Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Özet

Burada için gerekli araçları geliştirmek Ex vivo Canlı görüntüleme fare E8.5 neuroepithelium tek hücre bölünmeleri izlemek için

Özet

Biz floresan işaretleri ve embriyonik fare neuroepithelium kültür dilim canlı görüntüleme entegre bir sistem geliştirdi. Biz izleme soy genetik hücre için mevcut fare hatları yararlandı: Bir Tamoksifen-indüklenebilir Cre hattı ve Cre-aracılı rekombinasyon üzerine dsRed ifade eden bir Cre muhabir hattı. Tamoksifen nispeten düşük düzeyde kullanarak, bize tek tek hücre bölünmeleri takip etmek izin, hücrelerin az sayıda rekombinasyon neden başardık. Ayrıca, bir Olig2-eGFP transgenik çizgi ^1-3 kullanarak Sonic Hedgehog (Sus) sinyal için transkripsiyonel yanıt gözlenen ve kirpikler işaretleyici, Sstr3-GFP ⁴ ifade virüs kültürlü dilim nüfuz ederek kirpikler oluşumu izlenir. Görüntü için neuroepithelium, biz nöral tüp izole, E8.5 embriyolar hasat, görüntüleme odasına uygun kültür koşullarında sinir dilim monte ve zaman atlamalı konfokal görüntüleme yapılır. Bizim eskiin vivo canlı görüntüleme yöntemi bize fizyolojik ilgili bir şekilde birincil kirpikler oluşumu ve Sus cevap göreli zamanlama değerlendirmek için tek bir hücre bölünmeleri izlemek için sağlar. Bu yöntem, kolayca farklı floresan işaretleri kullanarak adapte ve alanında yerinde ve gerçek zamanlı olarak hücre davranışlarını izlemek için hangi ile araçları sağlar olabilir.

Protokol

Yetişkin fareler, mekanik servikal dislokasyon tarafından ötenazi. Tüm hayvan prosedürleri IACUC ve Emory Üniversitesi Biyogüvenlik Komitesi tarafından kabul edildi.

1. Embriyo Üretimi

1. Çapraz Tamoksifen-indüklenebilir Cre çizgi, CAGGCreER ve dsRedCre muhabiri hattı (Tg (CAG-Bgeo,-DsRed * MST) 1Nagy) (Şekil 1) ^5,6. Kızı hücreler, çapraz CAGGCreER ve Olig2-eGFP BAC transgenik farelerin (Tg (Olig2-EGFP) EK23Gsat) (Şekil 1) ^7,8 ile DsRed doğrultusunda Sus yanıt göreli zamanlama izlemek için.
2. % 100 etanol tamoksifen çözülür ve Cre ifade ve hücrelerin bir kısmında DsRed etiketleme ikna etmek için embriyonik 6.5 (E6.5) hamile kadın içine vücut ağırlığı 40 g başına 2.5 mg tamoksifen intraperitoneal gerçekleştirin.
3. 48 saat sonra, embriyolar incelemek floresan mikroskop kullanılarak DsRed olumlu embriyolar tespit, kültür çanak aktarmak ve gözlemlerEx vivo görüntüleme sırasında E tek hücre bölünmesi (aşağıya bakınız).

2. Tüm Fare Embriyo Kültürü

1. % 10 yeni doğmuş buzağı serumu ve% 1 Penisilin / Streptomisin (P / S) ⁹ ile desteklenmiş DMEM/F12 (1:1) içeren, önceden ısıtılmış yıkama ortamı içinde E8.5 embriyolar incelemek.
2. Doğrudan floresan mikroskop altında 37 ° C ısıtma sahnede diseksiyonu, yer embriyo sonra GFP ve / veya DsRed pozitif (bkz. aşağıda) olarak tanımlar.
3. Sonra bir L-glutamin ile takviye edilmiş fenol kırmızısı olmadan en az% 50 bir erkek Sprague-Dawley sıçan alınan serum ve% 50 DMEM/F12 (1:1) ihtiva eden önceden-dengelenmiş kültür ortamı 500 ul damla ve% 1 içine 2 embriyolar kadar veri transferi 0.85% NaCl ve P / S ⁹ 1 M HEPES.
4. Buharlaşmasını önlemek ve kültür kabına 37 ° C,% 5 _CO2 inkübatör embriyolar içeren transfer ortamı üzerinden dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (0,1 cm) uygulanır.

3.Viral Enfeksiyon

1. Nöroepitelyumda etiket kirpikler amacıyla, bir E8.5 embriyo içeren kültür ortamı içinde bir 500 ul dengelenmiş bir düşüş Sstr3-GFP lentivirüs 5-10 ul, yaklaşık 2.000.000 virionlar ekleyin.
2. Kültür 18 saat sonra, virüs yıkayın ve nöral tüp dilim hazırlamak için yıkama orta birkaç damla içine enfekte embriyo transferi.

4. Canlı Görüntüleme Nöral Tüp Dilim Hazırlık

1. % 1 agar kaplı çanak, bir mikro-bıçak boyutu 0.025 mm kullanarak önceden ısıtılmış yıkama ortamda E8.5 embriyo nöral tüp parçalara ayır.
2. 35 mm poli-L-lisin kaplı cam alt çanak fenol kırmızısı olmadan dengelenmiş kültür ortamı bir 150 ul damla izole nöral tüp ventral yüzü aşağı yerleştirin.
3. Için cam lamel dar bir parça% 100 saf vazelin ve monte nöral tüp etrafında erimiş mum (IKEA mum), ve hafifçe basın yapılmış 1:1 karışımının az miktarda koyunörnek hareketsiz.
4. Dengelenmiş hafif mineral yağ ince bir tabaka (~ 0.1 cm) (Şekil 2) ile çanak Kapak.

5. Görüntüleme ve Time-lapse Konfokal Mikroskop Canlı

1. Sıcaklık düzenleyen bir çevre odası ile donatılmıştır Konfokal Ters Mikroskop Tarama Nikon A1R Lazer altında yer çanak, 37 ayarlı ° C ve% 5 CO _2.
2. 40x yağ immersiyon objektif kullanımı Olig2-GFP ve DsRed pozitif hücreler izlemek için ise, GFP etiketli kirpikler ve DsRed pozitif hücreler kaydetmek için 60x yağ immersiyon objektif kullanın.
3. Zaman atlamalı görüntüleme koşulları kurmak için NIS Elements yazılımı açın. Her 10 dakika 1.5 mikron (40x objektif) ve 0.4 mikron (60x objektif) bir aralığı ile en fazla 8 mikron bir aralığı ile z-yığınları 25 mikron kadar kazanır. Gerekirse 488 ve 561 nm uyarma dalga boyları ve iletilen kanal kullanın. 512 x 512 boyutunda görüntüler elde. Int birden fazla kullanıcı tanımlı bölgeler kurmakerest aynı anda kayıt yapmak için.
   , Tarama hızı 1, çizgi ortalama 2 ve iğne deliği boyutu (61, görüntünün lazer gücü ve parlaklık için en iyi poz kullanımı düşük lazer yoğunluğu (4.5 kadar% EGFP 405/488 mCherry 561 için en fazla 11%) tarafından ayarlandı DsRed için mikron; Olig2 için 28.1 mikron, SSTR3GFP için 72 mikron, DsRed ve SSTR3GFP için 61.3 mikron, DsRed ve Olig2 için 58 mikron). Genetik olarak kodlanmış floresan gazetecilere kullanımı bize düşük lazer gücü ile parlaklık tespit sağladı.
4. Imaris 3D rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak kaydedilen verileri analiz.

6. İmmünofloresan

1. Bir cam tabak içinde 1 saat boyunca buz üzerinde% 4 paraformaldehid / 0.1 M fosfat tampon (4 ° C) içinde izole edilmiş embriyolar ya da nöral tüp düzeltildi.
2. Örnekler buz üzerinde PBS 2 saat (4 ° C) (değiştir PBS birkaç kez) ve gece boyunca ya da embriyoların lavabo kadar% 30 sakaroz / 0.1 M Fosfat Tampon koymak yıkayın.
3. -80 Kuru buz ve mağaza ° C üzerinde, OCT dondurma Embed Pkriyostat (10 mm) üzerinde kesit erform.
4. % 1 ısı ile inaktive edilmiş koyun serumu ihtiva eden yıkama çözeltisi içinde 10 dakika karıştırıldı ve PBS içinde% 0.1 Triton X-100 için slayt yıkayın.
5. Konsantrasyonlarda takip de yıkama çözeltisi içinde primer antikorlar inceltilir Rat monoklonal anti-RFP (5F8,) 1:200; Tavşan anti-Arl13b serum 1:1500 ve fare monoklonal anti-Arl13b 01:05 (295B/54); Tavşan anti-Olig2 1:300; Fare monoklonal Pax6, Şşş ve Nkx2.2-tüm 01:10 ve Ki67 1:500 poliklonal Tavşan. Düz nemlendirilmiş bir odasında slayt başına 150 ul yaklaşık ekle, kurumasını önlemek ve 4 gece boyunca terk ° C'ye parafilm kapağı
6. Üç kez, 20 dakika, her zaman oda sıcaklığında yıkama çözeltisi içinde slaytlar yıkayın.
7. 1:200 konsantrasyonda yıkama çözümleri sekonder antikor Alexa Fluor 488, 568, 350 sulandırmak. Çekirdekleri leke Hoechst 1:3,000 veya TO-PRO-3 1:500 kullanın. Slayt başına 150 ul, ışıktan koruyarak, nemlendirilmiş bir odasında, oda sıcaklığında 1 saat bekletin.
8. Yıkama solüsyonu tw slaytlar yıkayıno zaman, oda sıcaklığında 30 dakika, her zaman.
9. Dağı 24 saat içinde Altın anti-solmaya reaktif ve görünüm uzatmak% 80 kayar.

Sonuçlar

Burada E8.5 fare neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri ex vivo canlı görüntüleme yapılır. Tek tek hücrelerin etiketlemek için, rekombinasyon ^5,6 (Şekil 3A) üzerine dsRed dile bir Cre muhabir satır içeren bir hücre alt grubunda Cre recombinase bağlı. Böylece, 48 saat sonra biz ex vivo görüntüleme (Şekil 4A-D) sırasında tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek mümkün. ^1-3; etiketli hücreleri BAC transgenik Ol...

Tartışmalar

Bizim ex vivo sistem bize doğrudan gerçek zamanlı olarak gelişmekte neuroepithelium içinde tek bir hücre bölünmeleri gözlemlemek sağlar. Örnek olarak fare embriyonik nöral tüp içinde hücre bölünmeleri incelenmiş ve kirpik oluşumu veya Sus yanıt ya izlenir. Biz teknik fizyolojik ilgili verileri sağlar gösteren sabit bölümleri (n = 178) sonuçları ile uyumlu idi bizim görüntüleme sonuçları (n = 24) doğruladı.

Bizim teknik tamoksifen do...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Z/RED line (STOCK Tg(CAG-Bgeo,-DsRed*MST)1Nagy/J	Jackson Laboratory	005438
Olig2-eGFP line (STOCK Tg(Olig2-EGFP)EK23Gsat/Mmcd	MMRRC,	010555-UCD
CAGGCreER	Jackson Laboratory	003724
Tamoxifen	Sigma	T5648
DMEM/F12 (1:1)	GIBCO	21041-025
Newborn calf serum	Lonza	14-416F
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Rat Serum SD male	Harlan Bioproducts	4520
1M Hepes	BioWhittaker	17-737E
L-Glutamine	GIBCO	21041-025
Light mineral oil	Sigma	M8410
Sstr3-GFP lentivirus	Emory Viral Core
Micro-knife, size 0.025 mm	Electron Microscopy Sciences	62091
35 mm poly-L-lysine coated glass bottom dish	MatTek	P35GC-0-10-C
100% Petroleum Jelly	Kroger	FL9958c
A1R Laser Scanning Confocal Inverted Microscope	Nikon
NIS Elements software	Nikon
Imaris 3D software	Bitplane AG	Imaris 7.2.3
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Heat-inactivated sheep serum	Invitrogen	16210-072
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151
Parafolmaldehyde	Sigma	P6148
Phosphate Buffer	Lab made
Rat monoclonal anti-RFP (5F8)	Chromotek	110411
Rabbit anti-Arl13b serum	NeuroMab
mouse monoclonal anti-Arl13b 1:5	NeuroMab
Rabbit anti-Olig2	Chemicon	AB9610
Mouse monoclonals Pax6	Developmental Hybridoma Bank	Pax6
Mouse monoclonalsShh	Developmental Hybridoma Bank	5E1
Mouse monoclonals Nkx2.2	Developmental Hybridoma Bank	74.5A5
Rabbit polyclonal Ki67	Abcam	AB15580
Alexa Fluor 488	Molecular Probes	A11029
Alexa Fluor 568	Molecular Probes	A11031
Alexa Fluor 350	Molecular Probes	A11046
H–chst	Fisher	AC22989
TO-PRO-3	Invitrogen	T3605
ProLong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36934