Cellule structuration par photolithographie sur Défini Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Substrats

Résumé

Ce protocole décrit un procédé de microfabrication compatible pour un patron de cellules de SiO _2. Une conception prédéfinie parylène-C par photolithographie est imprimé à la SiO ₂ gaufrettes. Après incubation des cellules avec du sérum (ou une autre solution d'activation) adhèrent spécifiquement (et se développent en fonction de la conformité des) sous-jacent parylène-C, tout en étant repoussé par SiO ₂ régions.

Résumé

Plates-formes cellule de motifs d'appuyer les objectifs de recherche généraux, tels que la construction de réseaux de neurones prédéfinis in vitro et l'exploration de certains aspects centraux de la physiologie cellulaire. Pour combiner facilement un patron de cellules avec Multi-Electrode Arrays (AME) et à base de silicium «laboratoire sur puce» technologies, un protocole de microfabrication-compatible est nécessaire. Nous décrivons un procédé qui utilise le dépôt du polymère de parylène-C sur SiO ₂ gaufrettes. Photolithographie permet de motifs précis et fiable de parylène-C à une résolution au niveau du micron. Après activation par immersion dans du sérum de veau fœtal (ou d'une autre solution d'activation spécifique) conduit à un substrat dans lequel les cellules cultivées adhèrent à, ou sont repoussés par, le parylène ou de SiO _2, respectivement les régions. Cette technique a permis la structuration d'une large gamme de types de cellules (y compris les cellules murines hippocampiques primaires, des cellules HEK 293, une lignée cellulaire de tératocarcinome humain neurone-likelignée cellulaire, les cellules granulaires du cervelet primaires murins, et cellules humaines primaires en forme de tige gliome-dérivée). Il est intéressant, cependant, la plate-forme n'est pas universel; reflétant l'importance des molécules d'adhésion cellulaires spécifiques. Ce processus de structuration de la cellule est rentable, fiable, et surtout peut être incorporé dans la microfabrication norme (fabrication de la puce) les protocoles, ouvrant la voie à l'intégration de la technologie microélectronique.

Introduction

Mécanismes qui dictent l'adhésion cellulaire et la structuration de matériaux synthétiques Comprendre est important pour des applications telles que l'ingénierie tissulaire, la découverte de médicaments, et la fabrication de biocapteurs ^1-3. De nombreuses techniques sont disponibles et en évolution, chaque profitant des facteurs biologiques, chimiques et physiques qui influent sur une myriade de l'adhésion cellulaire.

Ici, nous décrivons une technique de cellule de motif, qui utilise les procédés développés initialement à des fins de fabrication microélectroniques. En tant que tel, la plate-forme est bien placé pour permettre une intégration en aval de technologies microélectroniques, tels que les AEM, dans la plate-forme de structuration.

L'interface entre la membrane cellulaire et un matériau adjacent est bidirectionnel et complexe. In vivo, les protéines de la matrice extracellulaire fournissent la structure et la force et l'impact sur ​​le comportement des cellules par l'intermédiaire d'interactions avec des récepteurs d'adhésion cellulaire. De même, les cellules de vITRO interagir avec des substrats synthétiques par des couches de protéines absorbées ⁴ tandis que les influences physico-chimiques modulent également l'adhérence. Par exemple, une surface de polymère peut être rendu plus "mouillable" (hydrophile) par irradiation par des ions ou des rayons ultraviolets, ou la gravure par traitement avec de l'acide ou de l'hydroxyde ^5. Méthodes établies pour un patron de cellules de profiter de ces et d'autres médiateurs d'adhésion cellulaire. Les exemples incluent impression jet d'encre ^{6, 7} microcontact estampage, l'immobilisation physique ^{8, 9} microfluidique, la manipulation en temps réel ^{de 10,} et la structuration sélective moléculaire de montage (SMAP) ^11. Chacun a des avantages et des limites spécifiques. Un facteur clé dans notre travail, cependant, est d'intégrer un patron de cellules avec les systèmes micro-électromécaniques (MEMS).

MEMS se réfèrent à très petits dispositifs mécaniques d'entraînement par l'électricité. Cette chevauche l'échelle nanométrique équivalent, nanoelectromechsystèmes anical. Ce concept est devenu pratique uniquement lorsque les stratégies de semi-conducteurs ont permis la fabrication aura lieu à l'échelle microscopique. techniques de microfabrication développées à l'origine pour des produits électroniques de semi-conducteurs ont été trouvés par inadvertance utile pour d'autres utilisations telles que l'électrophysiologie cellulaire, par exemple. Un but en aval clé est de combiner ces technologies microélectroniques avec un processus de structuration de la cellule de haute fidélité (formation d'un dispositif bioMEMS). Plusieurs techniques cellules structuration existantes et autrement fiables et pratiques sont incompatibles avec cette idée. Par exemple, un alignement précis des biocapteurs ou des micro-électronique embarqué est essentielle à leur efficacité, mais il est extrêmement difficile à réaliser en utilisant une technique telle que l'estampage microcontact.

Pour contourner ce problème, nous travaillons sur une plate-forme de motifs de base de SiO ₂ qui utilise photolithographie imprimé parylène-C. Photolithographie implique le transfert de caractéristiques géométriques deun masque sur un substrat par l'intermédiaire d'une illumination UV. Un masque est conçu en utilisant un programme de conception assistée par ordinateur approprié. Sur une plaque de verre, une mince couche de chrome opaque représente la configuration géométrique souhaitée (une résolution de caractéristique de 1-2 mm est possible). Le substrat à motif est revêtue d'une mince couche de résine photosensible (un polymère sensible à l'UV). Le polymère est ensuite revêtu aligné et mis en contact étroit avec le masque. Une source de rayons UV est appliquée de telle sorte que les zones non protégées sont irradiés et donc devenir soluble et amovible dans l'étape de développement suivante, en laissant une représentation du parylène-C de la configuration de masque derrière. Ce processus a commencé pendant le développement de dispositifs semi-conducteurs. En tant que tel, des tranches de silicium sont fréquemment utilisés en tant que substrat. Dépôt de photolithographie de parylène C sur SiO ₂ est donc un processus simple et fiable qui a lieu régulièrement en salle blanche microélectronique.

Alors que parylène aplusieurs caractéristiques souhaitables de bio-ingénierie (chimiquement inerte, non bio-dégradables), un facteur limitant son utilisation directe dans la structuration de la cellule est son adhérence cellulaire innée pauvres, attribué en partie à l'extrême hydrophobie. Néanmoins, le parylène-C a déjà été utilisé indirectement pour produire un patron de cellules, par exemple en tant que matrice cellulaire pelable ^12,13. Cette approche est limitée par la faible résolution et nécessite plusieurs étapes. Le procédé décrit ici utilise à la place d'une étape d'attaque acide, suivie d'une incubation de sérum, de sorte que les régions du parylène-C deviennent cellule-adhésif, à travers une combinaison de la réduction du caractère hydrophobe et la protéine de liaison sérum.

Le résultat final est une construction composée de deux substrats différents qui, après activation biologique, manifestent des caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsion respectifs et représente une plate-forme efficace de crépitement de cellule ainsi. Fait important, il n'est pas nécessaire d'introduire ag biologiqueents dans l'installation de salle blanche selon les substrats à motifs peuvent être stockées indéfiniment avant utilisation (la suite de quoi ils sont activés à l'aide de sérum bovin fœtal ou d'une autre solution d'activation).

Cette parylene-C/SiO ₂ plate-forme de structuration est donc un bon candidat pour une coalition avec des composants MEMS, comme les procédés de fabrication afin reflètent étroitement celles utilisées pour la fabrication microélectronique.

Protocole

Une. Fabrication de modèles Parylene sur SiO _2: Déroulement (voir la figure 1)

1. Conception souhaite configuration parylène-C en utilisant un logiciel de l'éditeur de mise en page, capable de lire / écrire CIF (Caltech forme intermédiaire) ou fichiers GDS-II (base de données système graphique II). CIF et GDS-II sont l'industrie des formats de fichier standard pour la mise en page intégré circuit artistique.
2. Commission masque de photo la production à une installation de la microélectronique appropriées, ou de faire à l'interne si les installations existent.
3. Oxyder une plaquette de silicium dans un four horizontal atmosphérique (H ₂ 1,88 SLM et O ₂ 1,25 SLM) à 950 ° C pendant 40 min pour produire une couche de SiO ₂ de 200 nm (confirmer épaisseur avec une petite tache spectroscopique réflectomètre).
4. Premier la plaquette oxydée avec un promoteur d'adhérence silane. Maintenant dépôt de parylène-C à 22 ° C à une vitesse de 1,298 nm / mg de dimère en utilisant un système de dépôt sous vide spécifiquement conçue pour déposer du parylène. A 100nm d'épaisseur revêtement de parylène-C a été utilisé pour tous les exemples présentés ci-dessous.
5. Suivant dépôt hexaméthyldisilazane (HMDS), le promoteur d'adhérence sur la plaquette revêtue de parylène en utilisant un système de revêtement de résine photosensible appropriée.
6. Maintenant tourner la tranche à 4000 tpm pendant 30 secondes tout en appliquant une laque photosensible positif (conduisant à une épaisseur théorique de 1 pm), en utilisant le même système de revêtement de résine photosensible comme ci-dessus.
7. Doux cuire la galette pendant 60 secondes à 90 ° C.
8. Insérez les deux la plaquette et préfabriqué masque de photo dans un alignement de masque.
9. Exposer la plaquette de résine photosensible revêtue d'une représentation négative des UV la configuration souhaitée parylène-C.
10. Cuire tranche exposée pendant 60 secondes à 110 ° C.
11. Retirez tous les exposés de résine photosensible de la plaquette par le développement d'une solution de développement approprié.
12. Graver au large de la parylène non protégés. Utilisation d'un système de plasma d'oxygène à la gravure (à une pression de chambre de 50 mTorr, 49 sccm d'O _2, une puissance de 100 W RF à 13,56 MHz, etune vitesse de gravure de 100 nm / min) pour révéler le SiO ₂ sous-jacente.
13. Couper la tranche en utilisant une scie de découpe approprié (vitesse de broche 30000 rpm, vitesse d'avance de 7 mm / s).
14. Rincer puces en H ₂ O déminéralisée et sécher avec de l'azote.
15. puces de magasins (indéfiniment) dans des boîtes de poussière libre jusqu'au moment.

2. Chip Nettoyage et activation: Protocole

1. Retirer résine photosensible résiduelle à partir de copeaux par lavage dans de l'acétone pendant 10 sec.
2. Rincer à l'eau distillée déminéralisée ₂ O 3x.
3. Maquillage acide piranha frais (un ratio 05:03 de 30% de peroxyde d'hydrogène et d'acide sulfurique à 98%).
   ATTENTION: Préparer acide piranha avec grand soin. Il est un oxydant très puissant, est fortement acide, et le mélange de peroxyde d'hydrogène avec de l'acide sulfurique est une réaction exothermique. Effectuez cette étape dans une hotte acide. Laisser 2 min de passer après le mélange de l'acide piranha mais utilisent moins de 20 min.
4. Puces propres et gravure par immersion dans piacide Ranha pendant 10 min.
5. Rincer puces 3x en H ₂ O déminéralisée et transférer dans un plat de culture stérile.
6. Maintenant activer puces pour un patron de cellules. Par exemple, ajouter deux puces par puits dans une plaque à 6 puits, puis ajouter 2 ml de sérum fœtal bovin de manière à immerger pleinement toutes les puces. Effectuer ceci, et toutes les étapes de culture de cellules suivantes, dans des conditions stériles dans une culture tissulaire hotte à flux laminaire.
7. Incuber les copeaux dans le sérum de 3-12 heures à 37 ° C.
   REMARQUE: Les étapes 02.04 à 02.07 doit être effectuée de manière séquentielle et sans délai entre les étapes. Si l'activation de sérum est retardée par ≥ 24 heures après le traitement piranha, un patron de cellules est compromise en raison de la réduction de répulsion de la cellule de SiO ₂ régions.
   Des solutions de remplacement d'activation contenant des protéines spécifiques d'adhésion cellulaire peuvent être utilisés à la place du sérum de veau fœtal. Ces solutions modifient les caractéristiques d'adhérence cellulaire des deux substrats contrastées (voir résultats représentatifs pour un exemple).

3. Placage lignées cellulaires sur-puce: Protocole

1. Enlevez les morceaux de leur solution d'activation et laver une fois pendant 10 secondes dans une solution saline équilibrée de Hank.
2. Placer la puce dans un puits de culture et de la plaque type cellulaire choisi sous forme de suspension dans son milieu de culture habituel. Densité de placage de cellule optimale dépend à la fois du type de cellule et de motifs géométriques de parylène-C sur la puce. Une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / ml est un point de départ raisonnable.
3. L'imagerie est adaptée à la motivation sous-jacente pour produire un patron de cellules, mais le comportement réel de la cellule peut facilement être évaluée à l'aide d'un microscope à dissection et un appareil photo numérique avec une lentille de relais approprié.

Résultats

Le procédé de photolithographie un motif de SiO ₂ de parylène-C est illustrée sur la figure 1. Une fois préparé, l'activation de puces dans du sérum bovin fœtal permet une large gamme de types de cellules à être modelées en culture. Notre groupe a modelé avec succès des cellules hippocampiques murines primaires ^14-16, la ligne HEK 293 de la cellule ^17, le tératocarcinome humain de neurone comme (hNT) lignée cellulaire ^18, les cellules primaires granulaires du cervelet de souris et des cellules humaines primaires souches comme gliome dérivés.

La figure 3 illustre un motif solide de cellules HEK 293 sur un modèle de parylène constitué de nœuds circulaires avec les extensions «réticule». l'activation de la puce dans cet exemple est de sérum bovin fœtal. En revanche, la figure 4 illustre le potentiel pour augmenter la plate-forme de formation de motifs en utilisant des solutions d'activation alternative. Utilisation d'une solution de sérum-albumine bovine (3 mg / ml) et la fibronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, le motif précepte précédent a été inversé.

La figure 5 illustre un autre type de cellule (une ligne primaire d'origine humaine comme tige-cellule dérivée d'un gliome de grade élevé). Ici, la géométrie du comportement cellulaire des impacts de motif sous-jacent, le motif représenté sur la figure 4A la promotion de la croissance de la cellule le long processus de parylène-C mince écoutes comme représenté sur les figures 4B et 4C.

Certains types de cellules ne motif lors de l'utilisation du protocole d'activation de sérum bovin fœtal établi. Figure 6 illustre des cellules 3T3 L1 croissance jusqu'à confluence avec aucune différence discernable cyto-répulsive ou cyto-adhésif entre les _deux régions du parylène-C et SiO.

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Figure 1. Schéma illustrant le procédé de fabrication de motifs de parylène-C sur SiO _2.

Figure 2. Diagramme de flux illustrant les variations de l'angle de contact pour les motifs parylène-C et de SiO ₂ domaines pendant les étapes d'activation de puce.

Figure 3. Imagerie des cellules vivantes de HEK 293 cellules cultivées sur parylene-C/SiO ₂ après trois jours in vitro. Chips incubé pendant 3 heures dans le sérum fœtal bovin, après quoi les cellules ont étéplaqué en suspension à une concentration de 5 x 10 ⁴ cellules / ml. Parylène C favorise l'adhérence cellulaire tout nu SiO ₂ repousse les cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Imagerie des cellules vivantes de HEK 293 cellules cultivées sur parylene-C/SiO ₂ après trois jours in vitro Chips activées pendant 3 heures dans différentes solutions d'activation rationalisé:. A: sérum de veau foetal, B: vitronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, C: la sérum-albumine bovine (3 mg / ml) + vitronectine (1 pg / ml) dans du HBSS, D: albumine bovine de sérum (3 mg / ml) + fibronectine (156; g / ml) dans du HBSS. Les cellules ont été étalées en suspension à une densité de 5 x 10 ⁴ cellules / ml. Notez comment un traitement différent de la puce a abouti à l'inversion du dogme de structuration précédente, avec SiO ₂ maintenant adhésif et parylène-C répulsive. Diamètre de noeud parylène-C 250 um, adapté de Hughes et al. ¹⁷ S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. images d'immunofluorescence de cellules humaines primaires souches comme gliome dérivés cultivées sur divers modèles de parylène C sur SiO ₂ A:. schématique illustrant la conception réticulaire de parylène montré en B et C B:.. Fluorescence au microscope de cellules fixes (après 4 jours in vitro) teinté de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) C:. Micrographie lumière de cellules vivantes sur une même puce D: l'image de fluorescence illustrant cellules GFAP-colorées sur un parylène différente E conception:.. l'image de réflectance du nœud et parlé conception de parylène imagé dans D S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6. Imagerie des cellules vivantes de cellules 3T3 L1 cultivées sur parylene-C/SiO ₂ après quatre jours in vitro. Chips activées pendant 3 heures dans le sérum fœtal bovin après which cellules ont été étalées en suspension (3 x 10 ⁴ cellules / ml). Dans ce cas, la plate-forme ne permet pas de motifs, avec des cellules de devenir aussi confluentes sur parylène-C et SiO ₂ régions. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Immersion dans de l'acide de puces de piranha sert non seulement de supprimer toute matière organique résiduelle, mais aussi attaque chimiquement les surfaces du substrat. Cela est essentiel pour permettre l'activation efficace avec du sérum de veau fœtal. Ne pas le faire empêche la cellule de motifs et modifie le comportement des cellules sur puce profondément. Il n'est pas nécessaire de stériliser les puces après le nettoyage avec de l'acide de piranha. En effet, la stérilisation par exposition aux UV a été montré pour miner un patron de cellules dans un mode dépendant de la dose ^13. Il faut veiller à enlever toute résine photosensible résiduelle après le processus de photolithographie. Résine photosensible persistant peut agir comme une couche de cyto-adhésif indésirables qui remplace motifs dictés par parylene-C/SiO ₂ géométrie. L'acétone est efficace lors de l'utilisation du procédé décrit ci-dessus de photolithographie et avec les réactifs spécifiques. Cependant, d'autres types de résine photosensible peuvent nécessiter un solvant différent.

Pour évaluer l'impact et le succès de la différent étapes de fabrication, l'angle des deux substrats contrastées de contact peuvent être mesurés. figure 2 illustre les modifications qui se produisent au cours du processus d'activation de la puce. Il est probable, cependant, que l'adhésif spécifique et les composants protéiques dans le sérum de répulsion permettent finalement la puce de parylène à motifs pour exercer ses caractéristiques cyto-adhésives ou cyto-répulsive respectifs.

Tous les résultats représentatifs utilisés puces avec une épaisseur de parylène de 100 nm, que nous avons modelé avec succès en utilisant des couches à la fois plus épaisses et plus minces de parylène. Fait important, cette technique photolithogravure permet un plus grand contrôle tridimensionnel de configuration de parylène à celle illustrée ici. Par exemple, en utilisant une combinaison de masques photographiques, il est possible de créer des zones de parylène d'épaisseur mixte. Cela ouvre la voie à la création de cultures cellulaires avec défini topographie tridimensionnelle, allant au-delà des régions tout simplement dicter de l'adhésion cellulaire / répulsionsion, offrant potentiellement un moyen d'intégrer les canaux microfluidiques dans la construction.

Comme le montre, cependant, cette plate-forme de structuration n'est pas universellement efficace dans tous les types cellulaires. Des lignées cellulaires différentes, avec leurs profils variés de molécules d'adhésion cellulaire, se comportent différemment lorsqu'ils sont cultivés sans surprise sur cette plate-forme. Nous n'avons pas encore identifié les éléments clés dans le sérum, ni les récepteurs de la membrane cellulaire gratuits, qui sous-tendent cette plate-forme cellulaire de motifs. Faire à l'avenir promet d'élargir son utilité et spécificité. Par exemple, une lignée de cellules "non-patterning" pourrait être génétiquement modifié pour exprimer la molécule d'adhésion requis et ainsi de promouvoir la structuration.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Layout editor software package	CleWin 5.0 from WieWeb		Capable of reading/writing CIF or GDS-II files. Used to create parylene design for photo mask manufacture. http://www.wieweb.com/ns6/index.html
Bespoke photo mask	Compugraphics International Ltd, Glenrothes, Scotland		Either fabricate in-house of facilities exist or commission. www.compugraphics-photomasks.com
3 in Silicon wafers	Siltronix, Archamps, France		http://www.siltronix.com
Atmospheric horizontal furnace	Sandvik		For oxidizing silicon wafer. http://www.mrlind.com
Small spot spectroscopic reflectometer	Nanometrics		To measure depth of silicon dioxide layer. www.nanometrics.com/
Silane adhesion promoter	Merck Chemicals	1076730050	Preapplied to wafer to encourage parylene deposition. www.merck-chemicals.de/
Parylene-C	Ultra Electronics		www.ultra-cems.com
SCS Labcoter 2 deposition Unit, Model PDS2010	SCS Equipment, Surrye, UK	Model PDS2010	www.scscoatings.com/
Hexamethyldisilazane (HMDS) adhesion promoter	SpiChem		www.2spi.com
Automated track system for dispensing photoresist on wafers; 3 in photo-resist track	SVG (silicon Valley Group)		Automated track system for dispensing photoresist on wafers. A prime oven bakes the wafer and dispenses the adhesion promoter, HMDS. A combination spinner dispenses photoresist. Prebake oven cures the resist.
Photo-resist	Rohm & Haas	SPR350-1.2 positive photo-resist	www.rohmhaas.com/
MA/BA8 photo-mask aligner	Suss Microtech		www.suss.com
Microchem MF-26A developer	Microchem		Removes exposed regions of photoresist. www.microchem.com
JLS RIE80 plasma etch system	JLS Designs		Removes exposed regions of parylene. www.jlsdesigns.co.uk
[header]
DISCO DAD 680 Wafer dicing saw	DISCO Corporation, Japan		www.disco.co.jp
Acetone	Fisher Scientific	A929-4	To wash off residual photoresist.
30% Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	H1009	www.sigmaaldrich.com
98% Sulfuric Acid	Sigma-Aldrich	435589	www.sigmaaldrich.com
Fetal Bovine Serum	Gibco-Invitrogen	10437	Standard chip activation. www.invitrogen.com
Hank's Balanced Salt Solution	Gibco-Invitrogen	14170	www.invitrogen.com