하부 요로 약리학을 평가하는 방법으로 방광 평활근 스트립 수축성

요약

이 원고는 약리학 제제 또는 신경 자극에 반응하여 평활근 수축을 평가하기위한 시험 관내 방법에있어서, 간단하지만 강력한을 제시한다. 주요 응용 프로그램은 약물 검사 및 이해 조직 생리학, 약리학, 병리학이다​​.

초록

우리는 체외 방광 평활근 수축을 측정하는 방법, 및 약리학 적 및 생리 평활근의 성질뿐만 아니라 병리학 적 변화에 의한 조사에 대한 사용을 설명한다. 이 방법은 수술 및 약리학 적 제제의 안정성 및 생존에 영향을 조작, 인체 조직의 사용 및 / 또는 고가의 화학 물질의 사용과 같은 생체 내 실험에서 발생 주요 방법론적인 어려움을 극복하면서, 방광 기능을 이해하는데 중요한 정보를 제공한다. 또한 건강하고 병적 조건의 각 방광 성분 (즉, 평활근, 점막, 신경)의 성질을 조사하는 방법을 제공한다.

방광은 마취 된 동물, 크렙스 용액에 넣고, 스트립으로 절단 제거한다. 스트립 따뜻한 크렙스 용액으로 채워진 챔버에 배치됩니다. 일단 아이소 장력에 부착수축력을 측정하는 n 개의 트랜스 듀서, 타단은 고정 된로드에 부착된다. 티슈 직접 목욕 또는 생체 내에서 방광 수축을 유발 유사한 신경을 활성화 전기장 자극 전극에 의해 화합물을 추가로 자극한다. 우리는이 방법의 사용은 발전 과정 및 실험 척수 손상 후 자발 평활근 수축을 평가 보여, 신경 전달 (관련된 송신기 및 수용체), 평활근 활성의 조절에 관여하는 인자의 성질, 개별 블래 성분의 역할 종 및 약리 에이전트에 응답 기관의 차이. 또한, 송신기는 릴리스 수축 및 / 또는 평활근의 이완, 약물 구조 활성 관계 및 평가에 관련된 세포 내 경로를 조사를 위해 사용될 수있다.

체외 평활근 수축 방법은 광범위하게 사용되어왔다 FO오십년 이상 R, 크게 방광 기능에 대한 우리의 이해뿐만 아니라 현재 방광 관리를 위해 임상 적으로 사용되는 화합물의 제약 발전에 기여 데이터를 제공하고 있습니다.

서문

방광 평활근 소변 제거를 유도하기 위해 소변의 저장을 허용하도록 완화하고, 계약. 휴식은 내장 평활근 속성으로하고 배뇨근 베타 아드레날린 수용체 (β 인간의 ₃ AR)을 활성화 교감 신경에서 노르 에피네프린 (NE)의 토닉 릴리스에 의해 매개된다. 보이드는 교감 입력을 억제하고 아세틸 콜린 / ATP는 방광 평활근 ^일을 계약을 해제 부교감 신경을 활성화함으로써 달성된다. 뇌 및 / 또는 척수 손상, 신경 변성 질환, 당뇨병, 방광 출구 폐색 또는 간질 성 방광염 등 다양한 병적 상태, 뿌리깊 ^수명이 환자의 품질에 심각한 영향을주지 않고, 방광 기능을 변경할 수있다. 평활근, 원심성 또는 구 심성 신경 및 / 또는 이러한 조건은 하나의 블래 더에 영향을 미치는 요소에 의해 평활근의 수축을 변경할점막.

생체 내 및 방광 기능을 연구하기위한 생체 외 방법에서 여러 가지가 개발되어왔다. 생체은 방광 내압 측정은 방광 기능의 기본 측정이다. 이는 생리적 조건 하에서 주변 정보의 수집을 허용 그대로 제제이더라도, 평활근 스트립의 사용이 바람직하다하는 상황들이있다. 이러한 수술 및 / 또는 약리학 적 조작이 생존과 생체 제제의 안정성, 또는 영향을 미칠 수있는 상황을 포함 연구는 인간의 조직 또는 고가의 화학 물질의 사용을 필요로 할 때. 이 방법은 또한 방광의 각 구성 요소에 대한 약물, 나이 및 병리 효과 시험을 용이하게, 평활근, 점막, 원심성 및 구 심성 신경 즉.

방광 스트립은 과학적 질문에 대답 할 수 많은 그룹으로 수년에 걸쳐 이용되어왔다. 그들은 에바에 사용되었다근원 성 자발적인 활동 luate 변경 병리에 의해 유도. 이 활동은 과민성 방광 (OAB)의 긴급 및 주파수 증상에 기여하는 것으로, 따라서 OAB ^3-9 개발되고 약물의 대상이다. 방광 스트립 또한 이완 또는 평활근 수축를 유도하는 대상이 될 수있는 이온 채널 및 / 또는 수용체 및 / 또는 세포 내 경로를 발견 할 목적으로 평활근 톤을 변조 근육 조직 및 신경 세포의 요인을 조사하기 위해 사용 하였다 ^{3,10- 13.} 다른 연구는 병리 ^{(14, 15)에} 의해 유도 된 송신기와 관련된 수용체 및 변경을 포함하여 신경 전달 물질의 특성에 초점을 맞추고있다. 또한,이 방법은 장기 ^19-21과 약물 구조 - 활성 관계의 평가 사이 ^{22-24, 16} 종 ^{(18)로부터의} 조직 사이의 비교를 위해 사용되어왔다. 이 방법의 확장은 지표 성과 데 사용되었습니다원심성 신경 송신기 ^{(25)로부터} 방출에 약물의 효과를 전자. 또한, 조직 (방광, 요도, 위장관, GI) (연구 승인을 수술 또는 장기 기증 조직부터) 동물이나 인간에서 수확 및 척수 손상 (SCI), 방광 출구 폐색을 포함한 동물의 다양한 모델에서 다양한 (BOO), 간질 성 방광염 (IC)은이 기술을 이용하여 조사 할 수있다.

본 논문에서는 위에서 언급 한 여러 과학적인 문제를 해결하기 위해 필요한 실험 프로토콜과 함께이 방법의 사용을 예시한다.

프로토콜

여기에 설명 된 모든 절차는 피츠버그 대학에서 IACUC위원회에 의해 승인됩니다.

1 솔루션

1. 법에 따라 크렙스 솔루션을 준비합니다. 염화나트륨 (118)의 KCl 4.7, _염화칼슘 1.9, _황산 1.2, _탄산 수소 나트륨 24.9, KH ₂ PO ₄ 1.2, 포도당 11.7 : MM의 조성.
2. 95 % O _2, 5 % CO ₂ 크렙스을 공급하십시오 및 실험을하는 동안 사용되는 37 ºC 물을 욕조에 넣습니다. 제쳐 놓고 ~ 실온에서 폭기 된 크렙스 용액 200 ㎖를 조직 절제술에 사용되는.
3. 화난 크렙스의 산도 (~ 7.4)와 삼투압 (~ 300 mOsm)를 측정한다.

2 실험 장치 (회로도 그림 1A)

1. (95 % O _2, 5 % CO ₂₎ 10 ㎖의 크 레브와 챔버 화난 채 웁니다.
2. 37 ° C에 챔버를 가열하는 순환 수 펌프를 시작합니다; 필요한 장비를 켜 : 앰프 (들), 자극 (들) 및 기록 소프트웨어입니다.
3. 1g의 무게와 트랜스 듀서를 보정합니다.

3 조직 (그림 1B)

다음 단계 다음 (~ 10~12주 이전 200~250g) 성인 순진한 여성 스프 라그 돌리 쥐에서 방광을 제거

1. 해부 영역과 필요한 장비 준비 : 전기 면도기, 치아 포셉, 메스 블레이드, 해부 가위, microscissors을,이 해부 집게, 조직 클립 (또는 실크 봉합사), 크렙스와 함께 실 가드 코팅 해부 접시 (저자는 뒤몽 집게 # 3를 선호) 조직 해부 핀입니다.
2. 유도 챔버에서 흡입 이소 플루 란 ₍₂ O 4 %)으로 동물을 마취. 마취 동안 건조 함을 방지하기 위해 눈에 수의학 연고를 사용합니다. 연속 호흡율, 외부 자극에 응답하고, 휘어진 인출 후방 사지의 손실을 관찰함으로써 마취의 레벨을 모니터링한다.
3. 동물 면도 하복부 마취 할 때정말이에요. 중간 선 복부 절개를 통해 골반 장기 노출. 방광과 요도를 확인합니다. 근위부 요도에 가까운 방광 경부에서 절단하여 방광을 제거합니다. 화난 크렙스 솔루션을 가득 실 가드 코팅 접시에 즉시 조직을 놓습니다.
4. 필요한 경우,이 시점에서 추가적인 조직을 제거 : 요도, 위장 (GI) 관 및 / 또는 전립선 조각 등
5. IACUC 승인 된 방법 (예를 들면, 마취제 또는 과다 보조 방법이어서 질식 CO _2)를 사용하여 동물을 희생한다.
6. 더 해부 조직을 안정시키기 위해, 방광 돔, 목, 및 요관을 통해 조직을 해부 핀을 삽입합니다. 조직을 늘리지 않습니다. 지방, 결합 조직, 근위부 요도, 요관하고있는 경우를 제거합니다.
7. 플랫 시트를 만드는 돔 기지에서 방광을 열고 장막면이 아래 / 내강면을 위로 (그림 1B). 조직의 각 모서리에 해부 핀을 놓습니다. 방광 돔을 제거전자와 목 조직.
8. 실험의 목적은 점막 (요로 상피 및 고유 층 - 다이어그램도 1C 참조)의 기여를 결정하는 경우 평활근 수축을, 함께 및 장착 점막없이 배뇨근 스트립의 특성을 비교한다. 이를 위해, 조직 스트립을 절단하기 전에 신중 홍채 해부 현미경 하에서 미세 가위 집게를 사용하여 스프링 점막층을 제거. 실험의 끝에, 점막의 완전한 제거를 확인하기 위해 H & E 염색 용 스트립을 고정한다. 이 절차는 쥐의 방광에 비해 마우스 방광에서 쉽게합니다.
9. ~ 2 × 8mm (그림 1B)의 스트립으로 돔 기지에서 세로로 조직을 잘라. 넥타이 또는 각 스트립의 양단에 조직 클립을 첨부합니다.
   NOTE : 한 래트 방광은 보통 4 스트립으로 절단 할 수 있지만, 스트립의 수는 증가하거나 감소 동물 / 방광 크기에 따라.
10. exper에 스트립 전송imental 실. 한 조직의 수축을 측정하는 힘 센서, 각 스트립의 끝과 고정 유리 / 금속 막대에 다른 연결합니다.
    참고 : 조직 챔버의 크기 (20 ㎖의 이상으로 0.2 ml)에 따라 다릅니다. 쥐의 방광에 대한 일반적인 챔버 스트립이 완전히 용액에 침수 될 충분한 높이를 제공하는 5 ~ 20 ㎖의입니다. 일부 챔버 내장 자극 전극, 다른 사람 없습니다에게 제공됩니다. 케어 달리 전계 자극이없는 신뢰성, 전극의 모든 접속 상태가 양호한 것을 확인해야한다.
11. 베이스 라인 장력이 1g (~ 10 MN)이 도달 할 때까지 부드럽게 조직을 스트레칭하여 각 스트립에있는 힘의 정의 금액을 적용합니다. 처음에 조직은 기준선 장력의 감소로 기록되어있는 이완되는 경향이있다. 워시 조직은 약 및 따뜻한 폭기 크렙스를 사용하여 15 분마다 각 세척 후 1g 기준선 장력을 조정합니다. (기준 긴장이 안정적 조직 ~ 1-2 시간이나 때까지 평형을 허용즉, 더 이상의 조직 휴식).
12. ~ 5 분간, 또는 고원 응답까지 조에 직접의 KCl (80 ㎜)에 추가하여 시험 조직 생존력이 도달된다. 고농도의 KCl에 대한 응답은 또한 실험 동안 또는 실험의 끝에서 반복 (데이터 해석 부 밑에 정규화 참조) 스트립 다른 약물에 대한 반응을 정규화 또는 사이에 사용될 수있다.
13. 따뜻한 화난 크렙스 씻을 조직을 여러 번 (3-5x)는 조직 전처리 조건에 반환 할 수 있습니다.

4 자극 프로토콜

1. 이러한 SCI, BOO 또는 신생아와 같은 다른 동물 모델에서 평활근 스트립을 사용, 자연, 근원 활동이나 평활근에 병리의 효과를 알아보고자 하였다.이 그림은 개발하는 동안 방광 자발적인 활동의 변화를 조사하기 위해이 방법을 사용하는 방법을 보여줍니다 및 SCI 후. 또한, 약학 제제는 SP를 변조하는데 사용될 수있다ontaneous 활동.도 3은 자발 활동 및 평활근 톤 KCNQ 채널 변조기, flupirtine 및 XE991,의 효과를 도시한다.
2. 직접 정의 된 시간 간격으로 목욕 농축 원액으로부터 화합물을 첨가함으로써 약리학 평활근 자극 구조체 농도 반응 곡선. 차량 및 시간 효과를 설명하기 위해 병렬 스트립에 약물 및 차량을 사용합니다.
   1. 1000X 최종 작업 농도에서 원하는 시험 화합물의 원액을 확인합니다. ^10-5 M, 3 × ^10-5 M, ^10-4 M, 3 × ^10-4 M, ^10-3 M, 3 × ^10-3 M : 카바 콜 (CCH), 무스 카린 수용체 작용제를 들어, 다음과 같은 종목을 준비 10 ^-2 M. 욕실에서 최종 농도는 10 ^-5 M (그림 4C, D)에 10 ^-8 M이다. ^10-8 M, ^10-7 : 뉴로 메딘의 B (NMB), 봄베 신 수용체 서브 타입 1 작용제를 들어, 다음과 같은 주식을 준비M, ^10-6 M, ^10-5 M, ^10-4 M, ^10-3 M 및 욕조에 최종 농도 아르 10 ^-11 M에서 10 ^-4 M. CCH와 NMB 모두 조직의 수축력을 증가 할 것으로 예상된다.
   2. 응답이 고원 (그림 4C, D)에 도달로 10 ml의 조직 목욕하는 순간 각 CCH 원액의 10 μl를 추가합니다. 병렬 스트립에서 차량 (물)의 같은 양을 추가합니다. 마찬가지로, 각 뉴로 메딘의 B 원액의 10 ㎕의 모든 ~ 5 분을 추가합니다.
      참고 : 그림 4 종에서 스트립의 평활근에 NMB와 CCH의 흥분성 효과를 관찰한다.
   3. 흥분 에이전트, 일반적으로 CCH 또는 KCl을 사전 계약 조직의 평활근의 이완 특성을 조사합니다.
   4. 길항제 반응을 차단하는, 자극 작용제 전에 조직 침투를 허용하기 위해 길항제 10-20 분 동안 조직을 전처리.
3. 신경 STIM을 위해평활근의 위험률도라는 전기장 자극 (EFS) 3.13에 단계 하나를 따라 아래에 설명 된대로 계속합니다. EFS는 선택적 평활근에 비해 신경을 활성화하기위한 것입니다. 자극 파라미터는주의 깊게 평활근에 직접 자극을 피하도록 선택되어야한다.
   1. 자극 매개 변수를 설정 : 아래 단계에 설명도 5A, B에 도시 된 바와 같이 자극 (단일 펄스 또는 기차), 기간 (펄스 지속 시간 및 열차 시간), 빈도와 강도의 유형을.
      1. 단일 펄스 자극, 세트 펄스 지속 시간, 간 자극 간격과 원하는 자극의 수하십시오. 통상, 자극 지속 기간 파라메터는 원하는 간격 (도 5a)에 전달 0.05-0.3 msec의 지속 기간의 하나의 펄스이다. 자극 강도에 대한 단계 4.3.1.4을 따르십시오.
      2. 기차 자극의 경우, 기차 시간 간 열차 간격을 설정합니다. 방광 조직에 대한 일반적인 값은 3-10 초는 적어도 1m를 전달떨어져에서 (그림 5B). 조직의 피로 (즉, EFS 수축 제어 기간 동안 감소)가 발생하는 경우, 간 열차 간격을 증가시킨다.
      3. 기차에서 펄스의 기차 자극의 주파수 (번호를 설정 - 그림 (b)). 0.5-50 Hz에서 범위의 주파수 응답 곡선을 실행. 방광의 일반적인 주파수는 ATP 및 아세틸 콜린에 의해 매개 재현하고 안정적​​인 수축을주고 10 ~ 20 Hz에서입니다. 이 방법은 콜린성 및 신경 전달에 퓨린 메커니즘의 기여를 평가하는 데 사용할 수있는 방법을 보여주는 그림 5에서 마우스 방광 스트립 EFS의 자극에 따라 주파수 응답을 관찰한다.
      4. 자극 강도를 확립 : 수축의 진폭이 정체기에 도달 할 때까지 (하여 열차의 주파수를 일정하게 유지하는 경우) 체계적 자극의 세기 (전압)을 증가시킨다.
      5. 에 따라 자극의 강도를 설정합니다실험의 목표로하고 있습니다. 목표 - 유발 신경을 수축을 증가시키는 경우, 수축의 진폭이 최대 수축 ~ 50 %가되도록 준 최대 강도를 사용한다. 목표 - 유발 신경을 수축을 감소시키는 경우, ~ 최대 진폭의 80 %가 조직의 피로를 방지하기 위하여 강도를 설정한다.
   2. 자극 매개 변수 (기간, 빈도와 강도)가 설립되면, EFS- 20 ~ 30 분 약물 검사 전에 안정 수축을 유발 ~ 수 있습니다.
      참고 : (; 0.5 μM TTX) 신경 전송, 나 ^{+ 채널} 차단제, 테트로도톡신와 블록 신경 전송을위한 EFS의 선택을 확인합니다. TTX 비교적 쉽게 떨어져 세척 같이, 실험의 시작에서이 단계를 수행한다. 또한, (단계 4.3.5 참조. 아래) 실험의 끝에이를 수행.
   3. 최종 작업 농도가 1,000 배의 재고 솔루션을 준비 : 알파, 베타 - 메틸렌 ATP (ABMA, 퓨린 수용체의 활성화를및 desensitizer) 10 ^-2 M, 아트로핀 (무스 카린 수용체 길항제) 10 ^-3 M (그림 5C). 도 6에 다른 예를 관찰한다. 5HT4 수용체 작용제, 시사 프라이드 (3 × ^10-6 M, ^10-6 M을, 3 × ^10-5 M, ^10-5 M, 3 × ^10-4 M을, ^10-4 M, 3 × ^10-3 M, ^10-3 M)는, 조직 수축성 및 SB-203186 (3 × ^10-3 M), 5HT4 수용체 길항제를 증가 시사 프라이드의 효과를 반전.
   4. EFS (그림 5C)에 ABMA의 효과와 아트로핀을 테스트하려면, 두 개의 제어 주파수 응답 곡선을 수행합니다. 10 μM의 최종 농도에 화장실에 10 ^-2 M ABMA의 10 μl를 추가합니다. 이는 평활근에 직접 퓨린 수용체의 자극에 조직을 수축한다. 기준에 대한 응답을 반환 한 후, 주파수 응답 곡선을 반복합니다. 최종 정광 10 ^-3 M의 아트로핀의 10 μl를 추가1 μM의 이온. (무스 카린 수용체를 차단하기 위해 필요한 아트로핀) ~ 10 분, 반복 주파수 응답 곡선 후. 병렬 스트립의 각 단계에서, 차량, 물 10 μl를 추가합니다.
      NOTE :도 6의 다른 예를 들어, 정의 된 시간 간격들 (~ 15 분마다, 설명을 참조)에서 각 시사 프라이드 스톡 용액 10 μL를 추가 직접 조에 SB-203186 스톡 용액 10 ㎕를 다음과에 미치는 영향을 모니터링 수축을 EFS는 유도. 병렬 스트립에서 자동차, DMSO의 10 μl를 추가합니다. 시사 프라이드의 효과를 관찰,도 6 인간 방광과 회장 조직에서 EFS-유발 된 수축에 대한 5HT4 수용체 작용제는. 또한 인간 방광 및 회장 조직에서 EFS-유발 된 수축에 DMSO의 효과, 시사 프라이드 용 차량을 관찰 .
   5. EFS 프로토콜의 끝에 나트륨 ^{+ 채널} 차단제, 테트로도톡신 (TTX으로 신경 전달을 차단하여 EFS의 선택성을 확인; 0.5-1 &# 181; M). TTX에 강한 수축이 남아있을 경우, 이후의 실험에서 자극의 지속 시간과 강도를 조절하는 것이 좋습니다.
4. 사전 또는 사후 시냅스 사이트 (그림 7A)를 약물의 효과를 결정하기위한 4.3.2 단계 1을 따르십시오. 카르 바콜하는 재현 응답을 설정하고 EFS는 다음 약물 X를 추가
5. 실험의 끝에, 또는 클립을 풉니 스트립을 풀어, 여분의 유체를 제거하고 나머지를 사용하여 각 스트립의 중량을 측정하는 티슈 종이 위에 부드럽게 그들을시킨다. 또한 단면적을 결정하는 캘리퍼스를 사용하여 조직의 길이를 측정한다. 이 정보는 데이터의 정상화를 위해 사용된다 (5.4 절 참조).

(5) 데이터 분석

적절한 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하여 (예를 들어, Windaq, LabChart).

1. 자발적 활동의 경우, 이전과 약물에 의한 반응과 나의 절정에 적어도 30 초 창을 선택슈어의 진폭과 근육 조직 활동의 주파수 (그림 3).
   1. 방광의 다른 부분 사이의 차이가 수축 반응에 기여하고 있는지 여부의 주파수 스펙트럼을 결정하기 위해 고속 푸리에 변환 분석을 사용하여 (예를 들어, 목 대 돔) 또는 개발 병리 및 약물 ^8.
2. 평활근 톤 효과 전에 약물 유발 반응의 피크에서, 적어도 10-30 초간의 윈도우를 선택 및 수축의 진폭을 측정한다.
3. 신경을-유발 된 수축에 대한 효과를 위해 전 약물 유발 반응의 피크에서의 수축 곡선 (최소 3) 아래의 진폭, 지속 시간 및 면적을 측정한다.
   주 : 퓨린 및 콜린성 다른 성분을 가지고 있기 때문에 반응 속도 EFS 유도 수축 곡선 아래의 면적 및 진폭 모두를 측정 할 필요가있다. 퓨린 성분이 빠르고 일시적인 (ATP는 purinergi를 활성화칼슘의 신속한 유입을 허용 같은 P2X1 C 등의 이온 성 채널, 그들은 이에 곡선 아래 면적에 대한 피크 진폭 응답에보다 덜 기여) 둔감. 콜린성 성분 (ACH 궁극적 수축을 유도하는 평활근 탈분극 이온 채널을 활성화 세포 내 경로를 활성화하기 위해 더 많은 시간을 필요로 대사 무스 카린 성 수용체를 활성화시킨다) 느리고 유지된다. 따라서, 무스 카린 성분 곡선 아래 면적을 측정하여 더 포착된다.
4. 스트립 및 약물 치료를 통해 결과를 비교할 수 있도록 데이터를 정규화한다. 정규화를 위해 선택된 파라미터는 병리학 적 조건이 연구 또는 실험 설계, 시험 화합물에 의해 좌우되어서는 안된다. 이러한 매개 변수를 사용 스트립 중량, 단면적, KCl을 응답 (도 4b), 다른 수축성 에이전트 최대 반응의 최대 반응 (도 7b) 또는 %의 % 중에서(예를 들어, CCH) 또는 편안한 에이전트 (예를 들어, 파파 베린).

결과

자발적인 근육 조직 활동

자발적인 근육 조직 활동은 출생 후의 개발 ^6-9 병리 (예를 들어, SCI, BOO) ^3-5으로 변화를 겪는 중요한 평활근 특징입니다. 이 액티비티는 과민성 방광 (OAB) ^(2)의 증상에 기여하는 것으로 생각되기 때문에, 변조 수용체, 세포 내 경로 및 약리 제의 평가는 OAB 및 기타 평활근 장애에 대한 효과적인 치료법을 개?...

토론

본 논문에서는 방광 생리학 및 병리학뿐만 아니라, 방광 기능 장애를 치료하기위한 새로운 약물의 발견을 돕는 관련된 중요한 과학적 문제들을 해결하는데 사용할 수있는 시험 관내 평활근 수축 방법에서 간단한 설명. 우리는 방광 평활근 수축의 발달 병리학 적 및 약리학 적 특성 (그림 2-4), 신경 전달 변조 (그림 5-7A), 종의 차이 (그림 4), 장기?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue Bath System with Reservoir	Radnoti, LLC	159920	isolated tissue baths
Warm water recirculator pump	Kent Scientific Corporation	TPZ-749	to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton System	DataQ Instruments	DI-710-UH	To view, record and analyze data
Transbridge Transducer Amplifier	World Precision Instruments	SYS-TBM4M	Transducer amplifier
Grass stimulator	Grass Technologies	Model S88	Stimulator
Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	ACV-1205S	To anesthetesize the animal
Anesthetizing Box	Harvard Apparatus	500116	To anesthetesize the animal
Anesthesia Masks	Kent Scientific Corporation	AC-09508	To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
Sylgard	Dow Corning Corp	184 SIL ELAST KIT	To pin, dissect, & cut tissue
Petri Dish	Corning	3160-152	To dissect/cut tissue
Insect Pins	ENTOMORAVIA Austerlitz Insect Pins	Size 5	To pin tissue
Bench Pad	VWR International	56617-014	Absorbent bench underpads
Rat surgical Kit	Kent Scientific Corporation	INSRATKIT	To remove and dissect tissue
2 Dumont #3 Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500064	To remove and dissect tissue
Tissue Forceps	Kent Scientific Corporation	INS500092	To remove and dissect tissue
Scalpel	Kent Scientific Corporation	INS500236	To remove and dissect tissue
Scalpel blade	Kent Scientific Corporation	INS500239	To remove and dissect tissue
Professional Clipper	Braintree Scientific, Inc.	CLP-223 45	To remove fur
Suture Thread	Fine Science Tools	18020-50	Tie tissue
Tissue Clips	Radnoti, LLC	158802	Attach tissue to rod/transducer
1 g weight	Mettler Toledo	11119525	For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution: Sodium chloride Potassium chloride Monobasic potassium phosphate Magnesium sulfate Dextrose Sodium bicarbonate Calcium chloride Magnesium chloride	Sigma Fisher Fisher Fisher Fisher Sigma EMD Baker	S7653 P217-500 P285-3 M65-500 D16-500 S5761 CX0130-2 2444	To prepare Krebs solution
Isoflurane	Henry Schein	029405	To anesthetesize the animal
Oxygen tank	Matheson Tri Gas	ox251	To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide)	Matheson Tri Gas	Moxn00hn36D	To aerate Krebs solutions