Patterning cellulare su fotolitograficamente Definito parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrati

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo compatibile microfabbricazione per patterning cellulare su SiO _2. Un disegno predefinito parylene-C è fotolitograficamente stampato su SiO ₂ wafer. Dopo l'incubazione con siero (o altra soluzione di attivazione) cellule aderiscono specificamente (e crescere secondo la conformità dei) sottostante parylene-C, pur essendo repulsione per SiO ₂ regioni.

Abstract

Piattaforme patterning cellulare supportano gli obiettivi generali di ricerca, come la costruzione di reti predefiniti in vitro neuronali e l'esplorazione di alcuni aspetti centrali della fisiologia cellulare. Per combinare facilmente patterning cellulare con Multi-Electrode Array (MEA) e la base di silicio 'lab on a chip' tecnologie, è necessario un protocollo compatibile microfabbricazione. Descriviamo un metodo che utilizza la deposizione del polimero parylene-C su SiO ₂ wafer. Fotolitografia consente di patterning accurate e affidabili di parylene-C con risoluzione a livello di micron. Attivazione successiva immersione in siero fetale bovino (o un'altra soluzione attivazione specifica) determina un substrato in cui le cellule coltivate aderiscono, o sono respinti rispettivamente, parylene o SiO ₂ regioni. Questa tecnica ha permesso patterning di una vasta gamma di tipi di cellule (comprese le cellule primarie murine ippocampali, HEK 293 linea cellulare, teratocarcinoma neurone umano similelinea cellulare, le cellule granulari del cervelletto di topo primarie e cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo-like). È interessante notare, tuttavia, la piattaforma non è universale, che riflette l'importanza di molecole di adesione cellula-specifici. Questo processo di patterning cellulare è conveniente, affidabile e soprattutto può essere incorporato in microfabbricazione di serie (produzione di chip) protocolli, aprendo la strada per l'integrazione della tecnologia microelettronica.

Introduzione

La comprensione dei meccanismi che determinano l'adesione cellulare e patterning su materiali sintetici è importante per applicazioni come ingegneria dei tessuti, la scoperta di farmaci, e la fabbricazione di biosensori ^1-3. Molte tecniche sono disponibili e in continua evoluzione, ogni approfittando dei fattori biologici, chimici e fisici che influenzano una miriade di adesione cellulare.

Qui, descriviamo una tecnica di cell-patterning che utilizza i processi, inizialmente sviluppati per scopi di fabbricazione microelettroniche. Come tale, la piattaforma è ben posizionato per consentire l'integrazione a valle delle tecnologie microelettroniche, come MEA, nella piattaforma patterning.

L'interfaccia tra una membrana cellulare ed un materiale adiacente è bidirezionale e complesso. In vivo, proteine ​​della matrice extracellulare forniscono la struttura e la forza e l'impatto sul comportamento cellulare tramite interazione con recettori di adesione cellulare. Analogamente le cellule in vitro interagire con substrati sintetici via strati assorbite delle proteine ^​​4, mentre le influenze fisico-chimiche anche modulano l'adesione. Per esempio, una superficie polimerica può essere reso più "bagnabile" (idrofilo) da ioni o irradiazione di luce ultravioletta, o incisione mediante trattamento con acido o idrossido ^5. Modalità stabilite per patterning cellulare approfittare di questi e di altri mediatori di adesione cellulare. Gli esempi includono la stampa a getto d'inchiostro ^6, microcontact stampaggio ^7, immobilizzazione fisica ^{8, 9} microfluidica, manipolazione in tempo reale ¹⁰ e selettiva patterning assemblaggio molecolare (SMAP) ^11. Ognuno ha vantaggi e limitazioni specifiche. Un fattore chiave nel nostro lavoro, tuttavia, è quello di integrare patterning cellulare con sistemi microelettromeccanici (MEMS).

MEMS riferiscono a estremamente piccoli dispositivi meccanici azionati elettricamente. Questo si sovrappone con la scala nanometrica equivalente, nanoelectromechSistemi anical. Questo concetto è diventato pratica solo quando le strategie di semiconduttori hanno consentito di fabbricazione che si terrà alla microscala. Tecniche di microfabbricazione sviluppate originariamente per elettronica dei semiconduttori sono state inavvertitamente trovato utile per altri usi quali elettrofisiologia cellulare, per esempio. Un obiettivo a valle fondamentale è quello di combinare tali tecnologie microelettroniche con un processo di patterning cellulare ad alta fedeltà (formando un dispositivo bioMEMS). Diverse tecniche cell-patterning esistenti e comunque affidabili e pratici sono incompatibili con questa idea. Ad esempio, l'allineamento preciso delle eventuali microelettronica o biosensori embedded è fondamentale per la loro efficacia, ma è estremamente difficile da realizzare utilizzando una tecnica come timbratura a microcontatto.

Per aggirare questo problema, stiamo lavorando su una piattaforma patterning basata su ₂ SiO che utilizza fotolitograficamente stampato parilene-C. Fotolitografia comporta il trasferimento delle caratteristiche geometriche dauna maschera di un substrato mediante illuminazione UV. Una maschera è stata progettata con un adeguato programma di progettazione assistita da computer. Su una lastra di vetro, un sottile strato di cromo non trasparente rappresenta il disegno geometrico desiderato (risoluzione caratteristica di 1-2 mm è possibile). Il substrato deve essere modellato è rivestita con un sottile strato di photoresist (un polimero UV-sensitive). Il polimero rivestito viene poi allineato e portato in stretto contatto con la maschera. Una fonte UV viene applicato in modo tale che le aree non protette sono irradiati e quindi diventa solubile ed estraibile nella successiva fase di sviluppo, lasciando una rappresentazione parylene-C del modello di maschera dietro. Questo processo ha avuto origine durante lo sviluppo di dispositivi a semiconduttore. Come tale, wafer di silicio sono frequentemente utilizzati come substrato. Deposizione fotolitografica di parylene-C su SiO ₂ è quindi un processo semplice e affidabile che si svolge abitualmente in strutture camera bianca microelettronici.

Mentre parylene hadiverse caratteristiche desiderabili bioingegneria (chimicamente inerte, non bio-degradabile), un fattore limitante l'uso diretto patterning cellulare è la sua adesività delle cellule innato poveri, attribuito in parte alla sua estrema idrofobicità. Tuttavia, parylene-C è stato usato in precedenza indirettamente per patterning cellulare, per esempio come modello cellulare pelabile ^12,13. Questo approccio è limitata dalla scarsa risoluzione e richiede più passaggi. Il processo qui descritto invece utilizza un passo etch acido, seguito da incubazione del siero, per garantire che le regioni parylene-C diventano cellula-adesivo, attraverso una combinazione di riduzione idrofobicità e siero proteina legante.

Il risultato finale è una costruzione composta da due substrati diversi, che, dopo l'attivazione biologica, manifestano rispettive caratteristiche cito-adesivo o cito-repellente e quindi rappresenta una piattaforma picchiettare cella efficace. È importante sottolineare che non vi è alcuna necessità di introdurre ag biologicagenitori nella struttura camera bianca come i substrati fantasia possono essere conservati a tempo indefinito prima dell'uso (dopo di che vengono attivati ​​con siero fetale bovino o un'altra soluzione di attivazione).

Questa piattaforma parylene-C/SiO ₂ patterning è quindi un buon candidato per una coalizione con i componenti MEMS, i processi di fabbricazione così strettamente rispecchiano quelli utilizzati per la fabbricazione microelettronica.

Protocollo

1. Fabbricazione di Patterns parilene su SiO _2: Flusso di processo (vedi figura 1)

1. Disegno desiderato configurazione parylene-C utilizzando un pacchetto software editor di layout, in grado di leggere / scrivere CIF (Caltech forma intermedia) o file GDS-II (Database Graphic System-II). CIF e GDS-II sono formati di file standard di settore per la disposizione del materiale illustrativo circuito integrato.
2. Maschera photo Commissione produzione di un impianto di microelettronica appropriate, o fare in casa se esistono strutture.
3. Ossidare un wafer di silicio in un forno orizzontale atmosferica (H ₂ 1.88 SLM e O ₂ 1.25 SLM) a 950 ° C per 40 minuti per produrre un 200 nm SiO ₂ strati (spessore terminare con una piccola macchia spettroscopica riflettometro).
4. Prime wafer ossidato con un promotore di adesione silano. Ora depositare parylene-C a 22 ° C ad una velocità di 1.298 nm / mg di dimero utilizzando un sistema di deposizione sotto vuoto creato appositamente per depositare parylene. A 100Rivestimento parylene-C spessore nm è stato usato per tutti gli esempi riportati di seguito.
5. Prossimo deposito esametildisilazano (HMDS) promotore di adesione sul wafer parylene rivestite di un sistema idoneo rivestimento foto-resist.
6. Ora ruotare il wafer a 4.000 rpm per 30 sec, nell'applicazione positivo foto-resist (risultante in uno spessore teorico di 1 micron), utilizzando lo stesso sistema di rivestimento photoresist come sopra.
7. Morbido cuocere il wafer per 60 sec a 90 ° C.
8. Inserire sia il wafer e fotomaschera preconfezionati in un allineatore maschera.
9. Esporre il wafer photoresist rivestite con una rappresentazione negativa UV della configurazione parylene-C desideri.
10. Cuocere wafer esposto per 60 sec a 110 ° C.
11. Rimuovere tutti esposti photo-resist dal wafer sviluppando in una soluzione di sviluppo adeguato.
12. Etch fuori dal parilene non protetto. Utilizzare un sistema etch plasma di ossigeno (ad una pressione della camera 50 mTorr, 49 sccm O _2, 100 W di potenza RF a 13,56 MHz, euna velocità di incisione di 100 nm / min) per rivelare sottostante SiO _2.
13. Tagliare il wafer utilizzando un appropriato sega di suddivisione in piastrine (velocità del mandrino 30.000 rpm, velocità di avanzamento 7 millimetri / sec).
14. Sciacquare chips in H ₂ O deionizzata e asciugare con azoto.
15. Il negozio di chip (a tempo indeterminato) in scatole di polvere libera fino al momento.

2. Chip di pulizia e attivazione: Protocollo

1. Rimuovere photoresist residuo da trucioli mediante lavaggio in acetone per 10 sec.
2. Sciacquare con acqua deionizzata distillata H ₂ O 3x.
3. Portare acido Piranha fresco (un rapporto di 05:03 di 30% di perossido di idrogeno e 98% di acido solforico).
   ATTENZIONE: Preparare acido piranha con grande cura. È un ossidante estremamente potente, è fortemente acido, e mescolando perossido di idrogeno con acido solforico è una reazione esotermica. Eseguire questa fase in una cappa di acido. Lasciare due minuti per passare dopo la miscelazione l'acido piranha ma utilizzano meno di 20 min.
4. Patatine pulite e etch per immersione in piL'acido ranha per 10 min.
5. Sciacquare chip 3x in H ₂ O deionizzata e trasferire ad un piatto di coltura sterile.
6. Ora attivare chip per patterning cellulare. Ad esempio, aggiungere due chip per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti e poi aggiungere 2 ml di siero fetale bovino in modo da immergere completamente tutti i chip. Eseguire questa, e tutte le fasi successive di coltura cellulare, in condizioni sterili in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare.
7. Incubare chip nel siero per 3-12 ore a 37 ° C.
   NOTA: I passaggi 2,4-2,7 devono essere eseguiti in sequenza e senza ritardi tra i passaggi. Se l'attivazione del siero viene ritardata da ≥ 24 ore dopo il piranha-trattamento, patterning cellulare è compromessa a causa della ridotta repulsione cellulare da SiO ₂ regioni.
   Soluzioni di attivazione alternativa contenenti proteine ​​di adesione cellulare specifici possono essere utilizzati al posto di siero fetale bovino. Tali soluzioni alterano le caratteristiche di adesione cellulare dei due substrati contrastanti (cfr. risultati rappresentativi per un esempio).

3. Placcatura Linee Cellulari On-chip: Protocollo

1. Rimuovere il chip dalla loro soluzione di attivazione e lavare una volta per 10 secondi in soluzione salina bilanciata di Hank.
2. Posizionare circuito integrato in una cultura ben e piastra tipo di cellula scelto come sospensioni in terreni di crescita usuale. Ottimale densità di placcatura cella dipende sia dal tipo di cellula e disegno geometrico di parylene-C on-chip. Una densità di 5 x 10 ⁴ cellule / ml è un punto di partenza ragionevole.
3. Imaging è su misura per la motivazione di fondo per patterning cellulare, ma il comportamento cellulare diretta può essere facilmente valutata utilizzando un microscopio da dissezione e una fotocamera digitale con una lente relay adatto.

Risultati

Il processo di fotolitografia patterning SiO ₂ con parylene-C è illustrato in Figura 1. Una volta preparata, l'attivazione di chip nel siero fetale bovino consente una vasta gamma di tipi di cellule da ripetere in coltura. Il nostro gruppo ha modellato con successo le cellule primarie murine dell'ippocampo ^14-16, la linea HEK 293 cellule ^17, il teratocarcinoma neurone umano tipo (HNT) linea cellulare ^18, granuli cerebellari murine primarie e cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo-like.

Figura 3 illustra robusta patterning di cellule HEK 293 su un modello parylene costituito da nodi circolari con estensioni "a croce". Attivazione Chip in questo esempio era con siero fetale bovino. Al contrario, la figura 4 illustra il potenziale per aumentare la piattaforma patterning utilizzando soluzioni di attivazione alternativa. Utilizzando una soluzione di albumina di siero bovino (3 mg / ml) e fibronectina (1 mg / ml) in HBSS, il precedente patterning precetto è stata invertita.

La Figura 5 illustra un tipo cellulare diverso (una linea di derivazione umana primaria staminali come cellula derivata da un glioma di alto grado). Qui, la geometria del comportamento cellulare impatti modello sottostante, con lo schema mostrato in Figura 4A promozione della crescita delle cellule processo lungo sottile parylene-C ascolti come illustrato nelle Figure 4B e 4C.

Alcuni tipi di cellule non fanno del modello quando si utilizza il feto protocollo di attivazione siero bovino stabilito. Figura 6 illustra 3T3 L1 crescita a confluenza con nessuna differenza cito-ripugnante o cito-adesivo distinguibile tra le _due regioni parylene-C e SiO.

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Figura 1. Schema di flusso che illustra il processo per la fabbricazione di modelli parylene-C su SiO _2.

Figura 2. Diagramma di flusso che illustra le variazioni di angolo di contatto per motivi geometrici parylene-C e SiO ₂ domini durante le fasi di attivazione chip.

Figura 3. Imaging dal vivo di cellule HEK 293 cellule coltivate su parylene-C/SiO ₂ dopo tre giorni in vitro. Chips incubate per 3 ore in siero fetale bovino, dopo di che le cellule eranoplaccato in sospensione ad una concentrazione di 5 x 10 ⁴ cellule / ml. Parylene-C favorisce l'adesione delle cellule mentre nudo SiO _2, respinge le cellule. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Cellule vive di cellule HEK 293 coltivate su parylene-C/SiO ₂ dopo tre giorni in vitro Chips attivate per 3 ore in diverse soluzioni di attivazione razionalizzata:. A: siero fetale bovino, B: vitronectina (1 mg / ml) in HBSS, C: Albumina di siero bovino (3 mg / ml) + vitronectina (1 mg / ml) in HBSS, D: sieroalbumina bovina (3 mg / ml) + fibronectina (156; g / ml) in HBSS. Cellule piastrate erano in sospensione ad una densità di 5 x 10 ⁴ cellule / ml. Si noti come diverso trattamento del chip ha portato un'inversione della precedente dogma patterning, con SiO ₂ ora adesivo e parylene-C ripugnante. Parylene-C diametro nodo 250 micron, adattato da Hughes et al. ¹⁷ Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Immagini immunofluorescenza di cellule primarie umane di glioma-derivati ​​gambo simile coltivate su vari modelli di parylene-C su SiO ₂ A:. Schematicamente il disegno reticolare parylene mostrato in B e C B:.. Fluorescenza microscopio di cellule fissate (dopo 4 giorni in vitro) tinto di proteina acidica fibrillare gliale (GFAP) C:. Luce microfotografia di cellule vive sullo stesso chip di D: l'immagine di fluorescenza che illustra le cellule GFAP-colorate su un parylene diversa E il design:.. immagine riflettanza del nodo e ha parlato di design parylene ripreso in D Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6. L'imaging cellulare dal vivo di 3T3 L1 coltivate su parylene-C/SiO ₂ dopo quattro giorni in vitro. Chips attivati ​​per 3 ore nel siero fetale bovino dopo wuali cellule sono state piastrate in sospensione (3 x 10 ⁴ cellule / ml). In questo caso, la piattaforma non consente patterning, con le cellule diventando altrettanto confluenti su parylene-C e SiO ₂ regioni. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Immersione di chip in acido piranha non serve solo a rimuovere qualsiasi materiale organico residuo, ma anche attacca le superfici di substrato. Questa è la chiave per consentire l'attivazione efficace con siero fetale bovino. In caso contrario, impedisce cellula-patterning e profondamente altera il comportamento delle cellule on-chip. Non vi è alcun obbligo di sterilizzare i chip dopo la pulizia con acido piranha. Infatti sterilizzazione mediante raggi UV ha dimostrato di minare patterning cellulare in modo dose-dipendente ^13. Bisogna fare attenzione a lavare tutto photoresist residuo dopo il processo fotolitografico. Persistenza fotosensibile può agire come strato cito-adesivo indesiderato che sostituisce patterning dettata da parylene-C/SiO ₂ geometria. L'acetone è efficace quando si utilizza il processo fotolitografico descritto sopra e con i reagenti specificati. Tuttavia, altri tipi di photoresist possono richiedere un solvente diverso.

Per valutare l'impatto e il successo della different fasi di fabbricazione, l'angolo di contatto dei due substrati contrastanti possono essere misurati. figura 2 illustra le alterazioni che si verificano durante il processo di attivazione chip. È probabile, tuttavia, che adesivo specifico e componenti proteiche repulsive nel siero definitiva abilitare il chip parilene-modellata per esercitare le rispettive caratteristiche cito-adesive o cito-repellente.

Tutti i risultati rappresentativi utilizzati chips con uno spessore parylene di 100 nm, se abbiamo modellato con successo utilizzando sia più spessi e sottili strati parilene. È importante sottolineare che questa tecnica di incisione fotolitografica permette un maggiore controllo tridimensionale della configurazione parylene quello illustrato qui. Ad esempio, utilizzando una combinazione di fotomaschere, è possibile creare aree parylene di spessore misto. Questo apre la strada alla creazione di colture cellulari con definito topografia tridimensionale, andando oltre la semplice dettare le regioni di adesione cellulare / repulSion, potenzialmente offre un mezzo per integrare canali microfluidica nel costrutto.

Come mostrato, tuttavia, questa piattaforma patterning non è universalmente efficace di tutti i tipi di cellule. Diverse linee cellulari, con i loro vari profili molecola di adesione cellulare, ovviamente si comportano diversamente quando coltivate su questa piattaforma. Non abbiamo ancora identificato i componenti chiave nel siero, né i recettori delle cellule membrana gratuiti, che sono alla base di questa piattaforma cellula-patterning. In questo modo in futuro promette di ampliare la sua utilità e specificità. Ad esempio, una linea cellulare di 'non-patterning' potrebbe essere geneticamente modificato per esprimere la molecola di adesione necessaria e quindi promuovere patterning.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Layout editor software package	CleWin 5.0 from WieWeb		Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture. http://www.wieweb.com/ns6/index.html
Bespoke photo mask	Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland		Either fabricate in-house of facilities exist or commission. www.compugraphics-photomasks.com
3 in Silicon wafers	Siltronix, Archamps, France		http://www.siltronix.com
Atmospheric horizontal furnace	Sandvik		For oxidizing silicon wafer. http://www.mrlind.com
Small spot spectroscopic reflectometer	Nanometrics		To measure depth of silicon dioxide layer. www.nanometrics.com/
Silane adhesion promoter	Merck Chemicals	1076730050	Preapplied to wafer to encourage parylene deposition. www.merck-chemicals.de/
Parylene-C	Ultra Electronics		www.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010	SCS Equipment, Surrye, UK	Model PDS2010	www.scscoatings.com/
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter	SpiChem		www.2spi.com
Automated track system for dispensing photoresist on wafers; 3 in photo-resist track	SVG (silicon Valley Group)		Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Prebake oven cures the resist.
Photo-resist	Rohm & Haas	SPR350-1.2 positive photo-resist	www.rohmhaas.com/
MA/BA8 photo-mask aligner	Suss Microtech		www.suss.com
Microchem MF-26A developer	Microchem		Removes exposed regions of photoresist. www.microchem.com
JLS RIE80 plasma etch system	JLS Designs		Removes exposed regions of parylene. www.jlsdesigns.co.uk
[header]
DISCO DAD 680 Wafer dicing saw	DISCO Corporation, Japan		www.disco.co.jp
Acetone	Fisher Scientific	A929-4	To wash off residual photoresist.
30% Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	www.sigmaaldrich.com
98% Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	435589	www.sigmaaldrich.com
Fetal Bovine Serum	Gibco-Invitrogen	10437	Standard chip activation. www.invitrogen.com
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco-Invitrogen	14170	www.invitrogen.com