Ex vivo imagens ao vivo de divisões celulares simples no mouse neuroepithelium

Resumo

Aqui vamos desenvolver as ferramentas necessárias para Ex vivo Imagens ao vivo para traçar divisões celulares individuais no rato E8.5 neuroepithelium

Resumo

Nós desenvolvemos um sistema que integra imagens ao vivo de marcadores fluorescentes e as fatias de cultura de neuroepithelium embrionário mouse. Aproveitamos mouse linhas existentes para a célula de linhagem genética traçado: a linha Cre tamoxifeno induzível e uma linha repórter Cre expressar dsRed sobre recombinação Cre-mediada. Ao utilizar um nível relativamente baixo de tamoxifeno, fomos capazes de induzir a recombinação em um pequeno número de células, que permite que se siga as divisões celulares individuais. Além disso, observou-se a resposta de transcrição para o Sonic Hedgehog (Shh) de sinalização usando um OLIG2-eGFP transgênico linha ^1-3 e acompanhámos formação de cílios por infectar a fatia culta com vírus expressando o marcador de cílios, Sstr3-GFP ^4. A fim de imagem neuroepithelium, colhemos embriões em E8.5, isolada do tubo neural, montado a fatia neural em condições de cultura adequadas para a câmara de imagens e realizada lapso de tempo de imagem confocal. Nosso exmétodo in vivo de imagens ao vivo nos permite traçar divisões celulares individuais para avaliar a temporização relativa de formação de cílios e resposta Shh de um modo fisiologicamente relevante. Este método pode ser facilmente adaptado por meio de marcadores fluorescentes distintas e fornece o campo com o qual as ferramentas para controlar o comportamento de células in situ e em tempo real.

Protocolo

Camundongos adultos são sacrificados por deslocamento cervical mecânica. Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo IACUC e da Comissão de Biossegurança da Universidade de Emory.

1. Geração Embryo

1. Cruz Cre linha tamoxifeno induzível, CAGGCreER e dsRedCre linha repórter (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Figura 1) ^5,6. Para controlar a temporização relativa de Shh na resposta das células filhas, transversal e CAGGCreER linha com a DsRed OLIG2-eGFP BAC ratinhos transgénicos (Tg (OLIG2-EGFP) EK23Gsat) (Figura 1) ^7,8.
2. Dissolve-se o tamoxifeno em etanol a 100%, e realizar a injecção intraperitoneal de 2,5 mg de tamoxifeno por 40 g de peso corporal em mulheres grávidas em embrionário 6,5 (E6.5) para induzir a expressão de Cre e rotulagem DsRed num pequeno subconjunto de células.
3. 48 horas depois dissecar embriões, identificar embriões positivos DsRed usando o microscópio de fluorescência, transferi-los para o prato de cultura e observávelde e divisões celulares individuais durante ex vivo de imagens (veja abaixo).

2. Todo Rato Embryo Cultura

1. Dissecar embriões E8.5 em meio de lavagem pré-aquecido contendo DMEM/F12 (1:1) suplementado com 10% de soro de bezerro recém-nascido e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S) ^9.
2. Logo após dissecação, lugar embriões no estágio de aquecimento de 37 ° C sob o microscópio fluorescente e identificar como GFP e / ou dsRed positivo (ver abaixo).
3. Transfira até dois embriões em uma gota 500 ul de meio de cultura pré-equilibrada com 50% de soro de rato a partir de ratos Sprague-Dawley do sexo masculino e 50% de DMEM/F12 (1:1) sem vermelho de fenol suplementado com L-glutamina e 1% de HEPES 1 M em NaCl e 0,85% P / S ^9.
4. Aplicar uma camada fina (0,1 cm) de óleo mineral leve, equilibrada sobre o meio para evitar a evaporação e transferir a placa de cultura contendo os embriões a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora.

3.Infecção viral

1. A fim de etiqueta cílios no neuroepitélio, adicionar 5-10 ul de Sstr3-GFP lentivírus, aproximadamente 2 milhões de viriões, em 500 mL equilibrada gota de meio de cultura contendo um embrião E8.5.
2. Após 18 horas de cultura, transferência de embriões infectados em várias gotas de meio de lavagem para lavar o vírus e preparar fatia tubo neural.

4. Tubo Neural Slice Preparação para imagens ao vivo

1. Dissecar tubo neural do embrião E8.5 em meio de lavagem pré-aquecido, utilizando um tamanho de micro-faca 0,025 milímetros, em um 1% de agar prato revestido.
2. Colocar o tubo neural isolado lado ventral para baixo numa gota de 150 mL de meio de cultura sem vermelho de fenol equilibrado sobre o mm de poli-L-lisina revestido prato fundo de vidro 35.
3. Coloque pequenas quantidades de uma mistura 1:1 feita a partir de 100% puro vaselina e cera de vela derretida (vela do IKEA) ao redor do tubo neural montada, e pressione suavemente por um pedaço estreito de lamela de vidro, a fim deimobilizar a amostra.
4. Cobrir a placa com uma camada fina (~ 0,1 centímetros) de óleo mineral leve, equilibrada (Figura 2).

5. Imaging and Time-lapse microscopia confocal viver

1. Coloque prato sob a Nikon A1R Laser Scanning microscópio invertido confocal equipado com uma câmara ambiental que regula a temperatura, previsto para 37 ° C e 5% CO _2.
2. É objectivo de 60x de imersão em óleo de gravar GFP cílios rotulados e células positivas DsRed, enquanto que a utilização de óleo objectiva de 40x de imersão para monitorar OLIG2-GFP e células positivas DsRed.
3. Abra o software NIS Elements para criar condições de imagem lapso de tempo. Cada 10 minutos adquirir z pilhas de até 25 um, com um espaçamento de 1,5 um (objetiva de 40x) e até 8 mM, com um espaçamento de 0,4 um (objectiva 60x). Use 488 e 561 nm, o comprimento de onda de excitação e canal de transmissão, se necessário. Aquisição de imagens no tamanho 512 x 512. Configurar várias regiões definidas pelo usuário de interest para executar a gravação em simultâneo.
   A exposição ideal de potência do laser e brilho da imagem foi ajustado pelo uso do laser de baixa intensidade (até 11% para mCherry 561, até 4,5% EGFP 405/488), velocidade de digitalização 1, linha média, 2 e tamanho de furo de pino (61 mm para DsRed; OLIG2 28,1 mm para 72 mm para; SSTR3GFP; 61,3 mm para DsRed e SSTR3GFP, 58 mm para DsRed e OLIG2). O uso de repórteres fluorescentes geneticamente codificados nos permitiu detectar o brilho com baixo consumo de energia laser.
4. Analisar os dados gravados usando software reconstrução Imaris 3D.

6. Imunofluorescência

1. Fix embriões ou tubos neurais isoladas em paraformaldeído a 4% / tampão de fosfato 0,1 M em gelo (4 ° C) durante 1 hora numa placa de vidro.
2. Lavar as amostras 2 horas em PBS em gelo (4 ° C) (variação de PBS algumas vezes) e colocado em 30% de sacarose / 0,1 M de tampão de fosfato durante a noite ou até embriões pia.
3. Incorporar em outubro, congelar em gelo seco e armazenar em temperatura de -80 ° C. Perform em criostato de corte (10 mm).
4. Lavar as lâminas durante 10 minutos em solução de lavagem contendo soro de ovelha inactivado por calor a 1% e 0,1% de Triton X-100 em PBS.
5. Diluir anticorpos primários em solução de lavagem em seguir concentrações: Rat monoclonal anti-RFP (5F8), 1:200; coelho anti-Arl13b soro 1:1500 e mouse monoclonal anti-Arl13b 01:05 (295B/54); coelho anti-OLIG2 1:300; mouse monoclonais Pax6, Shh e Nkx2.2-all 01:10, e Coelho policlonal Ki67 1:500. Adicionar cerca de 150 mL por slide em câmara úmida plana, cubra com filme plástico para evitar ressecamento e deixar mais a noite a 4 ° C.
6. Lavar as lâminas em solução de lavagem por três vezes, com 20 min de cada vez, à temperatura ambiente.
7. Diluir anticorpos secundário Alexa Fluor 488, 568, 350 em soluções de lavagem na concentração de 1:200. Use Hoechst 1:3.000 ou TO-PRO-3 1:500 para corar núcleos. Adicionar 150 ul por lâmina, deixar 1 hora à temperatura ambiente em câmara húmida protegida da luz.
8. Lave as lâminas em solução de lavagem twØ vezes, 30 min de cada vez a temperatura ambiente.
9. Monte desliza em 80% Prolongar Ouro reagente anti-fade e vista dentro de 24 horas.

Resultados

Aqui realizamos ex vivo de imagens ao vivo de divisões celulares individuais dentro do E8.5 rato neuroepithelium. Para identificar as células individuais, induzida recombinase Cre em um subconjunto de células que contêm uma linha repórter que expressa Cre dsRed mediante recombinação ^5,6 (Figura 3A). Assim, 48 horas mais tarde, fomos capazes de observar divisões celulares individuais durante ex vivo de imagens (Figuras 4A-D). Paralelamente, acompanham...

Discussão

Nosso sistema ex vivo nos permite observar diretamente divisões celulares individuais dentro do neuroepithelium em tempo real em desenvolvimento. Como exemplo, examinamos divisões celulares dentro do rato tubo neural embrionário e monitorados ou formação cílio ou resposta Shh. Confirmámos nossos resultados de imagem (n = 24) foram consistentes com os resultados de secções fixas (n = 178), indicando a nossa técnica fornece dados fisiologicamente relevantes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934