下部尿路薬理学を評価するための方法として膀胱平滑筋収縮ストリップ

要約

この原稿は、薬理学的薬剤または神経刺激に応答して平滑筋収縮性を評価するためのインビトロの方法で 、シンプルでありながらパワフルなを提示します。主な用途は、薬物スクリーニングと理解組織生理学、薬理学、病理学である。

要約

私たちは、 インビトロ膀胱平滑筋の収縮性を測定する方法、及び生理学的および薬理学的な平滑筋の特性ならびに病理学によって誘導された変化を調査するためのその使用を記載している。この方法は、外科的および薬理学的調製物の安定性および生存に影響を与える操作が、ヒト組織の使用、および/ ​​または高価な化学物質の使用のようなin vivo実験において遭遇する主要な方法論的な困難を克服しながら膀胱機能を理解するための重要な情報を提供する。また、健康的で病的状態で各袋コンポーネント（ すなわち 、平滑筋、粘膜、神経）の特性を調べるための方法を提供します。

膀胱は、麻酔した動物から取り出しクレブス溶液中に入れ、ストリップに切断される。ストリップは温かいKrebs溶液で満たされたチャンバ内に配置されている。一端はアイソメトリックtensioに取り付けられている収縮力を測定するためのn個のトランスデューサ、他端が固定されたロッドに取り付けられている。組織を直接浴にまたはインビボで膀胱収縮をトリガーに似神経を活性化する電場刺激電極によって化合物を添加することによって刺激される。個々の膀胱の成分の役割は、平滑筋活性の調節に関与する因子、発達中および実験的脊髄損傷後の神経伝達（関連する送信機および受容体）の性質を自発的平滑筋収縮性を評価するために、この方法の使用を実証する、と種との薬理学的薬剤に応答して、臓器の違い。さらに、それは伝達物質の放出の収縮および/または平滑筋の弛緩、薬物の構造活性相関評価に関与する細胞内経路を調査するために使用することができる。

in vitroでの平滑筋収縮法がfoは広く使用されている50歳以上のR、および大幅に膀胱機能の理解にも同様に、現在膀胱管理のために臨床的に使用される化合物の医薬開発に貢献したデータを提供してきました。

概要

膀胱平滑筋は、尿貯蔵及び契約は、尿排泄を誘発することができるように緩和する。リラクゼーションには、固有の平滑筋の特性によっておよび排尿筋におけるβアドレナリン受容体（ヒトにおける_β3 AR）を活性化する交感神経からのノルエピネフリンの持続放出（NE）によって媒介される。排尿は、交感神経入力を抑制し、膀胱平滑筋^1を収縮さ^せるアセチルコリン/ ATPを放出する副交感神経を活性化することによって達成される。脳および/ ​​または脊髄損傷、神経変性疾患、糖尿病、膀胱出口閉塞または間質性膀胱炎を含む多くの病理学的状態は 、重度の生命²の患者の質に深刻な影響を与え、膀胱機能を変化させることができる。平滑筋、求心性または遠心性神経および/またはこれらの条件は、膀胱の1つ以上の構成要素に影響を与えることにより、平滑筋の収縮性を変化させる粘膜。

膀胱機能を研究するin vivoおよびin vitroの方法にはいくつか開発されている。 インビボでは 、膀胱内圧測定は、膀胱機能の主要な測定である。これは生理的条件に近い条件下での情報の収集を可能にする無傷製剤であるが、平滑筋ストリップの使用が優先される状況が多数ある。これらは、外科的および/ ​​または薬理学的操作は生存およびインビボでの製剤の安定性、または影響を与える状況を含む研究は、ヒト組織または高価な化学薬品の使用を必要とする場合。この方法はまた、膀胱の各コンポーネントに対する薬剤、年齢や病状の効果の検討を容易にする平滑筋、粘膜、求心性及び遠心性神経、すなわち 。

膀胱ストリップは、科学的な質問の数に答えるために、多くのグループによって長年にわたって使用されてきた。彼らは、エヴァに使用された病理学によって誘導された筋原自発活動のluate変化。この活動は、過活動膀胱（OAB）の緊急性と周波数の症状に寄与すると考えられ、したがって、OAB ^3-9のために開発されて薬物のための標的である。膀胱ストリップはまた、イオンチャネルおよび/ ​​または平滑筋の弛緩または収縮のいずれかを誘導するために標的化され得る受容体および/ ​​または細胞内経路を発見する目的で、平滑筋緊張を調節する筋原性および神経因子を調査するために使用された^{3,10- 13。}他の研究では、送信機及び受容体関与しており、病理^14,15によって誘導された変更を含む、神経伝達の性質に焦点を当てている。さらに、この方法は、器官^19-21、および薬物の構造活性相関の評価の^22〜24の間、異なる種からの組織の^16〜18間の比較のために使用されてきた。この方法の拡張は、MEASURするために使用されている遠心性神経²⁵から伝達物質の放出に対する薬物の効果を電子。さらに、組織（膀胱、尿道、消化管、GI）（研究のために承認手術または臓器ドナー組織からの）動物またはヒトから採取し、脊髄損傷（SCI）、膀胱出口閉塞などの動物モデルの多様から多様な（BOO）、または間質性膀胱炎（IC）は、この技術を使用して調べることができる。

本論文では、上記のいくつかの科学的問題に対処するために、必要な実験プロトコルと一緒に、このメソッドの使用例を示します。

プロトコル

ここで説明するすべての手順は、ピッツバーグ大学のIACUC委員会により承認されています。

1。ソリューション

1. レシピに従ってKrebs溶液を調製します。 mM単位組成：NaClの118、塩化カリウム4.7、 _塩化カルシウム1.9、 _硫酸マグネシウム1.2、 _炭酸水素ナトリウム24.9、KH ₂ PO ₄ 1.2、ブドウ糖11.7。
2. 95％O _{2、5％CO 2}で曝気クレブスを、実験全体にわたって使用される37ºC水浴中に置き。脇に置く〜室温で曝気クレブス溶液200mlを組織切開に使用する。
3. 曝気クレブスのpH（〜7.4）と、浸透圧（〜300 mOsmで）を測定します。

2。実験セットアップ（回路図図1A）

1. （95％O _{2、5％CO 2）}を10mlのクレブスとチャンバー曝気埋める。
2. 37℃にチャンバを加熱する循環水ポンプを始動;アンプ（S）、刺激剤（：必要な機器の電源を入れるs）とレコーディングソフトウェア。
3. 1グラムの重量を有する変換器を校正します。

3組織（図1B）

：以下の手順に従って、大人のナイーブな女性のSprague Dawleyラット（〜10〜12週齢200〜250グラム）から膀胱を削除する

1. 解剖エリアと必要な器具の準備：電気カミソリ、歯鉗子、メスの刃、解剖ハサミ、microscissorsを、2解剖鉗子は、組織·クリップ（または絹縫合糸）、クレブスとしたシルガードコーティングされた解剖皿（著者は、デュモン鉗子＃3を好む）組織切開端子です。
2. 誘導チャンバー内のイソフルラン吸入（O ₂中4％）で動物を麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。継続的に反射を撤回呼吸数、外部刺激に応答して、リア四肢の喪失を観察することによって、麻酔のレベルを監視します。
3. 動物は、ひげをそる下腹部A麻酔をされた場合レア。腹部正中切開により骨盤臓器を公開します。膀胱と尿道を特定します。近位尿道の近くに膀胱頸部で切断することにより、膀胱を削除します。曝気クレブス溶液で満たされたシルガードコーティングされた皿に、すぐに組織を置きます。
4. 必要であれば、この時点で追加の組織を除去する：尿道、胃腸（GI）管および/ ​​または前立腺の断片など
5. IACUC承認された方法（ 例えば 、麻酔薬の過剰投与または二次の方法に続いてCO ₂窒息）を用いて動物を生け贄に捧げる。
6. さらに解剖のための組織を安定させるために、膀胱ドーム、首、尿管を通って組織切開のピンを挿入します。組織を伸ばさない。存在する場合、脂肪、結合組織、近位尿道および尿管を取り外します。
7. 平坦なシートを作成するためにドームにベースから膀胱を開き、漿膜側を下/腔側アップ（ 図1B）。組織の各コーナーに解剖のピンを配置します。膀胱D​​OMを削除するeと首組織。
8. 実験の目的は粘膜（尿路上皮と固有層-ダイアグラム図1Cを参照）の寄与を決定することである場合には、平滑筋収縮をして、添付粘膜ずに排尿筋ストリップの特性を比較。このために、帯状に組織を切断する前に、慎重にアイリスを用いて粘膜層を除去し、ハサミ、解剖顕微鏡下で、微細鉗子を春。実験の最後に、粘膜の完全な除去を確認するために、H＆E染色のためにストリップを固定します。この手順は、ラットの膀胱に比べて、マウスの膀胱内に簡単であることに注意してください。
9. 〜2×8ミリメートル（ 図1B）の短冊状にドームにベースから縦に組織を切断する。接続するか、各ストリップの両端に、組織のクリップを取り付けます。
   注：ワンラットの膀胱は、通常は4ストリップに切断することができますが、ストリップの数は、動物/膀胱サイズに応じて増減することができます。
10. EXPERにストリップを転送imental室。固定されたガラス/金属棒に組織収縮を測定する力変換器に各ストリップの一端を取り付け、その他。
    注：組織チャンバーのサイズは（20ミリリットル以上0.2 ml）を変化させる。げっ歯類ブラダーのための典型的なチャンバーは完全に溶液中に浸漬するストリップのために十分な高さを提供する5〜20ミリリットルである。一部のチャンバーは、内蔵の刺激電極と他人をしない来る。ケアは、特に電場刺激が信頼できない、電極のすべての接続が良好な状態であることを保証するために注意すべきである。
11. ベースライン張力が1g（〜を10mN）に達するまで穏やかに組織を延伸することによって、各ストリップに力が規定量を適用する。当初は組織は、ベースラインの張力の減少として記録されているリラックスする傾向がある。ウォッシュ暖かい曝気クレブスを用いて組織ごとに約15分であり、各洗浄後に1グラムのベースライン張力を調整すること。 （ベースラインテンションが安定している組織は〜のために1〜2時間まで、または平衡化することを許可するすなわち 、それ以上の組織弛緩）。
12. 直接〜5分間浴、またはプラトー応答が到達するまでのKCl（80ミリモル）を添加することにより、試験組織の生存率。 KClを高濃度に応答も実験中または実験の最後に反復し（データ解析部の下に正規化を参照）、他の薬物またはストリップ間の応答を正規化するために使用することができる。
13. 組織が前処理条件に戻れるようにする温かい曝気クレブスで洗う組織を複数回（3-5x）。

4。刺激プロトコル

1. 自発的な筋原性活動や平滑筋緊張に対する病理学の影響を調査するために、平滑筋などのSCI、BOOなどの異なる動物モデルからのストリップ、または新生児を使用します。 図2に、開発中に膀胱の自発活動の変化を調査するためにこの方法を使用することを示し、 SCI後。さらに、薬理学的薬剤は、種を調節するために使用され得るontaneous活動。 図3に、自発的な活動と平滑筋の緊 ​​張に、KCNQチャネル調節、フルピルチンとXE991の効果を示す。
2. 定義された時間間隔で浴に直接濃縮ストック溶液から化合物を添加することにより薬理平滑筋刺激コンストラクト濃度応答曲線である。車両や時間の影響を考慮するために平行なストリップに薬物および車両を使用してください。
   1. 1000倍の最終使用濃度において所望の試験化合物のストック溶液を作る。 10 ^-5 M、3×10 ^-5 M、10 ^-4 M、3×10 ^-4 M、10 ^-3 M、3×10 ^-3 M：カルバコール（CCH）、ムスカリン性受容体作動薬は、以下のストックを調製、10 ^-2 M.浴中の最終濃度は10 ^-5 M（ 図4C、D）を10 ^-8 Mである。 10 ^-8 M、10 ^-7：ニューロメジンB（NMB）、ボンベシン受容体サブタイプ1アゴニストは、以下の株式を準備M、10 ^-6 M、10 ^-5 M、10 ^-4 M、10 ^-3 Mと浴中の最終濃度である10 ^-11 M〜10 ^-6 MのCChとNMB両方は、組織の収縮性を増加することが予想される。
   2. 10ミリリットル組織槽の場合は、できるだけ早く応答がプラトー（ 図4C、D）に到達するように、各制御CHのストック溶液10μlを加える。平行なストリップでは車両の等量（水）を追加します。同様に、各ニューロメジンBストック溶液10μl毎〜5分を追加します。
      注： 図4の異なる種からのストリップにおける平滑筋緊張に対するNMBとのCChの興奮効果を観察します。
   3. 興奮剤は、通常のCChまたはKClで予め収縮組織中の平滑筋の弛緩特性を調査します。
   4. アゴニスト応答をブロックするには、事前のアゴニスト刺激に対する組織の浸透を、可能にするためにアンタゴニストで10〜20分間、組織を前処理。
3. 神経stimのためにまた、電場刺激（EFS）と呼ばれる平滑筋のulationは、3.13〜ステップ1に従い、以下に説明するように継続する。 EFSを選択的に平滑筋に対する神経を活性化することを意図している。刺激のパラメータは、慎重に直接平滑筋の刺激を避けるように選択すべきである。
   1. 刺激パラメータを確立します。刺激のタイプ（単一パルスまたは電車）、持続時間（パルス持続時間と列持続時間）、頻度と強度は、以下の手順で説明し、 図5A、Bに示すように。
      1. 単一パルス刺激は、パルス持続時間、刺激間間隔および所望の刺激の数を設定する。通常の刺激持続時間パラメータは、所望の間隔（ 図5A）で供給0.05〜0.3ミリ秒の持続時間の単一のパルスである。刺激強度に対するステップ4.3.1.4に従ってください。
      2. 列車の刺激のために、列持続時間およびインタートレイン間隔を設定します。膀胱組織の典型的な値は3〜10秒には、少なくとも1メートルを配信されます離れにある（ 図5B）。組織疲労が（ つまり、EFS収縮が制御期間中に減少）が発生した場合は、インタートレイン間隔を増やします。
      3. 電車の中で列車の刺激の周波数（パルスの数を確立 - 図5B）。 0.5〜50 Hzの範囲の周波数応答曲線を実行します。膀胱のための典型的な周波数は、ATPとのAChによって仲介再現性のある安定した収縮を与える10-20 Hzである。この方法は、コリン作動性神経伝達にプリンのメカニズムの寄与を評価するために使用できる方法を示す図5のマウスの膀胱ストリップにおけるEFS刺激に対する周波数依存応答を観察します。
      4. 刺激の強度を確立する：（使用して列車は周波数を一定に保つ場合）収縮の振幅がプラトーに達するまで体系的に刺激の強度（電圧）を増大させる。
      5. に応じて刺激の強さを設定実験の目的。目的は、神経誘発収縮を増加させることである場合には、収縮の振幅が最大収縮の約50％であるような準最大強度を使用する。目的は、神経誘発収縮を減少させることである場合は、組織の疲労を回避するために、最大振幅の〜80％に強度を設定する。
   2. 刺激パラメータ（期間、頻度と強度）が確立されると、EFS-のため20〜30分は、薬物検査の前に安定させるために収縮を誘発〜許す。
      注：Na ^{+チャネル}遮断薬で、神経伝達を遮断、神経伝達のためにEFSの選択性を確認するには、テトロドトキシン（TTX; 0.5〜1μM）。 TTXは、比較的簡単に洗い流すように、実験開始時にこの手順を実行します。また、（ステップ4.3.5を参照してください。下の）実験の最後に、これを実行します。
   3. のために1,000倍の最終作業濃度でストック溶液を準備します。アルファ、ベータメチレンATP（ABMA;プリン受容体活性化剤と減感）10 ^-2 M、アトロピン（ムスカリン受容体拮抗薬）10 ^-3 M（ 図5C）。図6の他の例を観察する。5HT4受容体アゴニスト、シサプリド（3×10 ^-6 M、10 ^-6 Mを、3×10 ^-5 M、10 ^-5 M、3×10 ^-4 Mを、10 ^-4 M、 3×10 ^-3 M、10 ^-3 M）は、組織の収縮およびSB-203186（3×10 ^-3 M）、5HT4受容体拮抗薬が増加しシサプリドの効果を逆転させる。
   4. EFS（ 図5C）にABMAおよびアトロピンの効果を試験するために、2つの制御周波数応答曲線を実行する。 10μMの最終濃度浴に10 ^-2 M ABMA10μlのを追加します。これは、平滑筋におけるプリン受容体の直接刺激に組織を収縮する。ベースラインへの応答が戻った後、周波数応答曲線を繰り返す。最後のconcentrat 10 ^-3 Mのアトロピン10μlのを追加1μMのイオン。 （ムスカリン受容体を遮断するアトロピンのために必要）〜10分後、周波数応答曲線を繰り返す。平行なストリップでは、各ステップにおいて、車両、水10μlを加える。
      注： 図6の他の例については、定義された時間間隔で、各シサプリドストック溶液10μlを加える（〜15分毎に、説明を参照）、お風呂に直接SB-203186のストック溶液10μlが続き、に対するそれらの効果を監視するEFS誘発収縮。平行なストリップでは車両のDMSO 10μlを加える。シサプリドの効果を観察し、 図6のヒト膀胱と回腸組織におけるEFS誘発収縮に対する5HT4受容体作動薬は、。さらに、ヒト膀胱および回腸組織におけるEFS誘発収縮に対するDMSOの影響、シサプリドのための車両を観察。
   5. EFSプロトコルの終わりに、Na ^{+チャネル}遮断薬、テトロドトキシン（TTXで神経伝達を遮断することにより、EFSの選択性を検証する。0.5-1＆＃181; M）。 TTX抵抗性の収縮がまだ存在している場合は、その後の実験では、刺激の持続時間と強度を調整することをお勧めします。
4. 前または後シナプス部位（ 図7A）に対する薬物の効果を測定するために4.3.2ステップ1に従ってください。カルバコールとEFSに再現性のある反応を確立し、その後、薬物Xを追加
5. 実験の最後に、クリップを取り除くまたはストリップをほどく、余分な液を除去し、天秤を使用して各ストリップの重量を測定するためにティッシュ紙の上にそっとブロット。また、断面積を決定するために、キャリパーを用いて組織の長さを測定する。この情報は、データの正規化のために使用されます（セクション5.4を参照）。

5。データ解析

適切なソフトウェア（ 例えば 、Windaq、LabChartの）を使用してデータを分析します。

1. 自発的活動のために、薬剤誘発性応答のピークの前とで少なくとも30秒のウィンドウを選択してくれASURE振幅と筋原性活動の頻度（ 図3）。
   1. 膀胱の異なる部分の間に相違がある応答の収縮性かどうかに寄与する周波数のスペクトルを決定するために、高速フーリエ変換解析を使用して（ 例えば 、首対ドーム）または開発、病理学、および薬⁸である。
2. 平滑筋の緊張への影響については前と薬剤誘発性応答のピークで少なくとも10〜30秒のウィンドウを選択し、収縮の振幅を測定。
3. 神経誘発収縮に対する効果について（少なくとも3）の前に、薬剤誘発性応答のピーク時に収縮の曲線下振幅、持続時間と面積を測定します。
   NOTE：プリン作動性およびコリン作動性の成分が異なる速度を持っているので、EFS誘導性収縮の振幅曲線下面積の両方を測定する必要がある。プリンコンポーネントは迅速かつ一過性である（ATPはpurinergiを活性化させるカルシウムの迅速な流入を可能にするようなP2X1などのCイオンチャネル型チャンネルは、それらは、このように曲線下面積に対するピーク振幅応答に対してより少ない貢献、）脱感作。コリン作動性成分（アセチルコリンが最終的に収縮を誘導するために、平滑筋を脱分極イオンチャネルを活性化する細胞内経路を活性化するために多くの時間を必要とする代謝型ムスカリン受容体を活性化する）遅く、持続的である。このように、ムスカリン性成分は曲線下面積を測定することによって、より良いキャプチャされます。
4. ストリップ及び薬理学的治療を横切っ結果を比較することができるようにデータを正規化する。正規化のために選択されたパラメータは、病理学的状態を研究や実験計画、試験化合物によって影響されるべきではありません。これらのパラメータのうち、利用ストリップの重量、断面積、塩化カリウム応答（ 図4B）、最大応答（ 図7B）の％または別の収縮剤に対する最大応答の％（ 例えば 、のCCh）やリラックス剤（ 例えば 、パパベリン）。

結果

自発筋原アクティビティ

自発筋原活性は生後発達^6-9および病理学的変化（ 例えば ^{、SCI、BOO）3-5を}受ける重要な平滑筋の特徴である。この活性は、過活動膀胱^（OAB）2の症状に寄与すると考えられるので、それを調節する受容体、細胞内経路及び薬理学的薬剤の評価は、OABおよびその他の平滑筋機能障害のための有効な治療を?...

ディスカッション

本論文では、膀胱生理学および病理学に関連する重要な科学的問題の数だけでなく、膀胱機能不全を治療する新薬の発見を助けるに対処するために使用することができ、簡単なin vitroでの平滑筋収縮方法を説明した。私たちは、膀胱平滑筋の収縮（ 図2-4）、神経伝達変調（ 図5-7A）、種差（ 図4）、臓器差（ 図6）、発達病理学的およ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir	Radnoti, LLC	159920	isolated tissue baths
Warm water recirculator pump	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton System	DataQ Instruments	DI-710-UH	To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	Transducer amplifier
Grass stimulator	Grass Technologies	Model S88	Stimulator
Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box	Harvard Apparatus	500116	To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks	Kent Scientific Corporation	AC-09508	To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
Sylgard	Dow Corning Corp	184 SIL ELAST KIT	To pin, dissect, & cut tissue
Petri Dish	Corning	3160-152	To dissect/cut tissue
Insect Pins	ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins	Size 5	To pin tissue
Bench Pad	VWR International	56617-014	Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500064	To remove and dissect tissue
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500092	To remove and dissect tissue
Scalpel	Kent Scientific Corporation	INS500236	To remove and dissect tissue
Scalpel blade	Kent Scientific Corporation	INS500239	To remove and dissect tissue
Professional Clipper	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	To remove fur
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Tie tissue
Tissue Clips	Radnoti, LLC	158802	Attach tissue to rod/transducer
1 g weight	Mettler Toledo	11119525	For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride	Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	To prepare Krebs solution
Isoflurane	Henry Schein	029405	To anesthetesize the animal
Oxygen tank	Matheson Tri Gas	ox251	To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	To aerate Krebs solutions