ex vivoでマウス神経上皮における単一細胞分裂のライブイメージング

要約

ここでは、のために必要なツールを開発 ex vivoでライブイメージング

要約

私たちは、蛍光マーカーおよび胚マウス神経上皮の培養スライスのライブイメージングを統合するシステムを開発しました。私たちは、トレース系統遺伝細胞のための既存のマウス系統を利用しました：タモキシフェン誘導性CreのラインとのCreレポーターラインはCreを媒介組換えによりDsRedの発現。タモキシフェンの比較的低レベルを用いて、我々は我々は、個々の細胞分裂に従うことを可能にして、少数の細胞で組換えを誘導することができた。さらに、我々は、Olig2-EGFPトランスジェニックライン^1-3を使用して、我々はウイルスが繊毛マーカー、SSTR3-GFP ^4を発現培養スライスを感染させることにより繊毛の形成を監視シグナリング（シーッ）ソニック·ザ·ヘッジホッグに転写応答を観察した。イメージするためには神経上皮は、我々は神経管を単離し、E8.5で胚を採取し、撮影室への適切な培養条件の神経スライスをマウントし、タイムラプス共焦点イメージングを行った。当社EX生体ライブイメージング法は、一次繊毛形成と生理学的に適切な方法でShhの応答の相対的なタイミングを評価するために、単一の細胞分裂をトレースすることを可能にします。この方法は簡単明瞭な蛍光マーカーを使用して適応され、フィールドを、その場で 、リアルタイムで細胞の挙動を監視するためにどのとツールを提供しすることができます。

プロトコル

成体マウスは、機械頸椎脱臼により安楽死させる。すべての動物の手順はIACUCとエモリー大学のバイオセーフティ委員会によって承認された。

1。胚の生成

1. クロスタモキシフェン誘導性Creをライン、CAGGCreER、およびdsRedCreレポーターライン点（Tg（CAG-Bgeo、-DsRedを* MST）1Nagy）（ 図^1）5,6。娘細胞、クロスCAGGCreERとOlig2-EGFP BACトランスジェニックマウス（Tgは（Olig2-EGFP）EK23Gsat）（ 図^1）7,8とDsRedのラインにおけるShhの応答の相対的なタイミングを監視する。
2. 100％エタノールでタモキシフェンを溶解し、Creの発現と細胞の小さなサブセットでDsRedのラベルを誘導するために胚6.5（E6.5）で妊娠した女性に体重40グラムあたり2.5 mgのタモキシフェンの腹腔内注射を行う。
3. 48時間、後、胚を解剖蛍光顕微鏡を用いたDsRed肯定胚を特定し、培養皿にそれらを転送しobservex vivoでの撮影時の電子の単一細胞分裂（下記参照）。

2。全体マウス胚培養

1. 10％新生仔ウシ血清及び1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / ^S）9を補充したDMEM/F12（1:1）を含む予め温めた洗浄媒体でE8.5胚を解剖する。
2. 直接蛍光顕微鏡下で37℃の加熱ステージ上で解剖、場所後の胚及びGFPおよび/またはDsRedをプラス（下記参照）として識別します。
3. L-グルタミン、フェノールレッドを含まない50％のSprague-Dawley系雄性ラットの血清および50％DMEM/F12（1:1）を含む予め平衡培地500μlの降下との1％に2胚まで転送0.85％NaCl及びP / S ⁹の1M HEPES。
4. 蒸発を防ぎ、培養皿を37℃、5％CO ₂インキュベーターに胚を含む転送する媒体を介して平衡化した軽油の薄い層（0.1センチ）を適用します。

3。ウイルス感染

1. 神経上皮におけるラベル繊毛するためには、E8.5胚を含む培養培地500μlの平衡化の一滴までSSTR3-GFPレンチウイルスの5-10μlを、約200万ビリオンを追加します。
2. 文化の18時間後、ウイル​​スを洗い流すと、神経管のスライスを準備するために洗浄媒体の数滴に感染した胚を移す。

4。ライブイメージングのための神経管のスライス標本

1. 1％寒天コーティングされた皿に、マイクロナイフの大きさ0.025ミリメートルを使用して予め温めておいた洗浄媒体におけるE8.5胚の神経管を解剖。
2. 35ミリメートルポリ-L-リジンコートガラスボトムディッシュ上のフェノールレッドなしの平衡化培地150μlのドロップで孤立神経管腹側を下に置きます。
3. するために、ガラスカバースリップの狭い部分で100％純粋なワセリンとマウント神経管の周りに溶けたろうそくのろう（IKEAからろうそく）、ゆっくりと押しから作られた1:1の混合物の少量を入れてサンプルを固定。
4. 平衡化した軽油の薄い層（〜0.1センチメートル）（ 図2）皿をカバーしています。

5。ライブイメージングとタイムラプス共焦点顕微鏡

1. 温度を調節する環境室を装備ニコンA1Rレーザ走査共焦点倒立顕微鏡下に置く皿は、37℃、5％CO _2を設定してください。
2. 40倍の油浸対物レンズの使用がOlig2-GFPとDsRedの陽性細胞を監視する一方、GFPラベル繊毛とDsRedの陽性細胞を記録するために60倍の油浸対物レンズを使用してください。
3. タイムラプス撮影条件を設定するためにNISの要素ソフトウェアを開きます。 10分ごとに1.5ミクロン（40倍目標）と0.4μmの（60倍目標）の間隔で最大8ミクロンの間隔で25ミクロンまでのzスタックを取得する。必要に応じて488と561 nmの励起波長と送信チャネルを使用してください。 512×512のサイズで画像を取得する。 int型の複数のユーザ定義領域を設定する同時記録​​を行うことerest。
   、スキャン速度1、線平均2とピンホールの大きさ（61、画像のレーザパワーと明るさに最適な露出、使用低いレーザー強度（4.5％までEGFP 488分の405 mCherry 561は最大11％）で調整したDsRedのためのミクロン; Olig2ための28.1ミクロン; SSTR3GFPための72ミクロン、DsRedのとSSTR3GFPための61.3ミクロン、DsRedのとOlig2用58ミクロン）。遺伝的に符号化された蛍光レポーターの使用は、低レーザパワーと明るさを検出することができました。
4. Imaris 3D再構築ソフトウェアを使用して記録されたデータを分析します。

6。免疫蛍光

1. ガラス皿で1時間氷上で4％パラホルムアルデヒド/ 0.1 Mリン酸緩衝液（4℃）で胚あるいは孤立神経チューブを固定します。
2. 氷（4℃）でPBSのサンプル2時間（変化PBS数回）洗浄し、一晩または胚シンクまで、30％スクロース/ 0.1Mリン酸緩衝液に入れ。
3. -80でドライアイスや店舗℃の上、10月に凍結を埋め込むPクライオスタット（10ミリメートル）で切片erform。
4. 1％の熱不活化羊血清および0.1％トリトンX-100 PBS中を含む洗浄溶液中で10分間スライドを洗浄します。
5. ウサギ抗血清Arl13b 1:1500及びマウスモノクローナル抗Arl13b 1時05分（295B/54）;、ウサギ抗Olig2ラットモノクローナル抗RFP（5F8）、1:200以下の濃度で洗浄溶液中の一次抗体を希釈1:300、マウスモノクローナルPax6の、シーッとNkx2.2-すべて1時10分、およびKi67の1:500ポリクローナルウサギ。乾燥避け、4℃で一晩のままにフラット加湿チャンバー内のスライドあたり150μlの、パラフィルムでカバー周り追加℃に
6. 三回、20分毎に時間室温で洗浄溶液中でスライドを洗浄します。
7. 1:200濃度の洗浄溶液で二次抗体アレクサフルーア488、568、350を希釈。核を染色するためにヘキスト1:3,000またはTO-PRO-3 1:500を使用します。スライドあたり150μlを添加し、光から保護加湿チャンバー内で室温で1時間のままにしておきます。
8. 洗浄ソリューションTWのスライドを洗うoが時間、室温で30分間、毎回。
9. 80％でマウントスライドは24時間以内にゴールドアンチフェード試薬およびビューを延ばす。

結果

ここでは、E8.5マウス神経上皮内の単一細胞分裂のex vivoでのライブイメージングを行った。個々の細胞を標識するためには、組換え^5,6（ 図3A）に基づいDsRedを表明したCreレポーター行を含む細胞のサブセットにCreリコンビナーゼを誘導した。したがって、48時間後に我々はex vivoでイメージング（ 図4A-D）の間に単一の細胞分裂を観察することがで?...

ディスカッション

当社のex vivoでシステムが直接、リアルタイムで開発神経上皮内の単一細胞分裂を観察することを可能にします。例として、我々はマウス胚神経管の中に細胞分裂を検討し、繊毛形成またはShhの応答のいずれかを監視した。私たちは、イメージング結果（N = 24）私たちの技術は生理学的に適切なデータを提供示す固定部（N = 178）の結果と一致していたことを確認した。

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934