はSiO：フォトリソグラフィによって画定されたパリレン-C上の細胞のパターニング<sub&gt; 2</sub&gt;基板

要約

このプロトコルは、SiO ₂のセルパターニングのための微細加工と互換性のある方法を記載している。事前に定義されたパリレン-Cの設計は、フォトリソグラフィによってSiO ₂のウェハ上に印刷されています。血清（または他の活性化溶液）とのインキュベーション後の細胞を特異的に接着し（との適合性に応じて成長する）はSiO ₂領域によって撃退されながら、基礎となるパリレン-C、。

要約

セルパターニングプラットフォームは、このような事前定義されたin vitroでの神経細胞のネットワークの構築および細胞生理学の一定の中央側面の探査など幅広い研究目標をサポートしています。簡単に多電極アレイ（MEAの）との細胞のパターニングを組み合わせることや技術のシリコンベースの「チップ上の実験室」は、微細加工と互換性のあるプロトコルが必要となります。我々は、SiO ₂ウエハ上のポリマーパリレン-Cの堆積を利用する方法を記載している。フォトリソグラフィは、ミクロンレベルの解像度でパリレン-Cの正確で信頼性の高いパターン形成を可能にします。ウシ胎児血清（または他の特異的活性化溶液）に浸漬することによりその後の活性化培養細胞に付着するか、またはそれぞれパリレンまたはSiO ₂領域によって反発された基板が得られる。この技術は、初代マウス海馬細胞、HEK 293細胞株、ヒト神経様奇形癌を含む細胞型（広い範囲のパターニング可能にした細胞株、初代マウス小脳顆粒細胞、および初代ヒト神経膠腫由来の幹細胞様の細胞）。しかしながら、興味深いことに、プラットフォームは、普遍的ではないであり;細胞特異的接着分子の重要性を反映している。この細胞パターニング工程は、信頼できる費用効果的であり、重要なマイクロエレクト​​ロニクス技術の統合のための道を開き、標準的な微細加工（チップ製造）プロトコルに組み込むことができる。

概要

合成材料に細胞接着やパターニングを決定メカニズムを理解することは、組織工学、創薬、およびバイオセンサー^1-3の製作などのアプリケーションのために重要である。多くの技術が利用可能であり、進化している、細胞接着に影響を与える無数の生物化学的、​​および物理的因子の各々を活かし。

ここでは、最初にマイクロエレクト​​ロニクス製造のために開発されたプロセスを利用した細胞パターニング技術を記載している。このように、プラットフォームは、パターン化プラットフォームに、このような多国間環境協定のような超小型電子技術の下流の統合を可能にするためによく置かれている。

細胞膜と隣接する材料との間のインターフェースは、双方向かつ複雑である。 インビボにおいて 、細胞外マトリックスタンパク質は、構造及び強度と細胞接着受容体との相互作用を介して細胞挙動に影響を与える。 Vにおいても同様に、細胞物理化学的な影響にも接着力を調節しながらitroタンパク質⁴の吸収された層を介して合成基質と相互作用します。例えば、ポリマー表面は、イオンや紫外線照射、または酸もしくは水酸化⁵での処理によるエッチングによって（親水性）以上の「湿潤性」にすることができる。細胞パターニングのための確立された方法は、これらおよび他の細胞接着メディエーターを利用する。例としては、インクジェット^6を印刷、マイクロ^{7スタンピング} 、物理的な固定化^8、マイクロフルイディクス^9、リアルタイムの操作^10、および選択的な分子集合体のパターニング^{（SMAP）11が}含まれ^ています。それぞれが特定の利点と制限があります。我々の仕事で重要なドライバは、しかし、微小電気機械システム（MEMS）を用いて細胞のパターン化を統合することです。

MEMSは、電気で駆動さ非常に小さい機械装置を参照してください。これは、ナノスケールの当量nanoelectromechに重なっanicalシステム。この概念は、半導体戦略はマイクロスケールで行われるように製作を可能にした場合にのみ実用的になりました。半導体エレクトロニクスのために独自に開発した微細加工技術が誤って、例えば、セルラ電気生理学など、他の用途に有用であることが見出された。重要な下流の目的は、（バイオMEMSデバイスを形成する）高忠実度セルパターニングプロセスでそのようなマイクロエレクト​​ロニクス技術を組み合わせることである。いくつかの既存の、そうでなければ、信頼性の高い実用的な細胞パターニング技術は、この考え方と互換性がありません。例えば、任意の埋め込まれたマイクロエレクト​​ロニクスやバイオセンサーの正確な位置合わせは、それらの有効性の基本であるが、このようなマイクロスタンピングのような技術を用いて達成することは極めて困難である。

この問題を回避するために、我々はフォトリソグラフィで印刷されたパリレン-Cを使用していますSiO ₂系のパターン形成のプラットフォームに取り組んでいます。フォトリソグラフィは、からの幾何学的特徴の移動を含むUV照射を介して基板にマスク。マスクは、適切なコンピュータ支援設計プログラムを用いて設計される。ガラス板の際に、不透明なクロムの薄層は、所望の幾何学的パターンを（1-2程度の特徴の解像度が可能である）を表す。パターン形成される基板は、フォトレジストの薄層（UV感受性ポリマー）でコーティングされている。コー​​ティングされたポリマーは、その後、位置合わせされたマスクに密着する。 UV源は、非保護領域が照射されるように適用され、従って背後にマスクパターンのパリレン-C表現を残して、次の現像工程で可溶性およびリムーバブルなっている。このプロセスは、半導体デバイスの開発時に始まった。このように、シリコンウェーハは、しばしば、基板として使用される。 SiO ₂上パリレン-Cのフォトリソグラフィ堆積は、それゆえ、日常のマイクロエレクトロニクスクリーンルーム施設内で ​​行われる簡単で信頼性の高いプロセスである。

パリレンはきたが（非生分解性、化学的に不活性な）いくつかの望ましい生体工学特性、細胞のパターニングでの直接の使用を制限する要因は、その極度の疎水性に一部起因し、その本質的に貧弱な細胞接着性である。それにもかかわらず、パリレン-Cは、以前に剥ぎ取りセルラ鋳型^12,13として、例えば、細胞パターン形成のために間接的に使用されている。このアプローチは、貧しい人々の解像度によって制限され、複数の手順を必要としている。代わりに、ここで説明する処理は、そのパリレン-Cの領域を確保するために、血清のインキュベーションに続いて、酸エッチングステップを利用する疎水性の減少および血清タンパク質結合の組み合わせを介して、細胞接着になる。

最終結果は、生物学的活性化後に、それぞれのインサイト、接着剤またはインサイト反発特性を発揮し、従って有効な細胞パターニングプラットフォームを表し、二つの異なる基材からなる構築物である。重要なことに、生物学的AGを導入する必要はない（これらは、ウシ胎児血清または他の活性化溶液を用いて活性化されるところ）パターン化された基質としてクリーンルーム設備にエントは、使用前に無期限に保存することができる。

製造プロセスは、非常に密接に超小型電子製造に使用されているものを鏡として、このparylene-C/SiO ₂パターン化プラットフォームは、そのためのMEMS構成要素との連立のための良い候補である。

プロトコル

1。 SiO ₂上パリレンパターンの作製：プロセスフロー（図1を参照してください）

1. デザインは、CIF（カリフォルニア工科中間形式）またはGDS-II（グラフィックデータベースシステム-II）ファイルの書き込み/読み込みが可能なレイアウトエディタソフトウェアパッケージを使用して、パリレン-Cの設定を希望する。 CIFとGDS-IIは、集積回路のアートワークのレイアウトのための業界標準のファイル形式です。
2. 手数料フォトマスクは、適切なマイクロエレクト​​ロニクス施設に製造、または施設が存在する場合、社内で行う。
3. 200nmのSiO ₂層（小さ ​​なスポットの分光反射率と厚さを確認する）を生成するために40分間950℃で大気圧の水平炉（H ₂ 1.88 SLMとO ₂ 1.25 SLM）のシリコンウェーハを酸化する。
4. 素数シラン接着促進剤で酸化されたウエハ。今具体的にパリレンを堆積させるために設計された真空蒸着装置を用いて、二量体の1.298Å/ミリグラムの速度で22℃、パリレン-Cを堆積させる。 100膜厚パリレン-C被膜は、以下に示す全ての実施例に使用した。
5. 好適なフォトレジストコーティングシステムを用いて、パリレンコーティングされたウェハ上の次のデポジットヘキサメチルジシラザン（HMDS）接着促進剤。
6. 今陽性上記と同じフォトレジストコーティングシステムを用いて、（1μmの理論的な厚さをもたらす）、フォトレジストを塗布しながら、30秒間、4000rpmでスピンウェハ。
7. ソフト90℃で60秒間ウェハを焼く
8. マスクアライナにウェハと予め製造フォトマスクの両方を挿入します。
9. 希望のパリレン-C構成の紫外線ネガティブ表現とフォトレジストでコーティングされたウェハを公開します。
10. 110℃で60秒間露光したウエハを焼く
11. すべての露出フォトレジストの適切な現像液で現像することによってウエハからを削除します。
12. 保護されていないパリレンをエッチング除去。 50ミリトールのチャンバ圧で酸素プラズマエッチングシステム（49 SCCMのO _2、13.56MHzの100WのRFパワー、を使用下地SiO _2を明らかに100Å/分）のエッチング速度。
13. 適切なダイシングソー（スピンドル回転数30000rpmで、送り速度7ミリメートル/秒）を用いてウェハをダイシング。
14. 脱イオンH ₂ O中のチップをすすぎ、窒素で乾燥吹く。
15. 埃箱に保管してチップ（無期限）が必要になるまで。

2。チップ洗浄と活性化：プロトコル

1. 10秒間アセトンに洗浄することにより、チップからの残留フォトレジストを除去。
2. 脱イオン蒸留H ₂ Oの3倍にすすいでください。
3. 新鮮ピラニア酸（午前5時03分30％過酸化水素の比および98％硫酸）を構成する。
   注意：細心の注意を払ってピラニア酸を準備します。それは、非常に強力な酸化剤である強酸性であり、および硫酸と過酸化水素水とを混合して発熱反応である。酸ドラフト内で、この段階を実行します。 2分ピラニア酸を混合した後に通過させますが、20分以内に使用しています。
4. PIに浸漬することにより、クリーンでエッチチップ10分間ranha酸。
5. すすぎのチップは、脱イオンH ₂ Oで3倍と無菌培養皿に移す。
6. ここでセルパターニングのためのチップをアクティブにします。例えば、6ウェルプレートにウェル当たり2つのチップを追加し、完全にすべてのチップを浸漬するように、次いで、ウシ胎児血清2 mlを加える。層流の組織培養フード内で無菌条件下でこれと、後続のすべての細胞培養段階を実行する。
7. 37℃で3月12日時間にわたって血清中のチップをインキュベート
   注：ステップ2.4​​から2.7に順次ステップ間の遅延なく実行する必要があります。血清活性化はピラニア·治療後≥24時間遅れで表示されている場合は、細胞のパターニングをSiO ₂地域から低下による細胞の反発に損なわれている。
   特定の細胞接着タンパク質を含む代替的な活性化溶液は、ウシ胎児血清の代わりに使用することができる。このようなソリューションは、（例えば代表的な結果を参照してください）​​2対照的な基質の細胞接着特性を変更。

3。オンチップメッキ細胞株：プロトコル

1. それらの活性化溶液からチップを取り外し、ハンクス液で10秒間に一度洗う。
2. 培養ウェルにチップを置き、その通常の増殖培地中の懸濁液として選択された細胞型プレート。最適な細胞播種密度は、細胞型及びオンチップパリレン-Cの幾何学的パターンの両方に依存する。 5×10 ⁴細胞/ mlの密度は、賢明な出発点である。
3. イメージングは​​、細胞パターニングのための基礎となる動機に合わせて調整されるが、生細胞の挙動を容易に適切なリレーレンズとの解剖顕微鏡およびデジタルカメラを用いて評価することができる。

結果

パリレン-CのSiO _2をパターニングするフォトリソグラフィプロセスを図1に示されている。一旦調製し、ウシ胎児血清中のチップの活性化は、培養物中にパターン形成される細胞型の広い範囲を可能にする。我々のグループは正常に初代マウス海馬細胞^{14〜16、HEK293}細胞株^17、人間の神経様奇形（HNT）細胞株^18、初代マウス小脳顆粒細胞、および初代ヒト神経膠腫由来の幹細胞様細胞をパターン化している。

図3は、「十字線」の拡張子を持つ円形のノードからなるパリレンパターン上のHEK293細胞の頑強なパターニングを示している。本例のチップ活性化ウシ胎児血清であった。対照的に、 図4は、代替の活性化溶液を用いてパターニングプラットフォームを増強する可能性を示している。ウシ血清アルブミン（3 mg / ml）での溶液を用いて HBSS中フィブロネクチン（1μg/ ml）を、前のパターン化教訓が反転している。

図5は、異なる細胞型（高悪性度神経膠腫由来の初代ヒト由来幹様細胞株）を示している。 図4Bおよび4Cに示すように、ここでは、 図4Aに示すパターンは、薄いパリレン-Cに沿って細胞プロセスの成長を促進する基になるパターンに影響を与える細胞の挙動の形状は、追跡する。

確立されたウシ胎児血清の活性化プロトコルを使用する場合、いくつかの細胞型は、パターンがない。6は、パリレン-CとSiO ₂領域の間に識別可能なインサイト反発またはインサイト粘着差コンフルエンスまで成長3T3 L1細胞を示す図 。

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図1。 SiO ₂上パリレン-Cのパターンを製造するためのプロセスを示す図で流れる。

図2チップの活性化ステップの間、パターン化パリレン-CおよびSiO ₂のドメインの接触角の変化を示すフロー図である。

図3。 in vitroでの 3日後にparylene-C/SiO ₂上で培養したHEK293細胞の生細胞イメージングは。チップはウシ胎児血清中で3時間培養した細胞をし、その後、5×10 ⁴細胞/ mlの濃度で懸濁状態で培養した。パリレン-Cは、裸の​​SiO ₂の一方で、細胞接着を促進する細胞をはじく。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図4。 parylene-C/SiO ₂に293細胞を培養したHEKの生細胞イメージング、in vitroで 3日後に別の合理化、活性化ソリューションで3時間活性化したチップであって、a：ウシ胎児血清、B：ビトロネクチンHBSS中（1μg/ ml）を、 C：ウシ血清アルブミン（3 mg / ml）をHBSS +、Dにおけるビトロネクチン（1μg/ ml）を：ウシ血清アルブミン（3 mg / ml）を+フィブロネクチン（156、G / ml）をHBSS中。播種した細胞は、5×10 ⁴細胞/ mlの密度で懸濁していた。チップの異なる治療は、SiO ₂を用いた以前のパターニングドグマ、今や接着剤及びパリレン-C反発の逆転をもたらした方法に注意してください。ヒューズら ¹⁷から適応パリレン-C節直径250μmのは、 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図5。 。初代ヒト神経膠腫由来の幹細胞様細胞の免疫蛍光画像は、SiO ₂上のパリレン-Cの様々なパターンA上に成長させた ：回路図BとCに示す網状パリレン設計を示 ​​す B：グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）について染色（in vitroで 4日後）、固定された細胞の蛍光顕微鏡写真C：同一チップ上の生細胞の光学顕微鏡写真D：別のパリレンにGFAP染色細胞を示す蛍光画像。デザインE：反射ノードの画像とDで画像化パリレンデザインスポークこの図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

図6。 in vitroで 4日後のparylene-C/SiO ₂上で培養した3T3 L1細胞の生細胞イメージング。ワットの後にウシ胎児血清中で3時間、活性化したチップHICH細胞懸濁液（3×10 ⁴細胞/ ml）に播種した。この例では、プラットフォームは、細胞がパリレン-CとSiO ₂の領域上に均等にコンフルエントになってきて、パターン化は有効になりません。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

ディスカッション

ピラニア酸中のチップの浸漬は、任意の残留有機材料を除去するだけでなく機能するだけでなく、基板表面をエッチングする。これはウシ胎児血清で効果的な活性化を可能にするための鍵となります。これを怠ると、細胞のパターニングを防ぎ、深く、オンチップ細胞の挙動を変更します。ピラニア酸で洗浄後にチップを滅菌する必要はない。実際、UV照射による滅菌は、用量依存様式で細胞¹³のパターニングを弱体化させることが示されている。ケアは、フォトリソグラフィ工程の後に、すべての残留フォトレジストを洗い流すように注意しなければならない。持続フォトレジストはparylene-C/SiO ₂形状によって決まるパターン化を優先します不要なCYTO接着層として機能することができます。指定された試薬を用いて説明した上記およびフォトリソグラフィプロセスを使用するとき、アセトンは有効である。しかし、フォトレジストの他のタイプの異なる溶媒が必要な場合があります。

のdiffereの影響と成功を評価するために、ntの製造工程、対照的な二つの基板の接触角を測定することができる。 図2は、チップの活性化プロセス中に発生する変化を示す。これは、血清中の特定の接着剤と反発タンパク質成分は、最終的にそれぞれのCYTO-接着剤またはインサイト·反発特性を発揮するためにパリレンパターン化されたチップを有効にすることを、しかし、可能性があります。

我々は正常に厚く、より薄いパリレン層の両方を使用してパターン化しているものの、すべての代表的な結果は、100nmのパリレン厚でチップを用いる。重要なことに、このフォトリソグラフィエッチング技術は、ここに示されるものとはパリレン構成のはるかに大きな三次元の制御を可能にする。例えば、フォトマスクの組み合わせを用いて、混合の厚さのパリレン領域を作成することが可能である。これは、細胞接着/ repul単に口述領域を越えて行く、定義された三次元地形で細胞培養物を作成するための道を開くシオンは、潜在的に構築物にマイクロ流体チャネルを統合する手段を提供しています。

図示のように、しかしながら、このパターニングプラットフォームは、細胞タイプにわたって普遍的に有効ではない。ときは、このプラットフォーム上で培養した種々の細胞株は、彼らの様々な細胞接着分子のプロファイルと、当然異なる動作をします。私たちは、まだこの細胞パターニングプラットフォームを支える血清中の主要コンポーネント、また無料の細胞膜受容体を、確認されていません。将来的にこれを行うと、その有用性と特異性を広げることを約束。例えば、「非パターニング '細胞株は遺伝的に必要な接着分子を発現するので、パターニングを促進するために変更することができる。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Layout editor software package	CleWin 5.0 from WieWeb		Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture. http://www.wieweb.com/ns6/index.html
Bespoke photo mask	Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland		Either fabricate in-house of facilities exist or commission. www.compugraphics-photomasks.com
3 in Silicon wafers	Siltronix, Archamps, France		http://www.siltronix.com
Atmospheric horizontal furnace	Sandvik		For oxidizing silicon wafer. http://www.mrlind.com
Small spot spectroscopic reflectometer	Nanometrics		To measure depth of silicon dioxide layer. www.nanometrics.com/
Silane adhesion promoter	Merck Chemicals	1076730050	Preapplied to wafer to encourage parylene deposition. www.merck-chemicals.de/
Parylene-C	Ultra Electronics		www.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010	SCS Equipment, Surrye, UK	Model PDS2010	www.scscoatings.com/
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter	SpiChem		www.2spi.com
Automated track system for dispensing photoresist on wafers; 3 in photo-resist track	SVG (silicon Valley Group)		Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Prebake oven cures the resist.
Photo-resist	Rohm & Haas	SPR350-1.2 positive photo-resist	www.rohmhaas.com/
MA/BA8 photo-mask aligner	Suss Microtech		www.suss.com
Microchem MF-26A developer	Microchem		Removes exposed regions of photoresist. www.microchem.com
JLS RIE80 plasma etch system	JLS Designs		Removes exposed regions of parylene. www.jlsdesigns.co.uk
[header]
DISCO DAD 680 Wafer dicing saw	DISCO Corporation, Japan		www.disco.co.jp
Acetone	Fisher Scientific	A929-4	To wash off residual photoresist.
30% Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	www.sigmaaldrich.com
98% Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	435589	www.sigmaaldrich.com
Fetal Bovine Serum	Gibco-Invitrogen	10437	Standard chip activation. www.invitrogen.com
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco-Invitrogen	14170	www.invitrogen.com