Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Özet

Ve metabolomik profili Mycobacterium tuberculosis Broth kültürleri büyüme sonrasında belirlenir. Koşullar bu mikroorganizmanın metabolik profil üzerinde besin takviyeleri, oksidanlar ve anti-tüberküloz ilaçların etkilerini test etmek için değişik olabilir. Özütü hazırlanması için prosedür 1D her ikisi için de geçerlidir ¹ H ve 2D ¹ H- ¹³ C NMR analizleri.

Özet

Mycobacterium tuberculosis küresel ölçekte insan mortalitenin önemli bir nedenidir. Hem çok (MDR) ve yaygın-(XDR) ilaca dirençli suşların ortaya çıkması mevcut hastalık kontrol çabalarını rayından tehdit ediyor. Böylece, şu anda mevcut olanlardan daha etkili ilaçlar ve aşılar geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. M. genom tüberküloz fazla 10 yıldır bilinen, fakat gen fonksiyonu ve zorunluluk bilgimizi önemli boşluklar bulunmaktadır olmuştur. Birçok çalışma bu yana gen ifadesinin küresel desenleri ile ilgili ilaçlar, oksidanlar ve büyüme koşullarının etkisini belirlemek amacıyla Transkriptomik ve proteomik düzeyde hem de gen ekspresyon analizi kullandık. Sonuçta, bu değişikliklerin nihai yanıtını birkaç bin küçük moleküler ağırlıklı kimyasal maddeler de dahil olmak üzere bakterinin metabolik kompozisyonu yansıtılır. Tedavi edilmeyen veya tr ya da yabani tip ve mutant suşlarının metabolik profilleri KarşılaştırılmasıBelirli bir ilaç ile eated, etkili bir hedef tespit edilmesini sağlar ve antitüberküloz aktivitesi olan yeni inhibitörlerinin gelişimine neden olabilir. Aynı şekilde, metabolome üzerinde iki ya da daha fazla koşulların etkileri de tespit edilebilir. Nükleer manyetik rezonans (NMR) metabolik ara tanımlamak ve ölçmek için kullanılan güçlü bir teknolojidir. M. hazırlanması için bu protokol, prosedürler NMR metabolomik analiz için tüberküloz hücre ekstreleri tarif edilmektedir. Metabolitlerin korunması maksimize etmek için soğuk sıcaklıkları korurken hücre kültürleri uygun koşullar ve gerekli Biyogüvenlik Seviyesi 3 çevreleme, ¹ hasat altında yetiştirilen ve mekanik lizis tabi tutulur. Hücre lizatları kurtarıldı, steril ve ultra-düşük ısılarda saklanan filtrelendi. Bu hücre özleri alikotlar canlı hücrelerinin yokluğu doğrulamak için koloni oluşturan birim için Middlebrook 7H9 agarda kaplanır. 37 inkübasyon iki ay ° C, eğer üzerine hiçbir vimümkün koloniler gözlenir, numune üretim prosesleri için tecrit tesisine kaldırılır. Özler, liyofilize edildi döteryumlanmış tampon içinde tekrar süspanse edilir ve daha sonra istatistiksel analize tabi tutulur spektroskopik verileri yakalamak, NMR aleti olarak enjekte edilir. Anlatılan prosedürler (1D) tek boyutlu ¹ H NMR ve iki-boyutlu (2B) ^{1 H-13} C NMR analizi her ikisi için de uygulanabilir. Bu metodoloji kromatografik yöntemlere göre daha güvenilir küçük molekül ağırlığı metabolit tespiti ve hücre ekstresi metabolik kompozisyonlar daha güvenilir ve duyarlı kantitatif analizler sağlar. Işlem varyasyonları hücre parçalama aşamasını takiben de tarif paralel Proteomik analizleri için adapte edilebilir.

Protokol

1. Protokol Metni

Bu protokol M. NMR metodolojisinin adaptasyonu vurgulamaktadır Tüberküloz (Sınıf III ajan). M. yaparken nedenle, Biyogüvenlik Seviyesi 3 (BSL3) uygulamaları takip edilmesi gereken bir yıllık sertifikalı laboratuvarda tüberküloz araştırma. Laboratuvar tarafından oluşturulan aerosoller Maruziyet bu mikroorganizmalar ile çalışan personel tarafından karşılaşılan en önemli tehlikedir. Aşağıdaki yordamlar Kurumumuzda yürütülen ve varyasyonları Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi'nin önerilerine dayanarak mevcut olabilir. Ortak personel koruyucu ekipman, bir Tyvek elbise, kabarık kap, patik, N95 solunum, göz koruma, kollu ve nitril eldiven bir çift çifti oluşacaktır. M. içeren çalışın Açık M. tüberküloz kültürü ve / veya manipülasyon tüberküloz konteyner tipi A2 veya B2 biyolojik güvenlik kabininde yapılır. Plastik-kaplı emici kağıt w üzerine yerleştiriliryüzey akıcı iş. Bertaraf veya tesis kaldırılacak tüm malzemeler / gereçler iki biohazard torba yerleştirilir ve otoklavlanarak dekontamine edilmelidir. Çalışma yüzeyleri ve dolap (FastPrep-24 lizis homojenizatör, spektrofotometre, buz kovası, vb) içinde kullanılan ekipmanlar 1% Amphyl (tüberkülsit, bakterisid fungusid ve virüsidal ajanı) ile her çalışma oturumundan sonra dezenfekte edilmelidir. M. tüberküloz kültürleri gibi dondurucu, inkübatör, santrifüj, ve buzdolabı gibi biyolojik güvenlik kabini dışında bulunan büyük ekipman ulaşım için çifte altına alınmalıdır. Santrifüj kapalı güvenlik kapları ve O-ring vida üst tüpleri ile yapılır. BSL3 laboratuar dışında ileri analiz için, hücre içermeyen özler 15 dakika süreyle 95 ° C de öldü 0.2 um bir filtreden veya mikroorganizmalar ısı ile filtre edilir. ² numuneler önce çevreleme kaldırılması için koloni oluşturan birim yokluğunda doğrulamak için kaplanır.

1. 110 Polisorbat 80 (Tween 80 topaklanma önlemek için) içeren Middlebrook 7H9 ortamı ml tam çorbası (mA DC-TW) ya da bir 250 ml Erlenmeyer şişesi için uygun bir ortam. Aktarma C-metabolitler ¹³ kullanırken üç kat kültürlerinin rutin durum başına yetiştirilen ve on özdeş kültür 1D ^1H NMR profilleme için yetiştirilir. Iki koşula (örneğin, ilaç ilavesi ile ve olmadan) çoğaltmak başına kültürünün çift hacmi büyüdü ve iki özdeş kültürlere ayrılabilir için. Bütün reaktif ve çözelti tarifleri protokolünün sonunda sağlanmaktadır.
2. M. 0.150 ml broth inoküle tüberküloz% 50 gliserol stoku (buz çözülmesini sağlar). Aşağıdaki 1. Not bakınız.
3. Kültürü 37 büyümesine izin ver ° C'de yaklaşık 6 gün (OD ₆₀₀ 0.6-0.8) 100 rpm'de sallayarak. Aşağıdaki Not 2'ye bakınız.
4. Hiçbir antibiyotikler, alternatif eklemeler veya diğer tedaviler gerekiyorsa, kültürler hasat edilmeye hazırdır. Tedaviler kullanıldığında, devamdoğrudan 5. adıma. Kirlenme testleri, fenotipik analizi, PCR testleri: Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak. Aşağıdaki Not 3'e bakınız. Bu noktada, 6. Aşamaya geçin.
5. Sallantıyı matara çıkarın ve istenen tedavi (örn., ilaç ya da metaboliti ekleyin) gerçekleştirin. Sıra bir ek süre (örneğin, 6-18 saat) için çalkalayıcı ve inkübe geri şişelerde. Bu sürenin sonunda, diğer bir 1.0 ml bir örnek alır ve OD ₆₀₀ belirler. Her balona bir 0.5 ml örnek kaldır, 4 bir mikrosantrifüj tüp ve yerde ° kültürü titrasyon ve kalite kontrolü için C aktarmak.
6. 5 dakika buz üzerine yerleştirin kültürler. Bu adımdan sonra, geriye kalan bütün protokol boyunca buz üzerinde hücreleri bırakın. Hasat 2,000 x g'de ve 4 de santrifüj ile kültür ° C'de bir tezgah üstü santrifüj kullanılarak 50 ml tüp içinde 15 dakika için. Her bir kültür 25 ml her biri (1 toplam dört tüp gerektirir00 ml 2B ¹ için yeterli bir sinyal-gürültü elde etmek için gerekli olan ^H-13 C kültür başına 50 ml 1D ¹ H NMR deneyleri için gerekli NMR deneyleri).
7. Yukarıda anlatılan parametrelere göre santrifüj buz-soğuk GKD ₂ O (yaklaşık olarak 15 mi, ilk kez ve 10 ml ikinci kez) ile her bir hücre peleti iki kez yıkayın. İkinci yıkama için iplik önce aynı tüp içine 10 ml alikotları birleştirir. 1.0 ml GKD ₂ O (hücre peleti hacim için ayarlamak için gereken) bir nihai hacim içinde hücre pelet yeniden süspanse edin. Yığınlaşma serbest tek bir hücre süspansiyonu bu aşamada arzu ediliyorsa, kısa bir süre için sonike edilmiş hücreler ve / veya bir 27 gauge iğneden üç kez geçirildi edilebilir. Alternatif olarak, hücre peleti -80 ° C de donduruldu ve daha ileri işleme kadar saklanabilir. İkinci durumda ise, dondurulmuş pelet yeniden süspanse edilmesi için önce buz üzerinde çözülmüş edilir. Yukarıda belirtildiği gibi 1.0 ml GKD ₂ O değerindeki bir son hacim içinde, hücre topakları yeniden süspanse edin.
8. TransfeParçalama Matris B (0.1 mm silis küreler) ihtiva eden 2.0 ml bir vidalı kapak tüp için r, 1.0 ml hücre süspansiyonu. Biyogüvenlik kabini içindeki FastPrep-24 lizis homojenizatör yerleştirin. Tutma tüpün üstünde plaka konuştu güvence, numune tutucu içine örnekleri koyun. 6 metre / saniye hız ayarında homojenleştiricide 60 sn örnekleri işleyin.
9. 15.000 x g'de ve 4, bir mikrosantrifüj içinde örnekleri döndürme ° C'de pellet hücre artıkları ve sağlam hücreler 10 dakika için.
10. Steril bir tüp içine bir şırınga filtresi (0.2 mikron) ile süpernatant ve geçiş örnek çıkarın. MA DC agar üzerinde numune Plate 0.1 ml (% 10 veya örnek olarak örnek bir temsilcisi fraksiyonu) hiçbir canlı hücre olduğunu doğrulamak için. Araştırmacılar ayrıca, birden fazla filtrasyon adım yapmak ve / veya herhangi bir potansiyel biyogüvenlik endişeleri önlemek veya belirlemek amacıyla canlı-ölü boyama prosedürleri kullanarak özler canlı hücrelerin varlığını doğrulayabilir. Depolamak için bir madde, etanol-kuru buz banyosu içinde örnekleri Dondurarak-80 ° C de bir NMR tesiste liyofilize ve işlenebilir hazır oluncaya kadar.
11. 2 ay sonra, koloni oluşturan birimlerin yokluğu doğrulamak için plakaları kontrol edin. Hiçbir CFU en bulunursa, örnekleri BSL3 laboratuar dışına alınabilir. Diğer analizler normal olarak çoklu kullanıcı sunmaktadır ve herhangi bir özel önleme şartları altında çalışan bir standart NMR odası içinde gerçekleştirilir.
12. Kuruyana kadar Lyophilize numuneleri, daha sonra NMR tampon ve bir mikrosantrifüj tüpüne transfer 0.7 ml içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 13,000 x g'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. 0.6 ml ve 5 mm NMR tüpü transfer çıkarın. Alternatif olarak, liyofilize örnekleri olmayan biyozararli düzenli örnekleri gibi harici tesisine gönderilecek olabilir.
13. NMR verileri hemen toplanır. Tüm önlemlere rağmen, aktif enzimler hala mevcut olabilir ve örnek uzun süre için genellikle istikrarlı değildir. Örnekler m ° C ila oda sıcaklığında ve 4 'te dışında kaldığında NMR spektrum değişiklikler belirgin hale gelmektedirler1 hafta daha cevher. Ayrıca, NMR veri toplama örnekler rastgele her kategoride seçilen tedavi ve ilaç tedavi kültürler arasındaki izliyor. NMR spektrumları toplanmıştır önce belirli bir kategoriye daha uzun bir gecikme vardı çünkü bu gereksiz önyargı önler. Tüm işlem görmemiş örnekler için NMR spektrumu, ilaç tedavisi örnekleri birinci toplanmış ve daha sonra takip edildi eğer veri bir sapma meydana gelmektedir. Örnekler hemen NMR ile analiz edilmesi mümkün değilse, numuneler -80 ° C'de 1 ml Eppendorf tüpleri saklanmalıdır
14. Örneğin, kilit, şim, ayar ve 90 ° darbe uzunluğu optimizasyonu gibi birkaç rutin adımları içeren bir BACS-120 numune değiştirici, cihaz kalibrasyonu, içine numune yerleştirdikten sonra sonuçların kalitesini en üst düzeye çıkarmak için gereklidir. Tek bir numune 90 ° nabız süresini ayarlamak ve kalan numuneler için araç ayarlamak için kullanılır. Kilitleme shimming ve her örnek için NMR veri toplama otomatik istimal olduğunug ICONNMR ve gradshim.
15. A 1D ^1H NMR spektrumu uyarma heykel kullanarak su bastırmalı Bruker zgesgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 32k veri 5482.5Hz bir süpürme genişliği ile puan, 128 taramalar ve 16 kukla taramaları toplam kullanılmaktadır. A 2D ^{1 H-13} C HSQC spektrum Bruker hsqcetgp puls sekansı kullanılarak toplanır. 5000.0 Hz süpürme genişliği ile 2048 veri noktalarının toplam doğrudan ¹ H boyut boyunca toplanan ve dolaylı ¹³ C boyut boyunca 18864,9 Hz süpürme genişliği ile 64 veri noktaları edilir. Spektrum gürültü sinyali iyi almak için 128 taramalar ve 16 kukla taramaları ile tahsil edilir.

Şekil 1. Deneysel prosedür bir akış şeması tasvir edilmiştir.

NMR tamponu

50 mM potasyum fosfat, soluk sarı stok solüsyonu50 uM TMSP ile er:

• 2.17 g K ₂ HPO ₄ (potasyum fosfat dibazik)
• 1.70 g KH ₂ PO ₄ (potasyum fosfat tekbazlı)
• 7.86 mg Sodyum-3-Trimethylsilylpropionate (TMSP-2 ,2,3,3-D ₄ (D,% 98))
• "100%" D ₂ O 500 ml suda eritilir
• Nihai çözüm pH 7.2 (düzeltilmemiş) olmalıdır

MA DC-TW veya MOADC-TW (1 L)

• 4.7 g Middlebrook 7H9 broth base
• 900 ml GKD ₂ O
• 2 ml gliserol
• 25 dakika boyunca kısımlar ve otoklav karıştırın. : Aşağıdaki çözümler dokunun ve eklemek için serin sıvı
• 100 ml ADC MOADC hazırlanmasında mA DC veya 100 ml OADC hazırlanmasında
• 2.5 ml% 20 Tween 80 (alternatif olarak, non-metabolik% 20 Tyloxapol 1 ml)
• 10 ml% 1 sikloheksimid

ADC (1 L)

• 20 g D (+)-glikoz
• 50 g BSA FraksiyonuV
• 8.5 g NaCl
• 800 ml GKD ₂ O
• Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C'de depolayın

Alternatif olarak, OADC (1L) hazırlamak için% 1 oranında oleik asit (aşağıda tarif 250 mL'lik bir toplu hale getirir) artı 50 ml yukarıda listelenen tüm bileşenlerini ekleyin. Birlikte eritilir hacmi 1 L uyum ve 0.2 mikron filtre ile sterilize edin. Şişe 4 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza sarılmış gerekmektedir

• 2.5 g Oleik Asit
• 250 ml 0.2 M NaOH
• 55 ısı ile Çözünme oleik asit (soğutma üzerine katılaşan) ° 10 dakika ve 60 dakika için karıştırma ile NaOH çözeltisi ve ısı ile eklemek için C'dir. Alüminyum folyo ile sarılmış steril cam şişelerde saklayın. 4 at parafilm ve mağaza ile Seal şişeleri ° C.

Tercih ederseniz, katalaz Zenginleştirme ile ticari BD BBL Middlebrook ADC veya OADC satın alabilirsiniz.

% 1 Sikloheksimit (100ml)

• 1 g sikloheksimid
• 100 ml GKD ₂ O

Çözülür ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edin. 4 ° C'de depolayın Dikkat: sikloheksimid son derece dikkatle ele kadar zehirli olduğunu.

% 20 (v / v) Tween 80 (100ml)

• 20 ml Tween 80
• 80 ml ​​GKD ₂ O

% 20 w / v çözelti hazırlamak için, alternatif olarak, Tween 80 ve 20 g (yoğunluk 1.06 g / mL, yaklaşık 18.9 ml) tartın. 55 Isı çözümü ° C 30 dk erimesi ve tamamen karıştırmak için. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın.

% 20 (v / v) Tyloxapol (100ml)

• 20 ml Tyloxapol
• 80 ml ​​GKD ₂ O

% 20 w / v çözelti hazırlamak için; Alternatif olarak, Tyloxapol 20 g (yoğunluğu 1,1 g / mL, yaklaşık 18.2 ml) tartın. Di için 30 dakika için 55 ° C ısıya çözeltissolve ve tamamen karıştırın. Bir 0.2 um filtre ile sterilize sıvı. Oda sıcaklığında nihai çözelti saklayın.

Not 1: M. Gliserol stokları tüberküloz aşağıdaki protokol kullanılarak hazırlanmıştır.

M. Stoklama tüberküloz

• M. büyütün doygunluk 50 ml mA DC tüberküloz (OD ₆₀₀ = 1.5 ila 2.0) 37 ° C sallayarak koşulları (100 rpm) altında. Suşu bağlı olarak, bu 7-14 gün sürer.
• Pelet kültür için 15 dakika için 4 ° C'de 2.000 x g'da örnekleri Spin. Süpernatantı.
• Steril% 50 gliserol 6 ml süspanse edin.
• 4 Corning kriyojenik şişeleri ve etiket uygun içine tablet 1,5 ml.
• -80 Etanol / kuru buz banyosu ve mağaza hemen flaş dondurma şişeleri ° C.

Not 2: aşılamak suşu H37Rv (-80 ° 1,5 yaşında C stok) mA DC medya 70 mL _{OD 600 verir/ Bir Innova 40 Shaker sallayarak koşullar (100 rpm) altında 37 ° C'de büyüme 5 gün sonra yaklaşık 0,6 alt>.}

Not 3: kültür kontaminasyon test etmek için, araştırmacılar standart zengin ortam üzerine bir kültür kısım aşılamak ve gecelik inkübasyon sonrası büyüme yokluğu doğrulamak olabilir. Rutin, kültürleri koloni morfolojisi gözlemlemek ve faz-kontrast mikroskop ile incelenmesi mA DC agarda kaplanır. Açıklandığı gibi İsterseniz, kültürler PCR kullanılarak doğrulanabilir 6110 primerler IS. ³

2. Temsilcisi Sonuçlar

Da hazırlanmış olan bir örnek, Şekil 2'de tasvir edilen bir benzer bir NMR tayfı elde edilir. Bu spektrum, M. bir temsilidir; tüberküloz vahşi tip metabolik havuzu. Metabolitleri, doğrudan ya da dolaylı olarak, D-alanin yolu ile ilişkilidir. Ayrıca, zirve yoğunlukları büyüklüğü metabolit konsantrasyonları ile orantılıdır sunmakhücre özü. Bu nedenle tedavi kültürleri, ilaç tedavisi ve mutant suşlar arasındaki pik şiddetleri değişiklikleri metabolitleri ve metabolik yollar tedirginlikler gösterebilir. M. tüberküloz 1D ¹ H NMR spektrası, bir üçlü-rezonans, Z-eksenine gradyanı kriyoprob ile donatılmış bir Bruker Avance 500 MHz spektrometre üzerinde elde edilmiştir. Spektrumu ca içerir. Bu amino asitler, nükleotid öncülleri ve glikolitik ve sitrik asit ara dahil olmak üzere 40-50 metabolitleri tanımlamak ve ölçmek mümkün olduğu 400 zirveleri. İkon Bruker yazılımı ile birlikte bir BACS-120, numune değiştirici NMR verileri toplama otomatikleştirmek için kullanılmıştır. 1D ¹ H NMR spektrumları verimli (sonraki temel bileşenler analizi (PCA) veya dikey kısmi en küçük kareler diskriminant analizi eserler indükleyebilir temel koleksiyon için herhangi bir ihtiyacı ortadan kaldırarak, düz taban çözücü kaldırmak ve korumak için uyarma heykel ⁴ kullanılarak toplanmıştır OPLS- DA). A 1D ¹ H-NMR spektrumu 5482,5 Hz ve 32K veri noktaları bir spektrum genişliği 25 ° C 'de toplanmıştır. 16 kukla taramaları ve 128 taramalar toplam spektrum elde etmek için kullanılmıştır. ACD Labs 1D NMR işlemci yazılım yarı-otomatik olarak her 1D ¹ H NMR spektrumu işlemek için kullanıldı. Spektrumu Fourier, dönüştürülmüş aşamalı ve TMSP tepe (0.0 ppm) başvurulan idi. NMRpipe yazılım paketi, tek tek 2B ^{1 H-13C} NMR spektrumları işlemek için kullanılan ve NMRDraw ile analiz edilmiştir. Bruker FID veri dosyasının ilk NMRpipe tarafından tanınabilir bir dosya biçimine dönüştürülür ve ardından spektrumu Fourier dönüştürüldü, faz düzeltilmiş ve sıfır doldurdu. 1D ^1H NMR spektrumu ve 2D ^{1 H-13C} NMR spektrumunda gözlenen NMR zirvelerinin ¹ H ve sırasıyla 0.05 ve 0.50 ppm, ¹³ C kimyasal kayma toleranslar ve Madison Metabolomik Konsorsiyumu Veritabanı (MMCD kullanarak belirli metabolitlerin atanan ) ^{5 BioMagResBank, 6 ve İnsan Metabolome Veritabanı. Özellikle 7, 1D ve 2D NMR spektrumları NMR kimyasal vardiya pik liste daha sonra İnsan Metabolome Veritabanı yüklenen nerede, elle pik toplanmış bulunmaktadır. İnsan Metabolome Veritabanı tarafından tanımlanan metabolitleri NMR rezonansı eşleşen ve metabolik ağa mensup sayısını maksimize hem esas NMR spektrumu atanır. Her bileşik veya metabolit genellikle birden CH çiftleri ve buna birden NMR rezonansı vardır. Bu nedenle deneysel NMR spektrum gözlenmiştir, bu NMR rezonansı ve daha çok, daha çok metaboliti bulunmaktadır. Benzer şekilde, aynı yol ile ilişkilendirmek birden metabolitleri tanımlamak doğru atamaları olasılığını artırır. Metabolitleri ve metabolik yolların varlığı Genlere ve genoma (KEGG) 8 Kyoto Ansiklopedisi ve MetaCyc veritabanları ile doğrulanır. 9 Mycobacterium smegmAtis M. için kullanışlı bir model sistemi tüberküloz ve diğer mikobakteriyel patojenler. M. başka yerde tanımlandığı gibi, örnek smegmatis'in da sonication tarafından bozulmuş olabilir. 10.}

Şekil 2. Mycobacterium tuberculosis hücre ekstresi 1D ^1H NMR spektrumu. Metabolitlerinin temsili ile ilişkili NMR zirvelerinin etiketlenir. Kısaltmalar aşağıdaki gibidir: AMP, adenozin mono fosfat, α-Kg, α-ketoglutarat, Glu, L-glutamat ve Ala, alanin.

Tartışmalar

Çalışmaların önemli bir kısmı M. Transkriptomik ve proteomik profilleri analiz var in vitro ve in vivo koşullarında çeşitli altında tüberküloz. ^11-16 Sonuçta, gen ekspresyonu ve enzim aktivitesinde değişiklikler küçük molekül ağırlıklı moleküllerin konsantrasyonları değişikliklere yol açmaktadır. Bu bileşiklerin tam açıklaması metabolome oluşturmaktadır. Böylece, metabolik yolaklar uyuşturucu ve değişen büyüme koşullarına etkiler...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif / Ekipman Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
ADC Zenginleştirme	BD BBL Middlebrook	212352
BACS-120 Numune Değiştirici	Bruker
NMR Bruker Avance	Bruker		500 MHz
Bovine Albumin Serum	Fisher Scientific	BP1600-100	Fraksiyon V
Santrifüj	Beckman Coulter	Allegra X-15R	Tezgahüstü
Santrifüj Tüpleri	Corning	430291	50 ml steril polipropilen
Kriyojenik Flakon	Corning	430488	2.0 ml steril polipropilen
Cycloheximide	AG Bilimsel	C-1189	Zehirli
D (+) - Glikoz	ACROS	41095-0010
Ağır su	Sigma Aldrich	617385
Erlenmeyer Flask	VWR	89095-266	Steril, düz taban, polikarbonat, 0.22 mikron PTFE membran havalandırmalı kapak
Flaş Freeze Flask	VWR	82018-226	750 ml
Kurutucu dondur	VWR	82019-038	4.5 L Benchtop
Gliserin	GibcoBRL	15514-029
Kuluçka makinesi	New Brunswick	Innova 40	Tezgahüstü çalkalayıcı
Parçalama Matris B	MP Biomedicals	6911-100
Lizis Makinesi	MP Biomedicals	FastPrep-24
Mikrosantrifüj	Eppendorf	5415D	Tezgahüstü
Mikrosantrifüj	Beckman Coulter	Mikrofuge'de 22R	Tezgahüstü
Middlebrook 7H9 Broth	Difco	271310
NMR tüpler	Norell	ST500-7	5mM
OADC Zenginleştirme	BD BBL Middlebrook	212351
Oleik Asit	Sigma	O1008
Potasyum fosfat dibazik	VWR	BDH0266
Potasyum Fosfat mono	VWR	BDH0268
Rotor - mikrofuge'de 22R	Beckman Coulter	F241.5P	Mühürlü ve polipropilen
Rotor - Allegra X-15R	Beckman Coulter	SX4750	Biyo-sertifikalı kapaklar ile
Sodyum klorür	Fisher Scientific	S271-3
Sodyum-3-trimethylsilylpropionate-2 ,2,3,3-D4	Cambridge İzotop	DLM-48
Spektrofotometre	Beckman Coulter	DU-530
Spektrofotometre Küvetleri	Hayat çizgisi	LS-2410	1.5 ml polistiren, 2 açık taraf
Şırınga	Becton Dickinson	309585	Steril, 3 ml Luer-Lok
Şırınga Filtre	Nalgene	190-2520	0.2 um steril selüloz asetat
Tween 80	Fisher Scientific	BP338-500