Padronização celular em photolithographically Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substratos

Resumo

Este protocolo descreve um método de microfabricação compatível para padronização de células em SiO _2. Um projeto parylene-C predefinido é photolithographically impresso em SiO _2. Após a incubação com soro (ou outra solução de ativação), as células aderem especificamente (e crescer de acordo com a conformidade de) subjacente parylene-C, enquanto está sendo repelido por SiO ₂ regiões.

Resumo

Plataformas padronização celular apoiar objetivos de pesquisa gerais, tais como a construção de redes neuronais in vitro pré-definidos ea exploração de alguns aspectos centrais da fisiologia celular. Para combinar facilmente padronização celular com Multi-Eletrodo Matrizes (AAM) e à base de silício "laboratório em um chip" tecnologias, um protocolo de microfabricação compatível é necessária. Descreve-se um método que utiliza a deposição do polímero parilene-C em SiO _2. Fotolitografia permite padronização precisa e confiável de parylene-C com resolução de nível micro. A subsequente activação por imersão em soro fetal bovino (ou outra solução de activação específica) resulta em um substrato no qual as células cultivadas aderem, ou são repelidos por, parileno ou SiO ₂ regiões, respectivamente. Esta técnica permitiu padronização de uma ampla gama de tipos de células (incluindo as células primárias murino hipocampo, HEK 293 linha celular, teratocarcinoma neurônio-like humanoA linha de células, as células granulares do cerebelo de murino primários, e as células-tronco do tipo derivado de glioma humanas primárias). Curiosamente, contudo, a plataforma não é universal, reflectindo a importância das moléculas de adesão de células específicas. Este processo de padronização celular é rentável, confiável e importante pode ser incorporado em microfabricação padrão (de fabricação de chips) protocolos, abrindo o caminho para a integração da tecnologia microeletrônica.

Introdução

Compreender os mecanismos que determinam a adesão celular e padronização de materiais sintéticos é importante para aplicações tais como engenharia de tecidos, descoberta de drogas e a fabricação de biossensores ^1-3. Muitas técnicas estão disponíveis e em evolução, cada um levando vantagem dos fatores biológicos, químicos e físicos que influenciam a miríade de adesão celular.

Aqui, descrevemos uma técnica de células-padronização que utiliza processos inicialmente desenvolvidas para fins de fabricação de microeletrônicos. Como tal, a plataforma está bem colocado para permitir a integração a jusante de tecnologias de microeletrônica, tais como AAM, na plataforma de padronização.

A interface entre a membrana celular e um material adjacente é bidireccional e complexo. In vivo, as proteínas da matriz extracelular e fornecem a estrutura e força de impacto sobre o comportamento das células através de interacções com receptores de adesão celular. De igual modo, as células em vitro interagir com substratos sintéticos via camadas absorvidas de proteínas ^4, enquanto influências físico-químicas também modular a adesão. Por exemplo, uma superfície de polímero pode ser tornado mais "molhável" (hidrofílico) por iões ou irradiação de luz ultravioleta, ou decapagem por tratamento com ácido ou hidróxido de ^5. Métodos estabelecidos para a padronização de células tirar proveito destes e de outros mediadores da adesão celular. Exemplos incluem a impressão a jato de tinta ^6, microcontact carimbar ^7, imobilização física ^{8, 9} microfluídica, manipulação em tempo real ^{de 10,} e padronização seletiva molecular montagem (SMAP) ^11. Cada um tem vantagens e limitações específicas. Um fator-chave no nosso trabalho, no entanto, é integrar padronização celular com sistemas microeletromecânicos (MEMS).

MEMS referem-se extremamente pequenos dispositivos mecânicos que funcionam com energia elétrica. Isto coincide com a nanoescala equivalente, nanoelectromechsistemas mecânicos. Este conceito tornou-se prática apenas quando as estratégias de semicondutores habilitado fabricação a ter lugar em microescala. Técnicas de microfabricação desenvolvidos originalmente para eletrônicos semicondutores têm sido inadvertidamente encontrado útil para outros usos, como a eletrofisiologia celular, por exemplo. Um objetivo a jusante chave é combinar essas tecnologias de microeletrônica com um processo de padronização de células de alta fidelidade (formando um dispositivo bioMEMS). Várias técnicas de células-padronização existentes e de outro modo confiáveis ​​e práticas são incompatíveis com essa idéia. Por exemplo, o alinhamento preciso de quaisquer microelectrónica ou biossensores embutidos é fundamental para a sua eficácia, mas é extremamente difícil de conseguir utilizando uma técnica tal como microcontact estampagem.

Para contornar esse problema, estamos trabalhando em uma plataforma de padronização com base em ₂ SiO que usa photolithographically impresso parylene-C. Fotolitografia envolve a transferência de recursos geométricos deuma máscara para um substrato por meio de iluminação UV. Uma máscara é projetado usando um programa de desenho assistido por computador apropriado. Mediante uma placa de vidro, uma camada fina de crómio não transparente representa o padrão geométrico desejado (uma resolução característica de 1-2 mm é possível). O substrato a ser modelado é revestida com uma fina camada de material fotosensitivo (um polímero sensível ao UV). O polímero revestido é então alinhada e trouxe em contato próximo com a máscara. Uma fonte de UV é aplicada de tal modo que as áreas não protegidas são irradiadas e, portanto, tornam-se solúveis e removível na próxima etapa de desenvolvimento, deixando uma representação parilene-C do padrão de máscara de trás. Este processo originou durante o desenvolvimento de dispositivos semicondutores. Como tal, as bolachas de silício são frequentemente utilizadas como um substrato. Deposição de fotolitografia de parylene-C em SiO _2, portanto, é um processo simples e confiável que rotineiramente ocorre em instalações de salas limpas microeletrônicos.

Enquanto parylene temvárias características desejáveis ​​de bioengenharia (quimicamente inerte, não bio-degradável), um fator restritivo de utilização direta na padronização celular é a sua adesividade celular inata pobres, atribuída em parte à sua extrema hidrofobia. No entanto, parilene-C tem sido anteriormente utilizada indirectamente para a padronização de células, por exemplo, como uma casca-de distância modelo celular ^12,13. Esta abordagem é limitada pela baixa resolução e requer várias etapas. O processo aqui descrito utiliza um passo em vez de corrosão ácida, seguido por incubação de soro, para assegurar que as regiões de parileno-C tornar célula-adesiva, por meio de uma combinação de redução e na hidrofobicidade da proteína de ligação do soro.

O resultado final é uma estrutura composta de dois substratos diferentes, o que, depois da activação biológica, manifestam respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo e assim representa uma plataforma pattering celular eficaz. É importante notar, não há necessidade de introduzir um g biológicaentos para a instalação de salas limpas como os substratos padronizados podem ser armazenados indefinidamente antes de ser utilizado (após o que são activados utilizando soro fetal de bovino ou de outra solução de activação).

Esta plataforma padronização parylene-C/SiO ₂ é, portanto, um bom candidato para uma coalizão com os componentes de MEMS, como os processos de fabricação tão estreitamente espelhar as utilizadas para a fabricação de microeletrônica.

Protocolo

1. Fabricação de Padrões Parileno em SiO _2: Fluxo de Processo (Ver Figura 1)

1. Projeto de configuração desejado parylene-C usando um pacote de software editor de layout, capaz de leitura / escrita CIF (Caltech Intermediate Form) ou arquivos GDS-II (Banco de Dados do Sistema Gráfico-II). CIF e GDS-II são os formatos de arquivo padrão da indústria para a disposição de arte circuito integrado.
2. Máscara foto Comissão fabricar a uma unidade de microeletrônica apropriadas, ou fazer em casa, se há disponibilidade.
3. Oxidar uma bolacha de silício em um forno horizontal atmosférica (1,88 H ₂ O ₂ e SLM 1,25 SLM) a 950 ° C durante 40 minutos para produzir um a 200 nm, camada de _SiO2 (confirmar com a espessura de um pequeno ponto espectroscópica da reflectividade).
4. Primeiro o wafer oxidado com um promotor de adesão silano. Agora depositar parilene-C a 22 ° C a uma taxa de 1,298 nm / mg de dímero utilizando um sistema de deposição de vácuo, especificamente concebida para a deposição parileno. A 100nm de espessura de revestimento parilene-C, foi usado para todos os exemplos mostrados abaixo.
5. Próximo depósito hexametildissilazano (HMDS), o promotor de aderência sobre a bolacha revestidos por parileno usando um sistema de revestimento de foto-resist adequado.
6. Agora girar a bolacha a 4.000 rpm durante 30 segundos, enquanto a aplicação positiva fotorresistente (resultando numa espessura teórica de 1 mm), usando o mesmo sistema de revestimento foto-resistente como acima.
7. Mole cozer a bolacha durante 60 segundos a 90 ° C.
8. Inserir tanto o wafer e máscara de foto, pré-fabricado em um alinhador de máscara.
9. Expor o wafer foto-resistente revestida-com uma representação negativa UV da configuração parilene-C desejada.
10. Asse wafer expostas por 60 segundos a 110 ° C.
11. Remover todos expostos foto-resiste do wafer, através do desenvolvimento de uma solução desenvolvedor apropriado.
12. Etch fora do parylene desprotegido. Use um sistema de plasma de oxigênio etch (a uma pressão da câmara de 50 mTorr, 49 sccm O _2, com 100 W de potência de RF de 13,56 MHz, euma taxa de corrosão de 100 nm / min) para revelar o SiO subjacente _2.
13. Cortar o wafer usando uma serra corte em cubos apropriada (velocidade do fuso de 30.000 rpm, a velocidade de alimentação 7 mm / seg.)
14. Enxágüe fichas em _H2O desionizada e seque com nitrogênio.
15. Armazene fichas (por tempo indeterminado) em caixas de poeira livre até que seja necessário.

2. Chip Limpeza e Ativação: Protocolo

1. Retirar fotorresistente residual a partir de lascas por lavagem em acetona durante 10 seg.
2. Enxágüe em água deionizada destilada H ₂ O 3x.
3. Certifique-se de ácido piranha fresco (uma proporção de 30% de peróxido de hidrogênio e ácido sulfúrico 05:03 98%).
   CUIDADO: Preparar ácido piranha com muito cuidado. Ele é um oxidante muito poderoso, é fortemente ácida, e a mistura de peróxido de hidrogénio com ácido sulfúrico é uma reacção exotérmica. Realize esta etapa em uma coifa ácido. Permitir 2 min para passar após a mistura do ácido piranha, mas usar dentro de 20 min.
4. Fichas limpas e de corrosão por imersão em piácido Ranha por 10 min.
5. Lavar 3x em chips de _H2O desionizada e transferir para um prato de cultura estéril.
6. Agora ativar chips para padronização celular. Por exemplo, adicionar dois chips por poço para uma placa de 6 poços e, em seguida, adicionar 2 ml de soro fetal de bovino, de modo a imergir totalmente todos os chips. Executar esta, e todas as fases subsequentes de cultura de células, em condições estéreis num fluxo laminar para cultura de tecidos capuz.
7. Incubar fichas no soro por 3-12 h a 37 ° C.
   NOTA: Passos 2,4-2,7 devem ser realizados sequencialmente e sem demora entre as etapas. Se a ativação do soro é adiada por ≥ 24 horas depois de piranha-tratamento, padronização celular é prejudicada devido à redução da repulsão celular de SiO ₂ regiões.
   Soluções de activação alternativo contendo proteínas de adesão celular específicos podem ser usados ​​em lugar de soro fetal bovino. Tais soluções podem alterar as características de adesão celular dos dois substratos contrastantes (ver resultados representativos para um exemplo).

3. Chaparia linhas de celulares on-Chip: Protocolo

1. Retirar as fichas de sua solução de activação e lavagem, uma vez durante 10 segundos em uma solução salina equilibrada de Hank.
2. Coloque chip de um poço de cultura e a placa tipo celular escolhido como uma suspensão em meio de crescimento normal. Optimum densidade de revestimento celular depende tanto do tipo de célula e padrão geométrico de parylene-C on-chip. Uma densidade de 5 x 10 ⁴ células / ml é um ponto de partida razoável.
3. Imagem é adaptado para a motivação subjacente para padronização celular, mas o comportamento de células vivas podem ser facilmente avaliada através de um microscópio de dissecação e uma câmera digital com uma lente de relé adequado.

Resultados

O processo de padronização fotolitográfica _SiO2 com parileno-C encontra-se ilustrada na Figura 1. Uma vez preparada, a activação de fichas em soro fetal bovino permite uma ampla gama de tipos de células para ser modelado em cultura. Nosso grupo tem estampados com sucesso células murinas primários do hipocampo ^14-16, a linha de HEK 293 células ^17, o neurônio-como teratocarcinoma humano (hNT) linha de células ^18, as células granulares do cerebelo murinos primários, e as células-tronco do tipo derivado de glioma humano primários.

A Figura 3 ilustra padronização robusto de HEK 293 células em um padrão parylene consistindo de nódulos circulares com as extensões "de cruz". Chip de activação neste exemplo era com soro fetal bovino. Em contraste, a Figura 4 ilustra o potencial para aumentar a plataforma de padronização usando soluções de activação alternativa. Usando uma solução de albumina de soro bovino (3 mg / ml) e fibronectina (1 ug / ml) em HBSS, a preceito padronização anterior tenha sido invertido.

A Figura 5 ilustra um tipo de célula diferente (uma linha principal-humano derivado da haste-como células derivadas de um glioma de alto grau). Aqui, a geometria do comportamento celular impactos padrão subjacente, com o padrão mostrado na Figura 4A a promoção do crescimento celular ao longo de processo fina parilene-C faixas, como mostrado nas Figuras 4B e 4C.

Alguns tipos de células não padrão ao utilizar o protocolo de activação de soro fetal bovino estabelecida. Figura 6 ilustra 3T3 L1 crescimento até à confluência com nenhuma diferença cito-repulsivo ou cito-adesiva discernível entre parilene-C e SiO ₂ regiões.

pload/50929/50929fig1.jpg "/>
Figura 1. Diagrama de fluxo que ilustra o processo para a fabricação de padrões parilene-C em SiO _2.

Figura 2. Fluxo diagrama que ilustra as mudanças no ângulo de contato para estampados parylene-C e SiO ₂ domínios durante as etapas de ativação chip.

Figura 3. Imagem de células vivas de células HEK 293 cultivadas em parylene-C/SiO ₂ após três dias in vitro. Chips incubados durante 3 horas em soro de bovino fetal após o que as células forambanhados em suspensão numa concentração de 5 x 10 ⁴ células / ml. Parylene-C promove a adesão celular, enquanto nua _SiO2 repele células. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Imagem de células vivas de células HEK 293 cultivadas em parylene-C/SiO ₂ após três dias in vitro chips activados durante 3 horas em diferentes soluções de activação racionalizado:. A: soro fetal bovino, B: vitronectina (1 ug / ml) em HBSS, C: albumina de soro de bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 ug / ml) em HBSS, D: albumina de soro bovino (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) em HBSS. As células foram plaqueadas em suspensão, a uma densidade de 5 x 10 ⁴ células / ml. Note-se como um tratamento diferente do chip resultou na reversão do dogma padronização anterior, com SiO ₂ agora adesiva e parylene-C repulsivo. Parylene-C diâmetro nó 250 um, adaptado de Hughes et al. ¹⁷ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Imagens de imunofluorescência de células estaminais do tipo derivado de glioma humano primários cultivados em vários padrões de parileno-C sobre SiO ₂ A:. Esquemático que ilustra o desenho reticular parilene mostrado em B e C B:.. Micrografia de fluorescência de células fixadas (após 4 dias in vitro) corado para proteína ácida fibrilar glial (GFAP) C:. Micrografia de luz de células vivas no mesmo chip D: imagem de fluorescência ilustrando células GFAP-coradas numa parilene diferente E projeto:.. imagem de reflectância do nó e falou projeto parylene fotografada em D Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6. Imagens de células vivas de células 3T3 L1 cultivadas em parylene-C/SiO ₂ depois de quatro dias in vitro. Chips ativados por 3 horas em soro fetal bovino após wAs células foram plaqueadas em Hich suspensão (3 x 10 ⁴ células / ml). Neste caso, a plataforma não permite padronização, com células tornando-se igualmente confluente em parylene-C e SiO ₂ regiões. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Imersão das fichas em ácido piranha serve não só para remover qualquer material orgânico residual, mas também grava as superfícies do substrato. Isso é fundamental para que a ativação efetiva com soro fetal bovino. Não fazer isso impede célula-padronização e altera profundamente o comportamento das células on-chip. Não há nenhuma exigência para esterilizar fichas após a limpeza com ácido piranha. Com efeito de esterilização por exposição aos raios UV demonstrou prejudicar padronização de células de uma forma dependente da dose ^13. Cuidados devem ser tomados para lavar tudo photoresist residual após o processo de fotolitografia. Persistindo photoresist pode atuar como uma camada de cito-adesiva indesejado que substitui padrões ditados por parylene-C/SiO ₂ geometria. A acetona é eficaz quando se utiliza o processo de fotolitográfica descritos acima e com os reagentes especificados. No entanto, outros tipos de material fotoresistivo pode necessitar de um solvente diferente.

Para avaliar o impacto eo sucesso da difereetapas de fabricação nt, o ângulo de contacto dos dois substratos de contraste pode ser medido. Figura 2 ilustra as alterações que ocorrem durante o processo de activação de chip. É provável, contudo, que o adesivo específico e componentes proteicos repulsivas em soro acabará por permitir o chip-modeladas parilene para exercer as suas respectivas características cito-adesivas ou cito-repulsivo.

Todos os resultados representativos utilizados fichas com uma espessura parylene de 100 nm, embora tenhamos modelada com sucesso usando camadas parylene tanto mais grossas e mais finas. Mais importante, esta técnica gravura fotolitográfico permite um controlo muito maior tridimensional de configuração parilene do que ilustrado aqui. Por exemplo, usando uma combinação de máscaras, é possível criar regiões parylene de espessura mista. Isso abre o caminho para a criação de culturas de células com topografia tridimensional definido, indo além das regiões simplesmente ditando de adesão celular / repulção, oferecendo potencialmente um meio de integrar canais microfluídicos para a construção.

Como mostrado, no entanto, esta plataforma padronização não é universalmente eficaz em todos os tipos celulares. Linhagens celulares diferentes, com seus perfis molécula de adesão celular variados, sem surpresa se comportam diferentemente quando cultivadas nesta plataforma. Nós ainda não identificaram os principais componentes no soro, nem os receptores da membrana celular de cortesia, que se baseia essa plataforma célula-padronização. Ao fazê-lo, no futuro, promete ampliar a sua utilidade e especificidade. Por exemplo, uma linha de células "não-padronização 'pode ser geneticamente modificado para expressar a molécula de adesão necessária e assim promover a padronização.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Layout editor software package	CleWin 5.0 from WieWeb		Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture. http://www.wieweb.com/ns6/index.html
Bespoke photo mask	Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland		Either fabricate in-house of facilities exist or commission. www.compugraphics-photomasks.com
3 in Silicon wafers	Siltronix, Archamps, France		http://www.siltronix.com
Atmospheric horizontal furnace	Sandvik		For oxidizing silicon wafer. http://www.mrlind.com
Small spot spectroscopic reflectometer	Nanometrics		To measure depth of silicon dioxide layer. www.nanometrics.com/
Silane adhesion promoter	Merck Chemicals	1076730050	Preapplied to wafer to encourage parylene deposition. www.merck-chemicals.de/
Parylene-C	Ultra Electronics		www.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010	SCS Equipment, Surrye, UK	Model PDS2010	www.scscoatings.com/
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter	SpiChem		www.2spi.com
Automated track system for dispensing photoresist on wafers; 3 in photo-resist track	SVG (silicon Valley Group)		Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Prebake oven cures the resist.
Photo-resist	Rohm & Haas	SPR350-1.2 positive photo-resist	www.rohmhaas.com/
MA/BA8 photo-mask aligner	Suss Microtech		www.suss.com
Microchem MF-26A developer	Microchem		Removes exposed regions of photoresist. www.microchem.com
JLS RIE80 plasma etch system	JLS Designs		Removes exposed regions of parylene. www.jlsdesigns.co.uk
[header]
DISCO DAD 680 Wafer dicing saw	DISCO Corporation, Japan		www.disco.co.jp
Acetone	Fisher Scientific	A929-4	To wash off residual photoresist.
30% Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	www.sigmaaldrich.com
98% Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	435589	www.sigmaaldrich.com
Fetal Bovine Serum	Gibco-Invitrogen	10437	Standard chip activation. www.invitrogen.com
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco-Invitrogen	14170	www.invitrogen.com