりを（付着培養用）50からRNAを抽出し1ミリリットルTrizol試薬を使用しています。ポリトロンホモジナイザーPT2100（または同等）でTrizol試薬中の組織をホモジナイズする。 Trizol試薬の製造元の取扱説明書（Invitrogen社）によると組織サンプルまたは細胞からRNAを抽出するために進んでください。
5. RNA濃度は、光度計1000（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とRNAの品質を使用して測定されたゲル電気泳動によって分析されます。典型的な収量の1×10 ^6個の培養細胞当たりの組織またはRNAの5〜15μgのmg当たりのRNA 1-10μgの範囲である。排除するために、ゲノムDNAの微量からのRNAの潜在的な汚染は、RNAサンプルは、製造元の指示に従って、RNaseフリーのDNase（Sigma社製AMP-D1）で処理されています。この処理からRNAの分解を確実にないように、RNA濃度測定とゲル電気泳動を繰り返します。ストアは-80 RNAを抽出℃に

*注意：RNAは、DNA及びRNAの両方を希望する場合RNAeasyキットのマニュアルに従ってキット（Qiagen）、あるいはDNA / RNAキット（Qiagen）でを使用して抽出することができます。

2。定量的逆転写PCR（定量RT-PCR）

1. トータルRNAは、逆cDNAを用いてスーパースクリプトIIIファーストストランド合成システム（Invitrogen社）に転写される。最もH1遺伝子のmRNAがポリA-テイルを欠いているので、cDNA合成用プライマーとして、代わりにオリゴdTのランダムヘキサマーを使用することが重要です。しかし、ランダムヘキサマーとオリゴdT寿の低レベルでポリアデニル化メッセージを持つ遺伝子の発現解析も望まれる場合、混合ldは、ポリアデニル化mRNAの逆転写効率を改善するために逆転写（RT）反応で使用することができます。
2. 製造元のマニュアルに従って、RT反応を行う。簡単に言えば、
   • 0.5ミリリットルのPCRチューブに、トータルRNA5μgのは、50 ng /μlにランダムヘキサマーを1μl、10mMのdNTPミックス1μlを結合し、10μlの総反応容量を作るためにDEPC処理H ₂ Oを追加します。よく混ぜ、65℃で5分間インキュベートし、氷上で1分間インキュベートし、続いてC、。
   • 10xRT緩衝液2μl、25mMのMgCl _2を 4μlの、0.1M DTT、RNaseOut1μlの（40 U /μl）を、のSuperScript III RT（200 U /1μlの2μlの：cDNA合成ミックス10μlを準備するμL）および/プライマー混合物をRNAにそれを追加します。
   • 25℃で10分間インキュベート50°Cで50分間、続いて、5分間85℃で反応を終了させる°C、。
   • 各反応は、通常、cDNA産物の100から250 ng /μlにをもたらします。 -20℃cDNA産物を保​​存する°Cまたはリアルタイム定量PCR（qPCR）に即座に進みます。
3. 定量PCRは、正確に高効率と再現性を¹⁴と標的配列のコピーを定量化することができます。我々は、二本鎖DNA（dsDNA）をインターカレートする場合にのみ蛍光シグナルを与えるのSYBR Green色素で測定し定量PCRを選択します。のTaqManアッセイ¹⁴のように固有ではありませんが、この方法は、より費用対効果の高い、容易に実験室で採用されることであり、定量PCRにさらに汎用性を提供します。したがって、反応効率と特異性を確保するために増幅プロット（ 図2A）と定量PCR産物（ 図2B）の微分融解曲線を調べることが重要である。

ヒストンサブタイプ	マウスヒストン命名		ヒトのヒストン命名
	GENEの名前	加盟ない。	遺伝子名	加盟ない。
ヒストンH1A	Hist1h1a	NM_030609	HIST1H1A（H1.1）	NM_005325
ヒストンH1B	Hist1h1b	NM_020034	HIST1H1B（H1.5）	NM_005322
ヒストンH1C	Hist1h1c	NM_015786	HIST1H1C（H1.2）	NM_005319
ヒストンH1D	Hist1h1d	NM_145713	HIST1H1D（H1.3）	NM_005320
ヒストンH1E	Hist1h1e	NM_015787	HIST1H1E（H1.4）	NM_005321
ヒストンH1°	H1f0	NM_008197	H1F0	NM_005318
ヒストンH1oo	H1foo	NM_183811	H1FOO	NM_153833
ヒストンH1t	Hist1h1t	NM_010377	HIST1H1T	NM_005323
ヒストンH1t2	H1fnt	NM_027304	H1FNT	NM_181788
ヒストンH1x	H1fx	NM_198622	H1FX	NM_006026
ヒストンHils1	Hils1	NM_081792	HILS1	AY286318

表1。マウスとヒトのヒストンH1サブタイプの命名。

4. 前方にデザインと各H1遺伝子（ 表1）に特異的なPCRプライマーを逆にしてください。体H1Sの間で高い配列類似性に起因する、特に中央の球状ドメインに対応する領域では、それは特定のH1サブタイプのために設計したプライマーは、Oに合わせていないことを確認することが重要です熱H1遺伝子、またはクロスは、他のH1サブタイプを増幅する。それはほとんどのH1遺伝子はイントロンを含まないことに注意することも重要です。したがって、一般的にゲノムの混入を避けるために、RT-PCRを採用してイントロンスパニングプライマーは使用できません。代わりに、RNAサンプルをDNaseで事前に扱われるべきである（1.5参照）ゲノム汚染の痕跡量を除去する。さらに、RT（ - ） - 定量PCRは、cDNAサンプル中のゲノム汚染の欠如を検証するために並列で実行する必要があります。
5. また、その発現がサンプル間で変更されていません内部リファレンス遺伝子用プライマーを設計します。多くの場合、グリセルアルデヒド-3 - リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）およびβ-アクチン遺伝子のようなハウスキーピング遺伝子は、リファレンス遺伝子として選択されています。ハウスキーピング遺伝子のqPCR信号が正規化コントロールとして機能します。
6. 2倍iQ SYBR Green Supermixを（Bio-Rad社）（dNTPを含む、50 U / mlのiTaq DNAポリメラーゼ、6 mMのMgCl _2、SYBRグリーンIと20の12.5μL以下のように、各PCR反応（総量25μl）を準備するnMのフルオレセイン）、10 nMのフォワード/リバースプライマーミックス中、第4のcDNA ng /μLの1.25μlの2μlを、とのddH ₂ Oの9.25μL、およびマイクロシール、96ウェルPCRプレートでよく混ぜる。プレートカバーをプレートに封止されていることを確認するためにマイクロシール 'B'粘着シール（BIO-RAD）を使用します。タップするか、簡単にボルテックスPCRプレート、短い遠心分離によって反応混合物をスピンダウンする。定量PCR用MyIQシングルカラーリアルタイムPCR検出システム（BIO-RAD）にプレートを置きます。
7. 30秒間、95℃3分間、10秒間、95℃の40サイクル、続いて60°C 20秒、72°C：我々は以下の定量PCR条件を使用しています。 PCR効率とCT（サイクルのしきい）値の増幅曲線（ 図2A）を調べる。しきい値の行が自動的にIQ5光学システムソフトウェアバージョン2.0で設定することができます。
8. 必要に応じてプライマーの効率化と最適なcDNAの濃度は、検量線の検定によってテストすることができるのゲノムDNAの段階希釈I定量PCRおよびCt値に使用されるのは、テンプレートDNA量のログに対してプロットされています。高い特異性と効率性のプライマーを用いて最適化された定量PCRアッセイは、決定係数（R ^2）> 0.98で、直線的検量線が得られます。貧しい増幅効率を持つ傾向がある200 bpの、より長いアンプリコンの長さのプライマーを避けることができます。
9. SYBR Greenは、任意の二本鎖DNAを検出するためには、希望するアンプリコンではなく、プライマーダイマーや汚染物質は、増幅して検出されることを確保するための定量PCR後に融解曲線のコマンドを実行することが重要です。溶融曲線解析プログラムについては定量PCR装置は、°C〜95°C 0.5°C単位でデータの収集55からサンプルを加熱する。 MyIQ（BIO-RAD）測定器の溶融曲線解析のデフォルト設定は以下の通りです：95℃1分、55℃の設定値55℃10秒の81サイクル、続いて1分、℃で、カーブを溶かし、 +温度0.5°C（カメラが各サイクルでデータを収集します）。
10. から二本鎖DNAの融解温度（Tm）は、アンプリコンの長さやGC含量に依存し、異なるアンプリコンは、異なるTm値（s）を持ちます。希望するアンプリコンの特異的融解温度と同様にノイズのアンプリコンのピーク（図2B）の欠如を確認するために、定量PCR製品の派生物の融解曲線を調べます。
11. 統計分析のために、各アッセイのための反応を複製したり、三重の準備をします。 PCRミックスに追加されないcDNAを、RNAまたはDNAのソースと、定量PCR（逆転写せずにテンプレートとしてRNAを用いた定量PCR）と定量PCR（ - ）のようなRTなどの定量RT-PCRのネガティブコントロールが含まれています。 RT（ - ） -定量PCRは、潜在的なゲノムDNAのコンタミネーション（ - ） 図2＆3でRT（）のコントロールとして使用できます。
12. IQ5光学システムソフトウェアバージョン2.0（Bio-Rad社）で定量PCRのデータを分析します。 H1遺伝子の相対発現レベルを取得するためにハウスキーピング遺伝子の発現（例えば、GAPDH、β-アクチン、HPRT）とH1アイソフォーム遺伝子の発現値を正規化します。

"> 3 ove_title総ヒストンの調製

*すべての手順は、氷上もしくは4℃で行うべきである

1. マウスの組織を分析し、氷冷PBSで洗ってください。 （直ちに抽出に進んでいない場合は、凍結スナップ、ステップ1.2で説明したようにサンプルを保管してください。）カミソリの刃の部分に組織をミンチ。ダウンスホモジナイザー（B乳棒）をミンチに転送します。 10 mlのショ糖バッファ（0.3 Mショ糖、15mMのNaCl、10mMのHEPES緩衝[pHを7.9]、2mMのEDTA、0.5mMのPMSF、完全なミニプロテアーゼインヒビターカクテルタブレットは、新鮮な追加）組織のグラム当たり追加します。 10から15ストロークで組織をホモジナイズする。
2. 、慎重に上清を新しいチューブに移す（ペレット組織の残骸を破棄）と、5分間2000rpmで遠心分離し、15 mlチューブ、30秒（エッペンドルフ5810R遠心模型）500 rpmでスピンにホモジネートを転送細胞をペレット化します。 3.4に進みます。
3. ヒストンとクロマチンの単層培養細胞から抽出する場合は、すすぎPBSで洗浄、培養皿にPBSを追加し、遠心分離によって細胞スクレーパー、ペレット細胞を用いて細胞を採取する。遠心分離により懸濁液中で培養した細胞、細胞をペレット化する。
4. 0.5％NP-40（グラム組織の量または10（8）細胞を開始するごとに）を補充した10mlのスクロースバッファーで細胞ペレットを再懸濁します。ダウンスホモジナイザー（B乳棒）にサンプルを転送し、インキュベーション20分以内に10ストロークをダウンス。この時点で、核が得られる。顕微鏡下で核の品質を調べます。 5分間2000rpmで遠心分離によってペレットは核。上清を捨てる。
5. 組織または10（8）細胞の1グラム当たり- （使用前に毎回新鮮に追加0.35 M KCl、10mMのトリス[pH7.2の]は、5mMのMgCl _2、0.5mMのPMSF）は3ミリリットル高塩バッファーで核ペレットを再懸濁します。小さなDounceホモジナイザー（B乳棒）にサンプルを転送し、5月10日ストロークでホモジナイズする。
6. 続いて20分間氷上でインキュベート3エッペンドルフチュー​​ブ（1ミリリットルずつ）、に分注し懸濁液をペレットクロマチン〜10分間14,000 rpmで遠心分離。上清を捨てる。
7. 各クロマチンペレットに0.8ミリリットル0.2 NH ₂ SO _4を追加_します 。ペレットが完全に解離されるまでもペレットを粉砕するエッペンドルフチュー​​ブ用乳棒のダウンスを使用しています。 4℃で一晩回転するプラットフォーム上でサンプルをインキュベートします。合計ヒストンは、酸処理のこのステップで抽出されています。
8. 10分間14,000 rpmで遠心します。 2エッペンドルフチュー​​ブ（400μl/チューブ）に上清（ヒストンの抽出）を転送します。ペレットを捨てる。各チューブに氷冷エタノールを2.5倍量（1ml）を追加する..サンプルを-20℃で一晩保管してください。
9. ペレット合計ヒストン〜10分間14,000 rpmで遠心し、上清を捨てる。 70％エタノールでペレット3回洗浄し、乾燥した空気に20〜30分間のベンチに残します。 -80°Cで乾燥させたタンパク質を保存するかのddH ₂ Oでそれらを溶解し、直ちにHPLC分析に進みます。乾燥させたタンパク質は、保存することができます-80°Cまでの1年間のために。

4。リンカーヒストンのHPLC分析

1. 逆相カラムとHPLC装置の容量に応じてのddH ₂ Oの推奨量でヒストンペレットを再懸濁します。私たちは、C18逆相カラム250×4.6ミリメートル（バイダック）およびHPLC分析のためのÄktapurifierUPC 900インストゥルメント（GEヘルスケア）を使用します。我々は、通常、分析のためのddH ₂ 0 100μlの合計ヒストンの50-100μgにつきを解消する。
2. 不溶性の残留物を除去するために5分間14,000 rpmで遠心します。 Bradfordタンパク質アッセイは、カラムに注入されるタンパク質の量を決定するために使用されます。 HPLCシステム上の逆相カラムに総タンパク質の50〜100μgを注入します。タンパク質の過剰量は、カラムの目詰まりを防ぐために避けるべきで読み込んでいます。
3. 分画の増加アセトニトリル勾配を有するリンカーヒストンとコアヒストンは、 表2に記載されている。

時間（分） アセトニトリル％TFA（％） 0.1％TFA / DDH ₂ O（％） 0 0 100 1 5 95 11 25 75 26 30 70 45 35 65 66 40 60 75 43 57 126 55 45 131 90 10 136 5 95

表2。時間をかけてアセトニトリル勾配を増加させる。

4. 排水は（ふぃぎゅ 214nmでモニターし、HPLCプロファイルされてい再4）が記録され、ユニコーン5.11ソフトウェア（GEヘルスケア）とÄktapurifierUPC 900（GE Healthcare社）を用いて解析されています。さらなる分析のために、例えば、SDS-PAGEと質量分析 - タンパク質画分は、分数のオートコレクター（GEフラクショナル-920）を収集することができます。
5. 各H1亜型とH2Bのピークの₂₁₄の値は、対応する各ヒストンタンパク質のペプチド結合の数によって正規化されます。個々のH1ヒストンH1ファミリ内のサブタイプと同様に、ヌクレオソームコア粒子へのH1亜型の比率の相対的な割合は、これらの正規化された₂₁₄の値（図5）から計算することができます。

5。代表的な結果

哺乳類のH1サブタイプ、全体的なフローチャートおよび個々のヒストンH1遺伝子の発現解析の代表的な結果のリストは、それぞれ表1、図 1および図2-5に示されています。図2Aは、図2Bは、対応するアンプリコンの微分融解曲線を示し、一方、マウスの肝臓とmESCsから調製したcDNAを使用してH1A定量PCR反応の典型的な増幅曲線を示しています。融解曲線は86で、融解温度（Tm）で単一の特性ピーク°H1A PCRアンプリコンのためにCを表示し、H1A定量PCRアッセイの高い特異性を示唆し、非特異的なバックグラウンドピークを欠いている。増幅プロット（ 図2A）の評価は高い再現性を示唆し、各サンプルの三重定量PCR反応は、ほぼ同一のCt値と一致した信号を与えたことを示しています。ビルドアップRTからアンプリコンの欠如（ - ）定量PCR反応は、そのゲノムDNAのコンタミネーションが存在する、または最小限なかったことを示します。そのようなGAPDHのように、H1遺伝子とハウスキーピング遺伝子のCt値を利用して、各H1遺伝子の相対的なRNAの発現レベルを算出した。 H1°とH1A遺伝子の計算結果の例をに示す図3。 H1°式がmESCsよりも肝臓ではるかに高いのに対し、H1A mRNAの相対発現レベルは、マウスの肝臓と比較してmESCsで高くなっています。

H1AまたはH1の発現の違い°MESC対成体マウスの肝臓では、ヒストンタンパク質のHPLCプロファイル（ 図4）からも明らかである。 H1°、分化特定のH1は、大人の肝臓の総H1（ 図5A）の27.2％を占め、成熟した組織の中に大量に蓄積されています。対照的に、H1°タンパク質は未分化mESCs（ 図4B）でほぼ存在しない。一方、H1Aは非常にmESCs（ 図3及び図4（b））においては、mRNA転写産物とタンパク質の両方で、表現されます。 HPLCプロフィール、H1ファミリー内の個々のH1サブタイプの相対的な割合でH1ピークの定量化を介して（ 図5A）決定されます。さらに、個々のH1サブタイプの値（またはヌクレオソームあたりの総H1）がH2B（ 図5B）のために正規化された₂₁₄の値の半分に相当するH1亜型の正規化された₂₁₄のピーク値（または総H1の合計）の比率で計算することができます。

図1哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現解析の全体的なスキーム。

図2。H1A定量PCRアッセイの代表的な結果。 H1A定量PCRアッセイの（A）増幅プロット。しきい値の線とIQ5光学システム·ソフトウェアによって設定されたCt値が示されている。 （B）定量PCR産物のデリバティブ溶融曲線は、（a）に示す。

mESCsと大人のmのH1AとH1°のmRNAレベルの図3。定量RT-PCR解析ウーズの肝臓。 Y軸はリファレンス遺伝子GAPDHのそれにH1遺伝子の相対発現レベルを表しています。 （ - ）RTと定量PCRサンプル（逆転写なしRNA）を最小限しかまたはまったく信号を示します。

図4。哺乳動物細胞から抽出されたヒストンのHPLC分析。成体マウスの肝臓（）およびマウスのESC（​​B）から抽出した100μgのトータルヒストンの逆相HPLC分析。 X軸：溶出時間。 Y軸：MAU、ミリ吸収単位。

図5。成体マウスの肝臓でのヌクレオソームの比率あたりH1サブタイプの組成とH1。各H1アイソフォームとH2Bのピーク面積の₂₁₄の値は、UNICORN 5.11ソフトウェア（GE Healthcare）を用いて計算し、対応するヒストンタンパク質に存在するペプチド結合の数によって正規化されます。正規化の合計すべてのH1サブタイプの₂₁₄の値が合計H1の値として取得されます。各H1サブタイプの合計H1の割合（）と同様にヌクレオソームにH1の比（H2Bの正規化された₂₁₄の値の半分で表される）（B）成体マウスの肝臓に示すように、HPLCプロファイルから計算される図4Aインチ

ディスカッション

アッセイのセットは、哺乳類のリンカーヒストンサブタイプの発現レベルの包括的な分析を可能にするここで提示した。適切に設計された定量RT-PCRアッセイは、任意の哺乳動物ヒストンH1遺伝子からのRNAメッセージの機密性の高い正確な測定を提供しています。リンカーヒストンサブタイプ遺伝子の定量RT-PCRアッセイの重要な部分は、逆転写をベースにランダムプライマーを用いて、cDNAの調?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名前	会社	カタログ番号
RNaseのザップ	アプライドバイオシステムズ	AM9780
Trizol試薬	インビトロジェン	15596-018
SuperScriptIII	インビトロジェン	18080-051
無水エタノール	フィッシャー·サイエンティフィック	BP2818-4
IQ SYBRグリーン	バイオ·ラッド	170-8880
RNeasyミニキット	キアゲン	74104
デオキシリボヌクレアーゼI	シグマ	AMP-D1
マイクロシール96ウェルPCRプレート	バイオ·ラッド	MSP-9605
マイクロシール 'B'粘着シール	バイオ·ラッド	MSB-1001
スクロース	Agrosオーガニック	AC40594
リン酸ナトリウム、二塩基性水和物し（Na 2 HPO 4·7H 2 O）	フィッシャー·サイエンティフィック	BP332
塩化ナトリウム（NaCl）	バイオ分析アメリカン	AB01915
リン酸二水素ナトリウム水和物（のNaH 2 PO 4·7H2O）	フィッシャー·サイエンティフィック	BP-330
HEPES	フィッシャー·サイエンティフィック	BP310
完全なミニプロテイナーゼインヒビターカクテル錠	ロシュ·ダイアグノスティックス	11836153001
EDTA	シグマ	E-5134
フェニルメタンスルホニルフルオリド（PMSF）	バイオ分析アメリカン	AB01620
ノニデット-40（NP-40）	バイオ分析アメリカン	AB01425
塩化カリウム（KCl）	フィッシャー·サイエンティフィック	BP366
トリス[ヒドロキシメチルアミノメタン]	バイオ分析アメリカン	AB02000
塩化マグネシウム（MgCl2を）	フィッシャー·サイエンティフィック	BP214
硫酸（H2SO4）	VWR	VW3648-3
水酸化アンモニウム（NH 4 OH）	Agrosオーガニック	AC42330
Bradfordタンパク質アッセイ	バイオ·ラッド	500-0001
アセトニトリル	EMD	AX0145-1
トリフルオロ酢酸（TFA）	JTBaker	9470から01