のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

要約

のメタボロームプロファイル結核菌ブロス培養で成長した後に決定されています。条件は、この微生物の代謝プロファイルに栄養補助剤、酸化剤、抗結核剤の効果をテストするために変化させることができる。抽出物調製のための手順は、1Dの両方に適用されます ¹ Hと2D ¹ H- ¹³ C NMR分析。

要約

結核菌は、地球規模での人間の死亡率の主要な原因である。両方のマルチ（MDR）と広範囲に（XDR）の薬剤耐性株の出現は、現在の疾病制御の努力を脱線させると脅している。したがって、現時点で入手可能なものよりも有効である薬やワクチンの開発が急務とされている。 Mのゲノム結核は、10年以上のために知られて、まだ遺伝子の機能と本質に関する我々の知識の重要なギャップがあるされています。多くの研究では、以来、遺伝子発現の全体的なパターンに対する薬剤、酸化剤、および増殖条件の影響を決定するためにトランスクリプトームとプロテオームの両方のレベルで遺伝子発現解析を用いてきた。最終的に、これらの変更の最終的な応答は、数千の小さな分子量の化学物質を含む細菌の代謝物に反映されています。未処理またはTRか、野生型と変異株の代謝プロファイルを比較特定の薬物とeated、効果的にターゲットの識別を可能にすることができ、抗結核活性を持つ新規阻害剤の開発につながる可能性があります。同様に、メタボローム上の2つ以上の条件の影響も評価することができる。核磁気共鳴（NMR）は代謝中間体を同定し、定量化するために使用される強力な技術です。このプロトコルでは、Mの準備のための手順NMRメタボローム解析のための結核の細胞抽出物が記載されている。代謝物の保全を最大にするために低温を維持しながら、細胞培養物は、適切な条件と必要な生物学的安全性レベル3封じ込め^、1収穫の下で栽培され、機械的な溶解に供される。細胞溶解物を回収し、滅菌濾過し、超低温で保存されています。これらの細胞抽出物からのアリコートを、生細胞の有無を確認するためのコロニー形成単位のためのミドル7H9寒天上にメッキが施されています。 37℃でのインキュベーションの際に二ヶ月℃、無viの場合できるコロニーが観察され、サンプルが下流の処理のための封じ込め施設から削除されます。抽出物は、凍結乾燥重水素化緩衝液に再懸濁し、その後統計的分析に供されている分光データをキャプチャし、NMR装置に注入される。説明する手順は、1次元^（1D）1 H NMRおよび2次元（2D）の^{1 H-13} C NMR分析の両方に適用することができます。この方法論は、クロマトグラフ法よりも信頼性の高い低分子量代謝物の同定と細胞抽出物の代謝物のより信頼性が高く、敏感な定量的な分析を提供しています。細胞溶解工程の後に記載された手順のバリエーションも平行プロテオーム解析に適合させることができる。

プロトコル

1。プロトコルテキスト

このプロトコルは、MにNMRの方法論の適応を強調結核 （クラスIIIエージェント）。 M.を行う際にそのため、生物学的安全性レベル3（BSL3）プラクティスが従う必要があります毎年認定された研究室での結核研究。実験室で生成されたエアロゾルへの暴露では、これらの微生物を扱う担当者が直面する最も重要な危険である。以下の手順は、我々の施設で行われているとバリエーションがインスティテューバイオセーフティ委員会の勧告に基づいて存在するかもしれません。共通の人員保護具は、タイベック·スーツ、フワフワヘアキャップ、ブーツ、N95マスク、目の保護具、スリーブ、ニトリル手袋の二重ペアで構成されます。 M.伴う作業オープンMと結核培養および/ ​​または操作結核容器はタイプA2またはB2生物学的安全キャビネットの中で行われる。プラスチックで覆われた吸収紙はw上に配置され表面をorking。配置された、または施設から削除するすべての材料/消耗品は2バイオハザードバッグに入れ、オートクレーブで除染しなければなりません。キャビネット（FastPrep-24溶解ホモジナイザー、分光光度計、氷と一緒にバケツなど）内で利用される作業面および機器は、1％Amphyl（結核菌殺菌、殺真菌、および殺ウイルス剤）と各作業セッションの後に消毒しなければなりません。M.結核の文化は、このような冷凍庫、インキュベータ、遠心分離機、冷蔵庫などの生物学的安全キャビネットの外側に位置する大規模な機器への輸送のために二重の封じ込め下に置く必要があります。遠心分離は、付属の安全カップやOリングスクリュートップチューブを用いて行われる。 BSL3実験室外側にさらに分析するために、無細胞抽出液を15分間95℃で殺さ0.2μmのフィルターまたは微生物熱を通してろ過する^。2サンプルは、前封じ込めからの削除にコロニー形成単位の有無を確認するためにめっきされる。

1. ポリソルベート80を含むミドル7H9完全培地110ミリリットル（ツイーン80凝集を防ぐため）ブロス（MADC-TW）または250ミリリットルの三角フラスコに適当な媒体を転送します。 ¹³ C-代謝産物を使用した場合3回の培養は、日常的条件ごとに成長しており、同一の培養は10 1D ¹ H-NMRプロファイリングのために栽培されています。 2つの条件（ 例えば 、薬物の添加の有無にかかわらず）の場合、レプリケート当たり文化の二重のボリューム、2つの同一の文化に成長して分割することができます。すべての試薬と溶液のレシピはプロトコルの端部に設けられている。
2. Mの0.150ミリリットルとブイヨンに接種結核 50％グリセロールストック（氷上で解凍できます）。下記の注1を参照のこと。
3. 文化は37℃で成長しましょう℃で約6日間（OD _600が 0.6から0.8）を100 rpmで振とう。下記の注2を参照してください。
4. の抗生物質、代替の追加や、他の治療法が必要とされていない場合、培養は収穫する準備が整いました。治療法が使用されている場合は、引き続きそのまま5に進みます。汚染検査、表現型の解析、PCR検査：各フラスコから0.5mlのサンプルを削除し、4℃で遠心管と場所°文化滴定と品質管理のためのCに転送します。下記の注記3を参照のこと。この時点では、ステップ6に進みます。
5. シェーカーからフラスコを取り出して、所望の治療（ 例えば 、薬物や代謝物を追加）を行ってください。場所は、追加の期間（ 例えば 、6月18日HR）のシェーカーでインキュベートに戻っフラスコ。この時間の終わりに、別の1.0 mlのアリコートを取り、OD _600を決定_します 。各フラスコから0.5mlのサンプルを削除し、4℃で遠心管と場所°文化滴定と品質管理のためのCに転送します。
6. 5分間氷上で培養を置きます。このステップの後、全体の残りのプロトコルを通して氷の上のセルのままにしておきます。 2000 xgで4℃で遠心分離によって収穫文化°卓上遠心機を用いて50 mlチューブで15分間インキュベートする。それぞれの文化はそれぞれ25ml（1の合計4本のチューブが必要になります00ミリリットル）を培養当たりわずか50ミリリットルが1D ¹ H NMRの実験のために必要とされる十分な2D ^{の1 H-13}の信号対雑音C NMRの実験を、取得する必要があります。
7. 上記の遠心分離パラメータで氷冷蒸留H ₂ O（約15ミリリットル初めてで、10ミリリットル2回目）で各細胞ペレットを2回洗浄します。二回目の洗浄では、紡績前に同じチューブに10mlのアリコートを兼ね備えています。 1.0ミリリットル蒸留H ₂ O（細胞ペレットのボリュームを調整する必要があります）の最終体積で細胞ペレットを再懸濁します。凝集のない単一細胞懸濁液は、この段階で希望する場合は、細胞が簡単に超音波処理および/または27ゲージ針に3回通しすることができます。あるいは、細胞ペレットを-80℃で凍結し、さらなる処理まで保存することができます。後者の場合には、凍結ペレットを再懸濁する前に氷上で解凍されています。前述のように1.0ミリリットルddH ₂ Oを最終体積で細胞ペレットを再懸濁します。
8. Transfe溶解マトリックスBを（0.1 mmのシリカ球）を含む2.0mlのスクリューキャップチューブにrを1.0 mlの細胞懸濁液。バイオセーフティキャビネット内FastPrep-24溶解ホモジナイザーを置きます。保持はチューブの上にプレートを固定してスポーク、試料ホルダーに試料を入れてください。 6メートル/秒の速度設定でホモジナイザーで60秒のサンプルを処理する。
9. 15000 xgで4℃で遠心機でサンプルをスピン℃でペレット細胞破片と無傷の細胞への10分間。
10. 滅菌チューブにシリンジフィルター（0.2μm）で上清とパスサンプルを取り除きます。 MADC寒天プレート上の試料の0.1ミリリットル（又は10％例えば、試料の代表的な割合は、）は、生細胞が存在しないことを確認します。捜査官はまた、複数の濾過工程を実施し、および/または任意の潜在的な生物学的安全性の懸念を防ぐか、または識別するように生きて死んで染色法を用いて抽出液中の生細胞の存在を確認することができる。格納するためにエタノール - ドライアイス浴でサンプルを凍結-80℃で、彼らはNMR施設で凍結乾燥して処理できるようになるまで。
11. 2ヵ月後、コロニー形成単位の有無を確認するためにプレートを確認してください。ノーCFUのが発見された場合は、サンプルがBSL3実験室から取り出してもよい。さらなる分析は、通常、複数のユーザーにサービスを提供しないと、特定の封じ込めの要件の下で動作する標準的なNMR施設で行われる。
12. 乾固した試料を凍結乾燥し、NMRのバッファとマイクロ遠心チューブに移す0.7mlに懸濁します。 13000×gで3分間遠心します。 0.6ミリリットルを外し、5mmのNMRチューブに移す。別の方法として、凍結乾燥試料は、非正規バイオハザードサンプルなどの外部施設に郵送することができます。
13. NMRデータを直ちに収集されます。すべての予防措置にもかかわらず、活性酵素は、まだ存在していてもよいし、試料を長時間にわたって一般的に安定していません。サンプルはmに対して℃の室温または4で除外されたときにNMRスペクトルの変化が顕著である1週間以上の鉱石。また、NMRデータ収集は、サンプルがランダムに各カテゴリから選択され、未処理と薬物処理した培養の間に交互にされています。 NMRスペクトルが収集される前に特定のカテゴリには、長い遅延があったので、これは不要なバイアスを防ぐことができます。すべての未処理試料のNMRスペクトルが最初に収集され、その後薬剤処理されたサンプルが続いた場合に、データの偏りが発生します。サンプルは直ちにNMRにより分析することができない場合は、サンプルを-80℃で1 mlエッペンドルフチュー​​ブに格納する必要があります
14. BACS-120サンプルチェンジャーにサンプルを挿入した後、そのようなロック、シム、調整、90°パルスの長さの最適化など、いくつかのルーチンの手順が含まれます測定器の校正は、結果の質を最大限に高めるために必要です。単一試料を90°パルスの長さを調整し、残りのサンプルのために楽器をチューニングするために使用されます。 、ロックシミング、すべてのサンプルのNMRデータ収集が自動化されたusinですグラムICONNMRとgradshim。
15. 1D ¹ H NMRスペクトルは、励起スカルプを使って水抑制とブルカーzgesgpパルスシーケンスを用いて収集されます。 32Kデータ5482.5Hzの掃引幅を持つ点、128スキャン、16ダミースキャンの合計が使用されます。 2Dの^{1 H-13} C HSQCスペクトルは、Bruker hsqcetgpパルスシーケンスを用いて収集されます。 5000.0 Hzの掃引幅を持つ2048個のデータポイントの合計は、直接¹ Hの次元に沿って収集され、間接的な¹³ Cの次元に沿って、18864.9 Hzの掃引幅を持つ64のデータ·ポイントされています。スペクトルはノイズに良い信号を得るために128スキャンと16ダミースキャンで収集されます。

図1実験手順のフロー図が示されている。

NMRのバッファ

50mMリン酸カリウムバフの原液50μMのTMSPとER：

• 2.17グラムのK ₂ HPO _4（二塩基性リン酸カリウム）
• 1.70グラムのKH ₂ PO _4（リン酸二水素カリウム）
• 7.86 mgのナトリウム3 -トリメチルシリル（TMSP _{-2,2,3,3-D4（D、98％））}
• "100％" D ₂ Oの500ミリリットルに溶解
• 最終的な解決策は、pH 7.2（未補正）でなければなりません

MADC-TWまたはMOADC-TW（1L）

• 4.7グラムミドル7H9ブロスをベース
• 900ミリリットルddH ₂ Oを
• 2 mlのグリセロール
• 25分間のコンポーネントおよびオートクレーブを混ぜる。 ：次の解決策をタッチして追加するには、冷たい液体
• MOADCを準備20mADCまたは100ミリリットルのOADCを準備する100ミリリットルのADC
• 2.5ミリリットル20パーセントツイーン80（あるいは、非代謝20％チロキサポールの1ミリリットル）
• 10ミリリットルの1％シクロヘキシミド

ADC（1L）

• 20グラム、D（+） - グルコース
• 50グラムのBSAフラクションV
• 8.5グラムのNaCl
• 800ミリリットルddH ₂ Oを
• 、一緒に溶かして1Lに音量を調整し、0.2μmのフィルターで滅菌します。 4℃で保存する

あるいは、OADC（1L）を調製し、1％のオレイン酸（下記レシピが250ミリリットルのバッチを作る）のプラス50ミリリットル上記のすべてのコンポーネントを追加します。 、一緒に溶かして1Lに音量を調整し、0.2μmのフィルターで滅菌します。ボトルは4℃でアルミ箔とストアにラップされている必要

• 2.5グラムのオレイン酸
• 250ミリリットル0.2MのNaOH
• 55℃で加熱することによりオレイン酸（冷凍により固化）解凍し10分間インキュベートし、60分間撹拌しながらNaOH溶液と熱に追加します。アルミホイルに包まれている滅菌ガラス瓶に保管してください。 4でパラフィルムや店舗でシールボトル℃の

望ましい場合には、カタラーゼ充実と商業のBD BBLミドルADCまたはOADCを購入することができます。

1％のシクロヘキシミド（100ミリリットル）

• 1グラムシクロヘキシミド
• 100ミリリットルddH ₂ Oを

溶解し、0.2μmのフィルターで滅菌します。 4℃で保存する注意：シクロヘキシミドは細心の注意を払って取り扱うように有毒である。

20％（v / v）のツイーン80（100ミリリットル）

• 20ミリリットルのTween80
• 80ミリリットルddH ₂ Oを

の20％w / v溶液を調製し、これに代えて、Tween 80の20グラム（密度1.06グラム/ mlの約18.9ミリリットル）を重量を量る。 55への熱ソリューション℃で30分間溶解し、完全に混合するために。 0.2μmのフィルターと液体滅菌する。室温で最終的な解決に保管してください。

20％（v / v）のチロキサポール（100ミリリットル）

• 20ミリリットルチロキサポール
• 80ミリリットルddH ₂ Oを

の20％w / v溶液を調製し、これに代えて、チロキサポールの20グラム（密度1.1グラム/ミリリットル約18.2ミリリットル）を重量を量る。ディ〜30分間55℃に熱ソリューションssolve、完全に混ぜる。 0.2μmのフィルターと液体滅菌する。室温で最終的な解決に保管してください。

注1：Mのグリセロールストック結核は、以下のプロトコルを用いて調製される。

Mのストッキング結核

• Mを育てる飽和に50ミリリットルMADCの結核 （OD ₆₀₀ = 1.5〜2.0）、37℃で振盪培養（100 rpm）の下。菌株によっては、これは7から14日かかります。
• ペレット培養に15分間4℃で2000×gでサンプルをスピン。上清を除去します。
• 滅菌した50％グリセロール6mlに懸濁します。
• 4コーニングクライオバイアルやラベルを適切にアリコート1.5ミリリットル。
• -80℃でエタノール/ドライアイス浴や店舗で直ちにフラッシュ凍結バイアル℃、

注2：接種菌H37Rv株（-80℃まで1.5歳からC株）MADCメディア70mlの中には_{、得られます/イノーバ40シェーカーで振盪培養（100 rpm）し下37℃で成長の5日後に約0.6のサブ>。}

注3：文化の汚染をテストするには、捜査官は、標準のリッチ培地上の培養アリコートを接種し、一晩のインキュベーション後の成長の有無を確認することができます。日常的には、培養はコロニー形態を観察し、位相差顕微鏡で調べることMADC寒天上にメッキが施されています。必要に応じて、培養物を説明されているように6110プライマーIS用いたPCR法により確認することができます^。3

2。代表的な結果

よく準備されたサンプルは、 図2に示されたものと同様のNMRスペクトルを得ることができます。このスペクトルは、Mの表現です結核野生型代謝プール。同定された代謝物は、直接的または間接的にD-アラニン経路に関連付けられています。また、ピーク強度の大きさは、現在の代謝物濃度に比例している細胞抽出インチしたがって未処理培養、薬物治療、および変異株の間でピーク強度の変化は、代謝産物及び代謝経路の乱れを示すことができます。 M.結核 1D ¹ H NMRスペクトルは、三重共鳴、Z軸傾斜の冷凍器を備えたBruker Avanceの500MHzの分光計で収集した。スペクトルは、CAが含まれています。それはアミノ酸、ヌクレオチド前駆体、および解糖とクエン酸中間体を含む40から50の代謝物を同定し、定量化することが可能であったから400ピーク。ブルカーアイコンソフトウェアとBACS-120サンプルチェンジャーは、NMRのデータ収集を自動化するために使用された。 1D ¹ H NMRスペクトルを効率的に（後続の主成分分析（PCA）または直交部分最小二乗法判別分析でアーティファクトを誘発する可能性があるベースラインのコレクションのための必要性をなくし、フラットなベースラインを溶媒を除去し、維持するために、励起スカルプ^4を使用^して収集されたOPLS- DA）。 1Dの¹ H NMRスペクトルは5482.5 Hzと32Kのデータポイントのスペクトル幅で25℃で収集されます。 16ダミースキャンと128スキャンの合計は、スペクトルを得るために使用されていました。 ACDのラボ1D NMRのプロセッサのソフトウェアは、半自動的にすべての1D ¹ H NMRスペクトルを処理するために使用されていました。スペクトルは、フーリエ変換、変換された段階的、かつTMSPピーク（0.0 ppm）のを基準とした。 NMRpipeソフトウェアパッケージは個別に2D ^{の1 H-13} C NMRスペクトルを処理するために使用されるとNMRDrawで分析した。ブルカーFIDデータファイルが最初NMRpipeによって認識可能なファイル形式に変換した後、スペクトルはフーリエ変換された、位相補正し、0（ゼロ）を埋め込んだ。 1D ¹ H NMRスペクトルおよび2D ^{の1 H-13} C NMRスペクトルで観測されたNMRピークは^、1 H、それぞれ0.05と0.50 ppmの¹³ C化学シフト公差、マディソンメタボロームコンソーシアムデータベース（MMCDを使用して、特定の代謝物に割り当てられている） ^{5 BioMagResBank、6、ヒューマン·メタボローム·データベース。具体的に図7に示すように 、1次元と2次元NMRスペクトルは、NMRの化学シフトのピークリストがその後ヒューマン·メタボローム·データベースにアップロードする場合には、手動でピーク拾われます。ヒューマン·メタボローム·データベースによって同定された代謝物は、マッチングNMR共鳴の数を最大にし、代謝ネットワークに属する両方に基づいて、NMRスペクトルに割り当てられています。それぞれの化合物またはその代謝物は、通常、複数のCHのペアとそれに対応して複数のNMR共鳴を持っています。このように、実験的なNMRスペクトルで観察されるこれらのNMR共鳴のより、より多くの可能性代謝物が存在しています。同様に、同じ経路を関連付ける複数の代謝物を同定することは、正しい割り当ての可能性が高くなります。代謝物と代謝経路の存在が遺伝子およびゲノムの京都事典（KEGG）8とMetaCycデータベースで検証されています。9 マイコsmegmはATISはM.のための有用なモデル系である結核やその他のマイコバクテリア病原体。 Mの別の場所で説明したように、サンプルスメグマチスはまた、超音波処理により中断する可能性があります10}

図2 結核菌の細胞抽出物1D ¹ H NMRスペクトル。代表的な代謝産物に関連付けられたNMRピークは標識される。略語は次のとおりです。AMP、アデノシンモノリン酸、α-KG、α-ケトグルタル酸、グルタミン酸、グルタミン酸、およびAla、アラニン。

ディスカッション

研究のかなりの数がMのトランスクリプトームとプロテオームのプロファイルを分析してきたin vitroおよび in vivo条件下での様々な環境下で結核 ^{。11月16日}最終的には、遺伝子発現と酵素活性の変化は、小分子量の分子の濃度の変動につながる。これらの化合物の完全な説明は、メタボロームを構成している。このように、代謝経路に薬や様々な成長条件の影?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬/機器の名称	会社	カタログ番号	注釈
ADCの充実	BD BBLミドル	212352
BACS-120サンプルチェンジャー	ブルカー
ブルカーアヴァンセNMR	ブルカー		500 MHzの
ウシ血清アルブミン	フィッシャー·サイエンティフィック	BP1600-100	フラクションV
遠心	ベックマン·コールター	アレグラ、X-15R	ベンチトップ
遠心管	コー​​ニング	430291	50ミリリットル滅菌ポリプロピレン
クライオジェニックバイアル	コー​​ニング	430488	2.0ミリリットル滅菌ポリプロピレン
シクロヘキサンximide	AGの科学	C-1189	毒性
D（+） - グルコース	アクロス	41095-0010
酸化ジュウテリウム	シグマアルドリッチ	617385
三角フラスコ	VWR	89095-266	滅菌、フラットベース、ポリカーボネート、0.22μmのPTFE膜ベントキャップ
フラッシュフリーズフラスコ	VWR	82018-226	750ミリリットル
凍結乾燥機	VWR	82019-038	4.5 Lのベンチ
グリセロール	ギブコBRL	15514-029
インキュベーター	ニューブランズウィック州	イノーバ40	ベンチシェーカー
行列Bを溶解	MPバイオメディカル	6911-100
溶解機	MPバイオメディカル	FastPrep-24
遠心	エッペンドルフ	5415D	ベンチトップ
遠心	ベックマン·コールター	微量22R	ベンチトップ
ミドル7H9ブロス	ディフコ	271310
NMR管	ノレル	ST500-7	5mMの
OADC濃縮	BD BBLミドル	212351
オレイン酸	シグマ	O1008
リン酸二カリウム	VWR	BDH0266
リン酸二水素カリウム	VWR	BDH0268
ローター - 微量22R	ベックマン·コールター	F241.5P	密封されたとポリプロピレン
ローター - アレグラX-15R	ベックマン·コールター	SX4750	バイオ認定のカバー付き
塩化ナトリウム	フィッシャー·サイエンティフィック	S271-3
ナトリウム3 - トリメチルシリル-2,2,3,3-D4	ケンブリッジアイソトープ	DLM-48
分光光度計	ベックマン·コールター	DU-530
分光光度計のキュベット	命綱	LS-2410	1.5 mlのポリスチレン、2明確な側面
注射器	ベクトン·ディッキンソン	309585	滅菌、3ミリリットルルアー
シリンジフィルター	ナルゲン	190-2520	0.2μmの無菌酢酸セルロース
ツイーン80	フィッシャー·サイエンティフィック	BP338-500