JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы разрабатываем инструменты, необходимые для Экс естественных условиях Живого изображения проследить одну клеточных делений у мышей E8.5 нейроэпителия

Аннотация

Мы разработали систему, которая интегрирует живых изображений флуоресцентных маркеров и культивирования эмбриональных ломтиками нейроэпителия мыши. Мы воспользовались существующими линиями мышей клетки для генетической отслеживания клонов: тамоксифен индуцируемых Cre и линии репортер экспрессирующих Cre DsRed на Cre-опосредованной рекомбинации. Используя относительно низкий уровень тамоксифен, мы были способны индуцировать рекомбинации в небольшое число клеток, что позволяет нам следовать отдельных клеточных делений. Кроме того, мы наблюдали транскрипционный ответ на Еж Соник (Тсс) сигнализации использованием Olig2-EGFP трансгенной линии 1-3 и мы провели мониторинг формирования ресничек путем заражения культурный срез с вирусом выражающие реснички маркером, Sstr3-GFP 4. Для того, чтобы изображение нейроэпителии, мы собрали эмбрионов на E8.5, изолированный нервной трубки, смонтированные нейронных ломтик в надлежащих условиях культивирования в изображения камеры и выполнена покадровой конфокальной микроскопии. Наши бывшиеестественных изображений живых метод позволяет проследить одну клеточных делений оценить относительные сроки формирования первичной реснички и Тсс ответ в физиологически соответствующие образом. Этот способ может быть легко адаптирован использованием различных флуоресцентных маркеров и обеспечивает поле инструментами для контроля поведения клеток на месте и в режиме реального времени.

протокол

Взрослых мышей усыпляют механические смещения шейных позвонков. Все животные процедуры были одобрены IACUC и комитета по биобезопасности в университете Эмори.

1. Эмбрион поколения

  1. Крест тамоксифен индуцируемых Cre линии, CAGGCreER и dsRedCre репортер линии (Tg (CAG-BGEO,-DsRed * MST) 1Nagy) (рис. 1) 5,6. Для контроля относительной синхронизации Тсс ответ в дочерние клетки, поперечного и CAGGCreER DsRed соответствии с Olig2-EGFP BAC трансгенных мышей (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (рис. 1) 7,8.
  2. Растворить тамоксифен в 100% этаноле, а также выполнять внутрибрюшинной инъекции 2,5 мг тамоксифена на 40 г веса тела в беременных самок в эмбриональных 6,5 (E6.5), чтобы вызвать Cre экспрессии и DsRed маркировки в небольшой части клеток.
  3. 48 час спустя рассекают эмбрионов, выявить положительные DsRed эмбрионов с использованием флуоресцентного микроскопа, перенесите их в чашку с культурой и наблюдаемыеэлектронной одного клеточного деления во время бывших естественных изображений (см. ниже).

2. Всего культуры эмбрионов мыши

  1. Рассеките E8.5 эмбрионов в предварительно нагретой среде, содержащей стирки DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% сыворотки новорожденного теленка и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) 9.
  2. Сразу после вскрытия, место эмбрионов на 37 ° C стадии нагревания под флуоресцентным микроскопом и определить как GFP и / или DsRed положительный (см. ниже).
  3. Передача до 2 эмбрионов в 500 мкл каплей, предварительно уравновешенную культуральной среде, содержащей 50% сыворотки крыс от Sprague-Dawley мужских и 50% DMEM/F12 (1:1) без фенолового красного дополнены L-глутамина и 1% 1 М HEPES в 0,85% NaCl и P / S 9.
  4. Наносится тонким слоем (0,1 см) уравновешенной светлых нефтепродуктов в среднесрочной для предотвращения испарения и передачи культуры блюдо с эмбрионами на 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.

3.Вирусные инфекции

  1. Для того, чтобы этикетка реснички в нейроэпителии, добавляют 5-10 мкл Sstr3-GFP лентивирусов, примерно 2000000 вирионов в 500 мкл уравновешенной капли культуральной среде, содержащей E8.5 эмбрионов.
  2. Через 18 часов культуры, передачи инфицированной эмбриона в несколько капель Воша, чтобы смыть вирусы и подготовить нейронных кусочек трубки.

4. Нейронные Подготовка Slice труб для живых изображений

  1. Рассеките нервной трубки из E8.5 эмбрионов в предварительно нагретом стирки среды с использованием микро-нож размером 0,025 мм, на 1% агара покрытием чашке.
  2. Поместите изолированной нервной трубки вентральной стороной вниз в 150 мкл каплю уравновешенной культуральной среде без фенола красного на 35 мм поли-L-лизин покрытием блюдо со стеклянным дном.
  3. Положите небольшое количество смеси 1:1 изготовлены из 100% чистого вазелина и расплавленный воск свечи (свечи от IKEA) вокруг нервной трубки установлены, и плавно нажмите узким кусок стекла покровные для того, чтобыиммобилизации образца.
  4. Накройте блюдо с тонким слоем (~ 0,1 см) уравновешенной светлых нефтепродуктов (рис. 2).

5. Живая съемка и покадровой конфокальной микроскопии

  1. Место блюдо под Nikon A1R лазерной сканирующей конфокальной Перевернутый Микроскоп оснащен климатической камеры, регулирующий температуру, установить до 37 ° С и 5% СО 2.
  2. Используйте 60x нефтью погружения цели записывать GFP помечены ресничек и DsRed положительных клеток, в то время как 40-кратный нефтью погружения цели использовать для мониторинга Olig2-GFP и DsRed положительных клеток.
  3. Открытое программное обеспечение NIS Elements, чтобы установить максимально допустимое время условия покадровой съемки. Каждые 10 мин приобретать г-стеки до 25 мкм с шагом 1,5 мкм (40x цель) и до 8 мкм с шагом 0,4 мкм (60x цель). Использование 488 и 561 нм длин волн возбуждения и передаваемый канал, если необходимо. Получение изображений в 512 х 512 размер. Настройка нескольких пользовательских регионах ИНТересть одновременно выполнять запись.
    Оптимальная экспозиция для питания лазера и яркость изображения была скорректирована за счет использования низкой интенсивности лазера (до 11% для mCherry 561, до 4,5% EGFP 405/488), скорость сканирования 1, строка 2 средних и размер отверстия штыря (61 мкм для DsRed; 28,1 мкм для Olig2; 72 мкм для SSTR3GFP; 61,3 мкм для DsRed и SSTR3GFP; 58 мкм для DsRed и Olig2). Использование генетически кодируемых флуоресцентные журналистам позволило выявить яркость с низким энергопотреблением лазера.
  4. Анализ записанных данных с помощью 3D-реконструкции Imaris программного обеспечения.

6. Иммунофлюоресценция

  1. Исправить эмбрионов или изолированных труб в нейронных 4% параформальдегиде / 0,1 М фосфатного буфера на льду (4 ° С) в течение 1 часа в стеклянной посуде.
  2. Вымойте образцов 2 ч в PBS на льду (4 ° С) (изменить PBS несколько раз) и положить в 30% сахарозы / 0,1 М фосфатного буфера в течение ночи или до раковины эмбрионов.
  3. Вставить в ОСТ, замораживание на сухом льду и хранят в -80 ° С. Perform срезов на криостат (10 мм).
  4. Мытье слайдов в течение 10 мин в промывном растворе, содержащем 1% инактивированной нагреванием сыворотки овец и 0,1% Тритон Х-100 в PBS.
  5. Развести первичных антител в промывочного раствора в следующих концентрациях: крысиных моноклональных анти-RFP (5F8,) 1:200; Кролик анти-Arl13b сыворотки 1:1500 и моноклональных антител мыши Arl13b 1:5 (295B/54); Кролик анти-Olig2 1:300; мышиных моноклональных антител Рах6, тсс и все-Nkx2.2 1:10, и кроличьи поликлональные Ki67 1:500. Добавить около 150 мкл на слайде в плоских влажной камере, залить парафином, чтобы избежать высыхания и оставить на ночь при 4 ° C.
  6. Мытье слайдов в промывочный раствор три раза, 20 мин каждый раз при комнатной температуре.
  7. Развести вторичными антителами Alexa Fluor 488, 568, 350 в моющих растворов в концентрации 1:200. Используйте Hoechst 1:3000 или TO-PRO-3 1:500 для окрашивания ядер. Добавить 150 мкл на слайде, оставьте 1 часа при комнатной температуре во влажной камере защищенном от света месте.
  8. Вымойте слайдов в промывочного раствора TWо раз, 30 мин каждый раз при комнатной температуре.
  9. Горы скользит в 80% продлить Золотая анти-исчезать реагента и вида в пределах 24 часов.

Результаты

Здесь мы провели бывших естественных живых изображений одного клеточного деления в E8.5 нейроэпителия мыши. Маркировать отдельные клетки, мы индуцированных Cre рекомбиназу в субпопуляции клеток, содержащих линии Cre репортера, которые выразили DsRed при рекомбинации 5,6 (рис. 3?...

Обсуждение

Наши бывшие естественных условиях система дает нам возможность непосредственно наблюдать одну клеточных делений в развивающемся нейроэпителия в реальном времени. В качестве примера мы рассмотрели клеточные деления в мышиных эмбриональных нервной трубки и контролируется либо ?...

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов объявлены.

Благодарности

Этот исследовательский проект был поддержан Дополнение ARRA, 5 R01 NS056380. Дополнительная поддержка была оказана в рамках основной вирусный вектор и микроскопии Ядро Эмори Neuroscience NINDS Основные средства гранта, P30NS055077. Мы благодарим Эмори трансгенных мышей и генного таргетинга для получения основной линии мышей от GENSAT; Грег Pazour для стабильного SSTR3-GFP IMCD3 клеточной линии, и Брэдли Yoder для Sstr3-GFP лентивирусный построить. Моноклональные антитела были получены из исследований развития гибридом банка, разработанный под эгидой NICHD, и поддерживается Университет Айовы, Отделение биологических наук, Iowa City, IA 52242. Все животные процедуры были одобрены IACUC и комитета по биобезопасности в университете Эмори.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/JJackson Laboratory005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/MmcdMMRRC,010555-UCD
CAGGCreERJackson Laboratory003724
TamoxifenSigmaT5648
DMEM/F12 (1:1)GIBCO21041-025
Newborn calf serumLonza14-416F
Penicillin/StreptomycinInvitrogen15140-122
Rat Serum SD maleHarlan Bioproducts4520
1M HepesBioWhittaker17-737E
L-GlutamineGIBCO21041-025
Light mineral oil SigmaM8410
Sstr3-GFP lentivirus Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm Electron Microscopy Sciences62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dishMatTekP35GC-0-10-C
100% Petroleum JellyKrogerFL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted MicroscopeNikon
NIS Elements softwareNikon
Imaris 3D softwareBitplane AGImaris 7.2.3
OCTTissue-Tek4583
CryostatLeicaCM1850
Heat-inactivated sheep serumInvitrogen16210-072
Triton X-100Fisher ScientificBP151
ParafolmaldehydeSigmaP6148
Phosphate BufferLab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8) Chromotek110411
Rabbit anti-Arl13b serumNeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5NeuroMab
Rabbit anti-Olig2ChemiconAB9610
Mouse monoclonals Pax6Developmental Hybridoma BankPax6
Mouse monoclonalsShhDevelopmental Hybridoma Bank5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2Developmental Hybridoma Bank74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67AbcamAB15580
Alexa Fluor 488Molecular ProbesA11029
Alexa Fluor 568Molecular ProbesA11031
Alexa Fluor 350Molecular ProbesA11046
H–chstFisherAC22989
TO-PRO-3InvitrogenT3605
ProLong Gold anti-fade reagentInvitrogenP36934

Ссылки

  1. Yamada, T., Pfaff, S. L., Edlund, T., Jessell, T. M. Control of cell pattern in the neural tube: motor neuron induction by diffusible factors from notochord and floor plate. Cell. 73, 673-686 (1993).
  2. Ericson, J., Muhr, J., Placzek, M., Lints, T., Jessell, T. M., Edlund, T. Sonic hedgehog induces the differentiation of ventral forebrain neurons: A common signal for ventral patterning within the neural tube. Cell. 81, 747-756 (1995).
  3. Briscoe, J. A. Homeodomain Protein Code Specifies Progenitor Cell Identity and Neuronal Fate in the Ventral Neural Tube. Cell. 101, 435-445 (2000).
  4. Berbari, N. F., Johnson, A. D., Lewis, J. S., Askwith, C. C., Mykytyn, K. Identification of ciliary localization sequences within the third intracellular loop of G protein-coupled receptors. Mol. Biol. Cell. 19 (4), 1540-1547 (2008).
  5. Vintersten, K. Mouse in red: red fluorescent protein expression in mouse ES cells, embryos, and adult animals. Genesis. 40 (4), 241-246 (2004).
  6. Hayashi, S., McMahon, A. P. Efficient recombination in diverse tissue by a tamoxifen-inducible form of Cre: a tool for temporally regulated gene activation/inactivation in the mouse. Dev. Biol. 244 (2), 305-318 (2002).
  7. Gong, S., Zheng, C., Doughty, M. L., Losos, K., Didkovsky, N., Schambra, U. B., Nowak, N. J., Joyner, A., Leblanc, G., Hatten, M. E., Heintz, N. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425 (6961), 917-925 (2003).
  8. Mukouyama, Y. S., Deneen, B., Lukaszewicz, A., Novitch, B. G., Wichterle, H., Jessell, T. M., Anderson, D. J. Olig2+ neuroepithelial motoneuron progenitors are not multipotent stem cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (5), 1551-1556 (2006).
  9. Jones, E. A. V., Crotty, D., Kulesa, P. M., Waters, C. W., Baron, M. H., Fraser, S. E., Dickinson, M. E. Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
  10. Piotrowska-Nitsche, K., Caspary, T. Live imaging of individual cell divisions in mouse neuroepithelium shows asymmetry in cilium formation and Sonic hedgehog response. Cilia. 1 (6), (2012).
  11. Nowotschin, S., Ferrer-Vaquer, A., Hadjantonakis, A. -. K. Imaging mouse development with confocal time-lapse microscopy. Methods in Enzymology. 476, 351-377 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience74

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены