代謝率の測定に<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;呼吸計測を使用した

要約

代謝障害はヒトにおいて最も一般的な疾患の1つである。遺伝的に扱いやすいモデル生物D.キイロは、代謝を調節する新規遺伝子を同定するために使用することができる。本稿では、そのCO ₂産生を測定することにより、ハエに代謝率を研究することができ、比較的簡単な方法を説明します。

要約

代謝障害は、人の健康に影響を与え、頻繁に問題となっている。そのため、代謝を調節するメカニズムを理解することは非常に重要な科学的な課題である。ヒトでの多くの疾患の原因遺伝子は、 ショウジョウバエの異なる障害の発症に関与するシグナル伝達経路を研究するための良いモデル作り、フライホモログを持っている。さらに、 ショウジョウバエの扱いやすには、代謝を調節することができる新たな治療標的を同定するのを助けるために遺伝子スクリーニングを簡素化します。このようなスクリーンを行うために、ハエの代謝状態の変化を同定するための簡単​​かつ迅速な方法が必要である。一般に、二酸化炭素生成は基質酸化及び代謝状態に関する情報を提供するエネルギー消費量の良好な指標である。このプロトコルでは、ハエからのCO ₂の出力を測定するための簡単な方法をご紹介します。この技術は、潜在的に代謝速度に影響を与える遺伝的摂動の識別を助けることができる。

概要

生化学クレブス回路は、CO _2を生成する炭水化物、脂肪、およびタンパク質由来の酢酸酸化によってATPを生成します。 ショウジョウバエでは、O ₂入力は直接CO ₂の出力と相関し、代謝¹のレベルを反映している。これにより、CO ₂の出力の測定は、正常老化と代謝^2-5に関連研究において使用されている。ここに私たちの研究室では、任意の特別な装置を必要とせずに、最大18サンプル中のCO ₂産生を測定することができるように、あらかじめ設計された実験装置を変更しました。その他、我々は以前に筋ジストロフィー関連タンパク質、ジストログリカン^（DG）6-8が不足しているハエの代謝率の差を表示するには、このメソッドを使用している。

O酸化的代謝に用いられる_2は、呼吸廃棄物として排出されるCO ₂に変換される。建設手作りの呼吸計が消費されたTiON O ₂の割合の決定を可能にすることが記載されている。ハエを効率的に気相からそれを排除し、CO ₂排出された吸収する物質を密閉容器内に配置される。ガス容積（減圧）の変化は、閉鎖呼吸計に取り付けられたガラス毛細管内の流体の変位によって測定される。

他のものよりもこの技術の主な利点はコストです。これまでの研究では、ガス分析と技術的に高度な呼吸計測システム^1,9を使用して、ショウジョウバエによるCO ₂産生を測定した。より複雑な機器にもかかわらず、ここで説明する方法の感度が報告された値（ 表1）と同様である。さらに、いくつかの他のグループは、 ショウジョウバエ ^4-6の相対的な代謝率を決定するために、この技術のバリエーションを使用している。したがって、このアッセイはreliabを生成するために使用することができるル、任意の実験室で設定でき、教育の目的に使用することができる特殊な機器の購入なしに、ショウジョウバエの代謝に関連する再現性のあるデータ。

一般に、生物の代謝を決定するための技術が受け入れを製造CO _2を測定することで、O _2を消費し、または両方^3,4,9。しかし、それは、O ₂ 1当量のCO ₂ 1当量を生成すると仮定することができ、生成されたCO ₂の正確な比は^、10を利用代謝基質に依存する。従って、正確にエネルギ単位での代謝速度を決定するためには、O _2消費およびCO _2が生成さの両方を測定する必要がある。このため、ここで説明する方法は、動物ではなく絶対値とCO ₂生成の違いを比較するに特に関連のある。私たちの技術は、ティムの期間にわたって複数の動物のCO ₂の生産を統合したがって、E（1〜2時間）とは、動物の活動の平均値を返します。実験動物は、測定対照動物よりも活性であることを信じる理由がある場合には異なるレベルの活性を反映し、必ずしも代謝でした。

プロトコル

呼吸計の1。準備

1. 50μlのキャピラリーマイクロピペットの挿入を可能にするためにカミソリの刃で千μlのピペットチップをカットし、できるだけまっすぐピペットチップを取得しよう。
2. ピペットに泡の部分を置き、ピペットチップでそれを押し下げます。
3. CO ₂吸収剤を少量添加すると、発泡体の二枚で、それが含まれています。
4. マイクロピペットをピペットチップに挿入されている場所で、接着剤を適用します。
5. 接着剤を乾燥させるために、一晩呼吸のままにしておきます。
   呼吸計の概略図を図1Aに示されている。

測定所の2。準備

1. 目に見えるカラー化になります比でエオシンで水を混合することにより、チャンバ溶液を調製する。
2. チャンバー内にエオシン/水溶液を注ぐ。
3. センチメートルスケールで、チャンバの側面の1にラベルを付けます。

3。呼吸計にハエを配置

1. マーカーで、個々の呼吸計にラベルを付けます。
2. _2を COと各呼吸計内部の希望する遺伝子型の3-5ハエを配置する別の方法を使用してハエを麻酔。
3. 粘土のパテを使用して、上部にしっかりと呼吸計を密封する。
4. ハエは約15分間麻酔から回復することができます。
5. 大気中のコントロールとして使用される、ハエなしで1呼吸を準備します。

4。実験を行う

1. チャンバーの上部に上下に開いて1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブホルダーを取り付けることにより、チャンバ内の呼吸計を掛ける。
2. ダウン先端が着色した溶液に浸すことを可能チャンバ内へのマイクロピペットチップで呼吸計を挿入します。
3. 温度および圧力fluctより強い分離を提供する蓋カバーとチャンバーとの間にワセリンを追加uations。
4. ふたを閉め、システムが15分間平衡化することができます。
5. （ 図1Bに示す例を参照）、各マイクロピペット内の液体のレベルが表示されているので、スケールがあることを確認して、チャンバの写真を撮る。
6. 1〜2時間後、別の写真を撮る。
7. 実験が終了すると、呼吸計からハエを削除し、必要に応じて、重さや、さらに必要に応じてバイアルに戻ってそれらを転送します。

結果5。分析

1. オープンImageJソフトウェア^11を使用して画像^を取得しました。
2. 各写真にスケールを使用して、ソフトウェアでピクセルスケーリングを設定します。
3. 液体は初め（D1）で撮影された画像内の決定された基準点から移動した距離（ΔD）と実験終了（D2）を測定します。概略的な例を図1Cに示されている。
4. 式で（μL/ HR /飛ぶ）生成されるCO ₂の量を計算します。

センチメートルでマイクロピペット管のRは=半径
液体はセンチメートル単位で測定された試験試料のマイクロピペットで上に移動したΔD=距離
液体が（ハエなし）陰性対照試料のマイクロピペット中に移動した距離=Δcを
使用ハエのN =数
H =時間

結果

メソッドが敏感であることを示すために、我々は、野生型（ オレゴンR）からのCO ₂の生産は、男性は18、25、および29℃で飛んで測定され、DGと変異体を飛ぶ。ハエは、25℃で昇温し、測定前に5日間実験温度にシフトした。この外温性種について予想されるように、CO ₂の量は、温度（ 図2）に増加した産生した。我々は過去に、砂糖を含まない食事は?...

ディスカッション

このプロトコルでは、ハエにおけるCO ₂産生を測定するための安価で信頼性の高い方法を記載している。我々は、この実験が容易であることが見出さ行うことが迅速かつ他の研究^1,6,9と一致して再現性のあるデータを生成する。ここで概説したプロトコルは、簡単に任意の研究室の予算や利用可能な材料に合わせて変更することができます。各個々の呼吸の構成であれば、チャ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes	VWR	612-1413
Soda Lime	Wako	CDN6847
Eosine	Sigma	031M4359	Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber	VWR	21432-761	Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit	Flinn	FB1438
Power Gel Glue	Pritt
1 ml pipett tips	Any
Foam	Any
Plaesticine Putty	Any
Scalpel	Any
Tweezers	Any