Измерение скорости обмена веществ в<em&gt; Дрозофилы</em&gt; С помощью респирометрии

Резюме

Нарушения обмена веществ являются одним одним из наиболее распространенных заболеваний у людей. Генетически послушный модель организма Д. MELANOGASTER могут быть использованы для идентификации новых генов, которые регулируют обмен веществ. Эта статья описывает относительно простой метод, который позволяет изучать скорость метаболизма у мух путем измерения их производство CO _2.

Аннотация

Нарушения обмена веществ часто являются проблемой, затрагивающей здоровье человека. Таким образом, понимание механизмов, которые регулируют обмен веществ является одним из важнейших научной задачей. Многие гены болезнетворные у человека есть летать гомолог, что делает дрозофилы хорошей моделью для изучения сигнальных путей, участвующих в развитии различных заболеваний. Кроме того, уступчивость дрозофилы упрощает генетические экраны, чтобы помочь в идентификации новых терапевтических целей, которые могут регулировать обмен веществ. Для того чтобы выполнить такой экран простой и быстрый способ для идентификации изменения в метаболического состояния мух необходимо. В целом, производство углекислого газа является хорошим показателем расходы субстрат окисления и энергии предоставляя информацию о метаболического состояния. В этом протоколе введем простой метод для измерения CO ₂ выхода от мух. Этот метод может потенциально помочь в идентификации генетических возмущений, влияющих на скорость метаболизма.

Введение

Цикл биохимических Кребса генерирует АТФ за счет окисления ацетата, полученного из углеводов, жиров и белков, производящих CO _2. У дрозофилы O ₂ вход непосредственно коррелирует с CO ₂ выхода, и отражает уровень обмена веществ ^1. Таким образом, измерение CO ₂ выхода успешно применяется в исследованиях, связанных со старением и метаболизма ^2-5. Здесь наша лаборатория изменение ранее разработанные экспериментальные установки, что позволяет измерять CO ₂ производства в до восемнадцати проб, не требуя никакого специального оборудования. Другие и мы ранее использовали этот метод, чтобы показать различия в скорости метаболизма в мух, которые испытывают дефицит мышечной дистрофии, связанной белка, дистрогликана (DG) ^6-8.

O ₂ используется для окислительного метаболизма преобразуется в CO _2, который выбрасывается в качестве дыхательного отходов. Строительции ручной респирометров описано, что позволяет для определения скорости O ₂ потребляется. Мухи помещают в герметичный контейнер с веществом, которое абсорбирует СО ₂ исключен, эффективно исключает его из газовой фазы. Изменение объема газа (пониженное давление) измеряется перемещению жидкости в стеклянном капилляре, прикрепленной к закрытой респирометре.

Основным преимуществом этого метода по сравнению с другими является стоимость. Предыдущие исследования измеряется CO ₂ производства по дрозофилы с помощью газоанализаторов и технически совершенных респирометрии системы ^1,9. Несмотря на более сложного оборудования, чувствительность метода, описанного здесь аналогична сообщенных значений (табл. 1). Кроме того, несколько других групп использовали вариации этого метода для определения относительных скоростей обмена веществ в Drosophila ^4-6. Таким образом, этот анализ может быть использован для создания reliabле, воспроизводимые данные, относящиеся к Drosophila метаболизма без приобретения специализированного оборудования, которые могут быть установлены в любой лаборатории и могут быть использованы в образовательных целях.

В общем, принятые методы для определения метаболизм организма заключается в измерении CO ₂ производится, потребляется O _2, или оба ^,3,4,9. Хотя, можно предположить, что один эквивалент O ₂ генерирует один эквивалент CO _2, точное соотношение СО ₂ генерируется зависит от метаболического субстрата, используемого ^10. Таким образом, для точного определения скорости обмена веществ в энергетических единицах необходимо измерить как O ₂ потребляется и СО ₂ производится. В связи с этим, метод, описанный здесь, в частности, отношение к сравнивая различия в CO ₂ производства между животными и не абсолютного значения. Наша методика объединяет несколько животных СО ₂ производства в течение тиме (1-2 ч) и, следовательно, возвращает в среднем деятельности животных. Если есть основания полагать, что опытные животные менее активны, чем у контрольных животных измерение может отражать различные уровни деятельности и не обязательно метаболизм.

протокол

1. Подготовка респирометров

1. Разрежьте пипетки 1000 мкл с лезвием бритвы, чтобы можно было вставить в 50 мкл капиллярной микропипетки, попытайтесь получить пипетки как можно более прямо.
2. Место кусок пены в пипетку и толкать ее вниз в кончика пипетки.
3. Добавить небольшое количество абсорбента CO ₂ и содержать его на второй кусок пены.
4. Нанесите клей в месте, где микропипетки вставляется в наконечником пипетки.
5. Оставьте респирометре ночь, чтобы клей для просушки.
   Схематическое изображение респирометре показано на фиг.1А.

2. Подготовка измерительной камеры

1. Подготовьте камеру решение путем смешивания воды с эозином в соотношении, которое приведет к видимым раскрашивания.
2. Налейте раствор эозин / воды в камеру.
3. Этикетка одну из сторон камеры со шкалой сантиметр.

3. Размещение летит в респирометров

1. Этикетка индивидуальные респирометров с маркером.
2. Обезболить мух с использованием альтернативного метода в СО ₂ и поместите 3-5 мух желаемого генотипа внутри каждого респирометре.
3. Запечатайте респирометров плотно в верхней использованием пластилина замазку.
4. Разрешить мухи, чтобы оправиться от наркоза в течение примерно 15 мин.
5. Подготовьте респирометре без мух, которые будут использованы в качестве атмосферного управления.

4. Проведения эксперимента

1. Повесьте респирометров в камере путем присоединения 1,5 мл Eppendorf держатель трубки, которая открыта на верхней и нижней в верхней части камеры.
2. Вставьте респирометров кончиком пипетки вниз в камеру, позволяя верхушка погружаться в окрашенного раствора.
3. Добавить вазелин между крышкой крышкой и камерой, чтобы обеспечить более сильное изоляцию от температуры и давления fluctuations.
4. Закрыть крышку и позволить системе для уравновешивания в течение 15 мин.
5. Сфотографировать камеры, убедившись, что уровень жидкости внутри каждого микропипетки видна и так является шкала (см. пример, показанный на рисунке 1b).
6. После 1-2 часов, принять другую картину.
7. Когда эксперимент закончен, удалите мух от респирометров и весят при желании или передавать их обратно в пузырек, если это необходимо в дальнейшем.

5. Анализ результатов

1. Открыть полученных изображений с помощью программного обеспечения ImageJ ^11.
2. Используя шкалу в каждой картине, установите пикселей масштабирование в программном обеспечении.
3. Измерьте расстояние (SD), что жидкость путешествовал из определенной опорной месте в снимках, сделанных в начале (D1) и конец эксперимента (D2). Схематический пример показан на рисунке 1С.
4. Рассчитайте количество произведенного CO ₂ (мкл / ч / лету) с формулой:

R = радиус микропипетки трубы в сантиметрах
Δd = расстояние жидкость поднялась в микропипетки тестовых образцов измеряется в сантиметрах
Δc = расстояние жидкость поднялась в микропипетки образца отрицательный контроль (без мух)
п = количество мух, используемых
ч = часы

Результаты

Для того чтобы показать, что метод чувствителен мы измерили CO ₂ производства от дикого типа (Орегон R) мужской летает в 18, 25 и 29 ° C и летит мутанта для Dg. Мухи были подняты при 25 ° С и затем перенесен на экспериментальной температуре в течение 5 дней до измерений. Как и ожидало...

Обсуждение

В этом протоколе, мы описываем недорогой и надежный метод для измерения CO ₂ производства в мух. Мы обнаружили, что этот эксперимент просто, быстро провести и генерирует воспроизводимое данные, которые согласуются с другими исследованиями ^{1, 6, 9.} Протокол изложил здесь могут б?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes	VWR	612-1413
Soda Lime	Wako	CDN6847
Eosine	Sigma	031M4359	Any dye that can create visible colorization of liquid can be used
Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber	VWR	21432-761	Any transparent glass chamber that can be closed with the lid
Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit	Flinn	FB1438
Power Gel Glue	Pritt
1 ml pipett tips	Any
Foam	Any
Plaesticine Putty	Any
Scalpel	Any
Tweezers	Any