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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Manuskript stellt eine einfache, aber leistungsstarke, In-vitro-Verfahren zur Auswertung der glatten Muskulatur Kontraktilität in Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe oder Nervenstimulation. Hauptanwendungen sind Drogen-Screening und Verständnis Gewebe Physiologie, Pharmakologie und Pathologie.

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein in vitro Verfahren zur glatten Blasenmuskel-Kontraktions zu messen, und ihre Verwendung zur Untersuchung der physiologischen und pharmakologischen Eigenschaften der glatten Muskulatur sowie Änderungen von Pathologie induziert. Dieses Verfahren liefert wichtige Informationen für das Verständnis der Funktion der Blase unter Überwindung großen methodischen Schwierigkeiten bei in vivo-Versuchen festgestellt, wie chirurgischen und pharmakologischen Manipulationen, die Stabilität und das Überleben der Zubereitungen betreffen, die Verwendung von menschlichem Gewebe und / oder den Einsatz von teuren Chemikalien. Es bietet auch einen Weg, um die Eigenschaften der einzelnen Blasenkomponente (dh der glatten Muskulatur, Schleimhaut, Nerven) bei gesunden und pathologischen Bedingungen zu untersuchen.

Die Harnblase wird von einem narkotisierten Tier, in Krebs-Lösung gelegt und in Streifen schneiden entfernt. Streifen werden in einer Kammer mit warmem Krebs-Lösung gefüllt war. Ein Ende ist mit einem isometrischen tensio befestigtn Wandlers an Kontraktionskraft zu messen, wird das andere Ende an einem feststehenden Stab angebracht ist. Gewebe wird durch direkte Zugabe Verbindungen dem Bad oder durch die elektrischen Feldstimulationselektroden, die Nerven, ähnlich wie bei Auslösung Blasenkontraktionen in vivo aktivieren stimuliert. Wir zeigen die Anwendung dieses Verfahrens auf die spontane Kontraktilität der glatten Muskulatur während der Entwicklung und nach einer Versuchsrückenmarksverletzung zu bewerten, die Art der Neurotransmission (Sender und Rezeptoren beteiligt sind), Faktoren der Modulation der glatten Muskelzellen-Aktivität beteiligt ist, die Rolle der einzelnen Komponenten Blase, und Arten und Organ Unterschiede in Reaktion auf pharmakologische Mittel. Zusätzlich ist es für die Untersuchung der intrazellulären Signalwege in der Kontraktion und / oder Relaxation der glatten Muskulatur, Drogen Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und Auswertung der Transmitterausschüttung beteiligt sind, verwendet werden könnte.

Die in-vitro-Verfahren Kontraktilität der glatten Muskulatur wurde ausgiebig genutzt for mehr als 50 Jahren und hat Daten, die wesentlich zu unserem Verständnis der Blasenfunktion sowie der pharmazeutischen Entwicklung von derzeit klinisch zur Blasenmanagement verwendeten Verbindungen beigetragen vorgesehen.

Einleitung

Die glatte Muskulatur der Blase entspannt, Urin Reinrichtungen und Verträge Harnausscheidung zu entlocken. Entspannung wird durch intrinsische Eigenschaften der glatten Muskulatur und Tonic Freisetzung von Noradrenalin (NE) von den sympathischen Nerven, die adrenergen Beta-Rezeptoren (β 3 AR in Menschen) in der Detrusor aktiviert vermittelt. Entleerung wird durch die Hemmung der sympathischen Eingabe und Aktivierung der parasympathischen Nerven, die ACh / ATP, um die glatte Muskulatur der Blase 1 Vertrag Veröffentlichung erreicht. Zahlreiche pathologischen Bedingungen, einschließlich Gehirn und / oder Rückenmarksverletzungen, neurodegenerative Erkrankungen, Diabetes, Blasenauslassobstruktion oder interstitielle Zystitis, kann zutiefst verändern Blasenfunktion, mit gravierenden Auswirkungen auf die Lebensqualität des Patienten 2. Diese Bedingungen ändern, die Kontraktilität der glatten Muskulatur durch Beeinflussung einer oder mehrerer Komponenten der Blase: die glatte Muskulatur, den afferenten und efferenten Nerven und / oderSchleimhaut.

Mehrere in vivo und in vitro-Verfahren zur Blasenfunktion zu untersuchen wurden entwickelt. In vivo ist Zystometrie die primäre Messung der Blasenfunktion. Obwohl dies ein intaktes Präparat, das Sammeln von Informationen unter beinahe physiologischen Bedingungen ermöglicht, gibt es eine Reihe von Umständen, unter denen die Verwendung von glatten Muskelstreifen bevorzugt. Diese umfassen Situationen, in denen chirurgische und / oder pharmakologischen Manipulationen das Überleben und die Stabilität der Zubereitung in vivo oder beeinflussen, wenn die Untersuchungen erfordern die Verwendung des menschlichen Gewebes oder teure Chemikalien. Dieses Verfahren ermöglicht auch eine Überprüfung der Wirkungen von Drogen, Alter und Pathologie von jeder Komponente der Blase, dh der glatten Muskulatur, Schleimhaut-und abführenden Nerven.

Blasenstreifen wurden über die Jahre von vielen Gruppen verwendet worden, um eine Reihe von wissenschaftlichen Fragen zu beantworten. Sie wurden eva verwendetluate Veränderungen in myogene Spontanaktivität von Pathologie induziert. Diese Tätigkeit wird angenommen, dass auf die Dringlichkeit und Häufigkeit Symptome der überaktiven Blase (OAB) beitragen, und ist daher ein Ziel für Drogen, die für OAB 3-9 entwickelt. Blasenstreifen wurden auch verwendet, um myogene und neuronale Faktoren, die Tonus der glatten Muskulatur mit dem Ziel der Entdeckung von Ionenkanälen und / oder Rezeptoren und / oder die intrazelluläre Signalwege, die gezielte könnte entweder Relaxation oder Kontraktion der glatten Muskulatur induziert werden modulieren untersuchen 3,10- 13. Andere Studien haben sich auf die Art der Neurotransmission, einschließlich Sendern und Rezeptoren beteiligt und Änderungen Pathologie 14,15 induzierte konzentriert. Darüber hinaus ist die Methode für den Vergleich zwischen verschiedenen Arten von Gewebe 16 zwischen den Organen 18 19-21, und die Bewertung der Arzneimittel Struktur-Aktivitäts-Beziehungen 22-24 verwendet wurde. Eine Erweiterung dieser Methode wurde verwendet, um measure die Wirkung von Drogen auf die Transmitterfreisetzung aus efferenten Nerven 25. Weiterhin ist eine Vielzahl von Geweben (Blase, Harnröhre, Gastrointestinaltrakt, GI) von Tieren oder Menschen (von Operationen bzw. Organspendergewebe für Forschung anerkannt) geerntet und aus einer Vielzahl von Tiermodellen, einschließlich Verletzungen des Rückenmarks (SCI), Blasenausgangsobstruktion (BOO) oder interstitielle Zystitis (IC) können mit dieser Technik untersucht werden.

In dieser Arbeit veranschaulichen wir die Anwendung dieses Verfahrens zusammen mit notwendigen experimentellen Protokollen mehreren vorstehend erwähnten wissenschaftlichen Fragen anzugehen.

Protokoll

Alle hier beschriebenen Verfahren werden von der IACUC Ausschuss an der Universität von Pittsburgh genehmigt.

1. Lösungen

  1. Vorbereitung Krebs-Lösung nach der Rezeptur. Zusammensetzung in mM: NaCl 118, KCl 4,7, CaCl 2 1,9, MgSO 4 1,2, NaHCO 3 24,9, KH 2 PO 4 1,2, Glucose 11,7.
  2. Belüften Krebs mit 95% O 2, 5% CO 2 und legen Sie sie in einem 37 ° C Wasserbad auf während des Experiments verwendet werden. Beiseite stellen ~ 200 ml belüftete Krebs-Lösung bei Raumtemperatur bis zur Gewebe Präparation verwendet werden.
  3. Messen pH-Wert (~ 7,4) und Osmolarität (~ 300 mOsm) von belüfteten Krebs.

2. Versuchsaufbau (Schematische Abbildung 1A)

  1. Füllen belüfteten (95% O 2, 5% CO 2) Kammer mit 10 ml Krebs.
  2. Starten Sie die Umwälzpumpe, um die Kammern auf 37 ° C erwärmen; schalten Sie die notwendige Ausrüstung: Verstärker (n), Stimulator (s) und Aufnahme-Software.
  3. Kalibrieren Wandler mit einer 1-g-Gewicht.

3. Gewebe (1B)

Entfernen Sie die Blase von einem erwachsenen weiblichen Sprague Dawley naiven Ratte (200-250 g; ~ 10-12 Wochen alt) die folgenden Schritte:

  1. Bereiten Dissektion Bereich und notwendigen Instrumente: Rasierer, Pinzette mit Zähnen, Skalpell, Schere seziert, Mikroschere, zwei Pinzette (Autoren bevorzugen Dumont Pinzette # 3), Gewebe-Clips (oder Seidennaht), eine Sylgard beschichtet Dissektion Gericht mit Krebs und Gewebedissektion Pins.
  2. Betäuben das Tier mit Isofluran Inhalation (4% in O 2) in der Ansaugkammer. Verwenden Tier Salbe auf die Augen zu Trockenheit während der Narkose zu verhindern. Das Niveau der Narkose kontinuierlich zu überwachen durch die Beobachtung der Atemfrequenz, Reaktion auf äußere Reize, und der Verlust der hinteren Extremität Reflex zurücktreten.
  3. Wenn das Tier betäubt Rasur der unteren Bauch einrea. Setzen die Beckenorgane über eine Mittellinie Bauchschnitt. Identifizieren Sie die Blase und Harnröhre. Entfernen Sie die Blase durch Schneiden an der Blasenhals in der Nähe von proximalen Harnröhre. Zeigen Gewebe sofort in der Sylgard beschichtet Gericht mit belüfteten Krebs-Lösung gefüllt.
  4. Falls nötig, entfernen Sie zusätzliche Gewebe zu dieser Zeit: Harnröhre, Stücke von Magen-Darm-Trakt (GI) und / oder der Prostata, usw.
  5. Zu opfern, das Tier mit IACUC zugelassenen Methoden (zB Narkosedosierung oder CO 2 Ersticken, gefolgt von einem sekundären Methode).
  6. Präparieren von Gewebe Stifte einfügen durch die Blasenkuppel, Hals, und der Harnleiter, um das Gewebe für die weitere Präparation zu stabilisieren. Sie das Gewebe nicht zu dehnen. Entfernen Sie Fett, Bindegewebe, proximalen Harnröhre, Harnleiter und, falls vorhanden.
  7. Öffnen Sie die Blase von der Basis bis zur Kuppel ein Flachblatt zu erstellen, Serosaseite down / up luminalen Seite (Abbildung 1B). Platzieren Sezieren Stifte an jeder Ecke des Gewebes. Blase entfernen dome und Halsgewebe.
  8. Wenn der Zweck des Experiments ist es, den Beitrag der Schleimhaut (Urothel und Lamina propria - siehe Diagramm 1C) zu bestimmen, um die Kontraktion der glatten Muskulatur, vergleichen Sie die Eigenschaften der Detrusorstreifen mit und ohne die Schleimhaut befestigt. Dazu vor dem Schneiden des Gewebes in Streifen, entfernen Sie vorsichtig die Schleimhautschicht mit Iris Frühling Schere und feinen Pinzette unter einem Binokular. Am Ende des Experiments, fixieren die Streifen für H & E-Färbung, um die vollständige Entfernung der Schleimhaut zu bestätigen. Beachten Sie, dass diese Prozedur in der Maus Blase einfacher als im Rattenblase.
  9. Schneiden Sie das Gewebe längs von der Basis bis Kuppel in Streifen von ca. 2 x 8 mm (Abbildung 1B). Krawatte oder fügen Sie eine Gewebeclip an beiden Enden jedes Streifens.
    ANMERKUNG: Eine Rattenblase können in der Regel in 4 Streifen geschnitten werden, aber die Anzahl der Streifen kann zunehmen oder abnehmen, je nach dem Tier / Blasengröße.
  10. Übertragen Sie die Streifen an der expermentellen Kammern. Befestigen Sie ein Ende jedes Streifens an einem Kraftaufnehmer, der die Gewebekontraktion misst, und die andere auf eine feste Glas / Metallstange.
    HINWEIS: Gewebekammern variieren in der Größe (0,2 ml bis 20 ml oder größer). Typische Kammern für Nager Blasen sind 5-20 ml, die eine ausreichende Höhe für die Streifen vollständig in Lösung eingetaucht werden kann. Einige Kammern sind mit eingebauten Stimulationselektroden, andere nicht. Es sollte darauf geachtet werden, um sicherzustellen, dass alle Anschlüsse der Elektroden sind in gutem Zustand, sonst elektrische Feldstimulation ist nicht zuverlässig.
  11. Tragen Sie eine definierte Menge an Kraft, um jeden Streifen durch vorsichtiges Dehnen der Gewebe, bis Ausgangsspannung erreicht 1 g (~ 10 mN). Zunächst wird das Gewebe dazu neigt, sich zu entspannen, die als Abnahme der Ausgangsspannung aufgezeichnet wird. Wasch Gewebe etwa alle 15 min mit dem warmen belüfteten Krebs und stellen Sie die Ausgangsspannung bis 1 g nach jeder Wäsche. Lassen Sie Gewebe für ~ 1-2 Stunden oder bis ins Gleichgewicht Basisspannung stabil ist (dh keine weiteren Gewebe Entspannung).
  12. Test der Lebensfähigkeit von Gewebe durch Zugabe von KCl (80 mM), die direkt in das Bad für ~ 5 min oder bis zu einem Plateau Reaktion erreicht ist. Antworten auf hohe Konzentrationen von KCl kann auch während des Experiments oder am Ende des Experiments wiederholt und zum Normalisieren Reaktionen auf andere Medikamente oder zwischen den Streifen (siehe Normalisierung unter Datenanalyseabschnitt) werden.
  13. Wasch Gewebe mehrfach (3-5x) mit dem warmen belüfteten Krebs, damit das Gewebe vor, eine Behandlungsbedingungen zurückzukehren.

4. Stimulationsprotokolle

  1. Um die Auswirkungen der Pathologie auf die spontane myogene Aktivität oder Tonus der glatten Muskulatur zu untersuchen, verwenden glatten Muskelstreifen aus verschiedenen Tiermodellen wie SCI, boo, oder Neugeborenen. Abbildung 2 veranschaulicht die Anwendung dieser Methode, um Änderungen in der Blase spontane Aktivität während der Entwicklung zu untersuchen und nach der SCI. Zusätzlich können pharmakologische Wirkstoffe zur sp modulierenontaneous Aktivität. Abbildung 3 veranschaulicht die Wirkung der KCNQ Kanalmodulatoren, Flupirtin und XE991, auf die spontane Aktivität und Tonus der glatten Muskulatur.
  2. Pharmakologische Stimulation der glatten Muskulatur Konstrukt Konzentrations-Wirkungskurven durch Zugabe von Verbindungen aus konzentrierten Stammlösungen direkt zu dem Bad in definierten Zeitintervallen. Verwenden Drogen-und Fahrzeug in parallelen Streifen für Fahrzeug und Einmaleffekte zu berücksichtigen.
    1. Machen Stammlösungen der gewünschten Testverbindungen bei 1000x das endgültige Arbeitskonzentration. Für Carbachol (CCH), einer Muscarin-Rezeptor-Agonist, bereiten folgende Bestände: 10 -5 M, 3 x 10 -5 M, 10 -4 M, 3 x 10 -4 M, 10 -3 M, 3 x 10 -3 M , 10 -2 M. Endkonzentrationen im Bad beträgt 10 -8 M bis 10 -5 M (4C, D). Für Medin B (NMB), ein Bombesin-Rezeptor-Subtyp 1-Agonisten, bereiten folgende Bestände: 10 -8 M, 10 -7M, 10 -6 M, 10 -5 M, 10 -4 M, 10 -3 M und Endkonzentrationen in dem Bad gibt 10 -11 M bis 10 -6 M. Sowohl KM und NMB werden erwartet, um Gewebe Kontraktilität erhöhen.
    2. Für eine 10 ml Gewebe Bad, fügen Sie 10 ul jeder CCh Stammlösung, sobald die Reaktion ein Plateau (4C, D) erreicht. In parallelen Streifen hinzufügen gleiche Mengen des Fahrzeugs (Wasser). Ebenso werden 10 ul jeder Medin B Stammlösung jedes ~ 5 min.
      HINWEIS: Beachten Sie die erregende Wirkung von NMB und vom CCH auf der glatten Muskulatur in Streifen von verschiedenen Spezies in Abbildung 4.
    3. Untersuchen die Eigenschaften Entspannung der glatten Muskulatur in der Vor-kontrahierten Gewebe mit einer erregenden Mittel, in der Regel CCh oder KCl.
    4. Um eine Antwort Agonisten blockieren, Vorbehandlung des Gewebes für 10-20 min mit dem Antagonisten zu Gewebepenetration, vor der Stimulation Agonisten zu ermöglichen.
  3. Für neuronale stimlation der glatten Muskulatur, die auch als elektrische Feldstimulation (EFS) befolgen Sie die Schritte 1 bis 3,13 und weiter wie unten beschrieben. EFS soll selektiv Nerven gegenüber der glatten Muskulatur zu aktivieren. Parameter für die Stimulation sollte sorgfältig ausgewählt werden, um direkte Stimulation der glatten Muskulatur zu vermeiden.
    1. Etablieren Stimulationsparameter: Art des Reizes (Einzelimpulse oder Züge), Dauer (Impulsdauer und Bahn Dauer), Frequenz und Intensität, wie in den Schritten unten beschrieben und in den Figuren 5A, B dargestellt.
      1. Für Einzelpuls-Stimulation, eingestellte Impulsdauer, Inter-Stimulus-Intervall und die Anzahl der gewünschten Reize. Übliche Parameter Stimulationsdauer Einzelimpulse 0,05-0,3 ms Dauer in gewünschten Intervallen (5A) geliefert. Folgen Sie Schritt für 4.3.1.4 Reizstärke.
      2. Für Zug-Stimulation, setzen Sie den Zug Dauer und unter Zug-Intervall. Typische Werte für Blasengewebe sind 3-10 sec geliefert mindestens 1 min auseinander (5B). Wenn Gewebe Müdigkeit auftritt (dh EFS Kontraktionen während Kontrollzeitraum zu verringern), erhöhen Sie den Abstand zwischen den Zug.
      3. Stellen Sie die Frequenz der Zug Reize (Anzahl der Impulse in einem Zug - Figur 5B). Führen Sie einen Frequenzgang reicht von 0,5 bis 50 Hz. Typische Frequenzen für Blasen sind 10-20 Hz, die reproduzierbare und stabile Kontraktionen von ATP und ACh vermittelte geben. Beachten Sie die frequenzabhängige Reaktionen auf Stimulation EFS Maus Blasenstreifen in Figur 5 zeigt, wie dieses Verfahren verwendet werden, um den Beitrag der cholinergen und purinergen Mechanismen der Neurotransmission zu bewerten.
      4. Etablieren Intensität des Reizes: systematisch erhöhen Sie die Intensität (Spannung) des Reizes, bis die Amplitude der Kontraktion ein Plateau erreicht (wenn Züge mit halten die Frequenz konstant).
      5. Stellen die Intensität des Reizes in Abhängigkeit von derZiel des Experiments. Wenn das Ziel ist, die neural hervorgerufenen Kontraktionen zu erhöhen, dann verwenden Sie submaximalen Intensität, dass die Amplitude der Kontraktion ist ~ 50% der maximalen Kontraktion. Wenn das Ziel ist, die neural hervorgerufenen Kontraktionen zu verringern, dann die Intensität eingestellt auf ~ 80% der maximalen Amplitude, um Gewebe Ermüdung zu vermeiden.
    2. Sobald Stimulationsparameter (Dauer, Häufigkeit und Intensität) eingerichtet sind, erlauben ~ 20-30 min für EFS- hervorgerufenen Kontraktionen zu stabilisieren vor Drogentests.
      HINWEIS: (; 0,5-1 um ​​TTX) Um die Selektivität von EFS für neuronale Übertragung, Block neuronale Übertragung mit der Na +-Kanal-Blocker, Tetrodotoxin überprüfen. Dieser Schritt zu Beginn des Experiments als TTX wäscht relativ einfach. Darüber hinaus führen diese am Ende des Versuchs (siehe Schritt 4.3.5. Unten).
    3. Die Stammlösungen bei 1,000x die letzten Arbeitskonzentrationen für: Alpha-, Beta-Methylen ATP (ABMA; eine purinergen Rezeptor-Aktivatorund Desensibilisierer) 10 -2 M, Atropin (ein Muskarin-Rezeptor-Antagonist) 10 -3 M (5C). Beachten anderen Beispielen in 6. Die 5HT4-Rezeptoragonisten, Cisaprid (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 -5 M, 10 -5 M, 3 x 10 -4 M, 10 -4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), erhöht die Gewebekontraktionsfähigkeit und SB-203186 (3 x 10 -3 M), einem 5HT4-Rezeptor-Antagonisten, kehrt Cisaprid-Effekten.
    4. Um die Auswirkungen der ABMA und Atropin auf EFS (5C) zu testen, führen zwei Steuerfrequenzkurven. Werden 10 ul von 10 -2 M ABMA dem Bad für eine Endkonzentration von 10 uM. Dies wird das Gewebe durch eine direkte Stimulation der Rezeptoren im purinergen die glatte Muskulatur kontrahieren. Nach der Antwort auf die Grundlinie zurück, wiederholen Frequenzkurven. Werden 10 ul 10 -3 M Atropin für eine endgültige KonzentratIonen von 1 uM. Nach ~ 10 min (für die Atropin benötigt, um Muscarinrezeptoren blockieren), wiederholen Frequenzkurven. In parallelen Streifen werden 10 ul des Fahrzeugs, Wasser, in jedem Schritt.
      HINWEIS: Für andere Beispiele in Abbildung 6, mit 10 ul jeder Cisaprid Stammlösung in definierten Zeitabständen (~ 15 min, siehe Diskussion), gefolgt von 10 ul SB-203186-Stammlösung direkt in die Badewanne und ihre Wirkung auf die Überwachung EFS-induzierten Kontraktion. In parallelen Streifen werden 10 ul des Fahrzeugs, DMSO. Beachten Sie die Auswirkungen von Cisaprid, ein 5HT4-Rezeptor-Agonist, auf EFS hervorgerufenen Kontraktionen in der menschlichen Blase und Ileum Gewebe in Abbildung 6. Zusätzlich beobachten die Wirkung von DMSO, das Fahrzeug für Cisaprid, auf EFS hervorgerufenen Kontraktionen in der menschlichen Blase und Ileum Gewebe .
    5. Am Ende des EFS-Protokoll überprüfen die Selektivität des EFS durch die Blockierung neuronale Übertragung mit der Na +-Kanal-Blocker, Tetrodotoxin (TTX; 0,5-1 &# 181; M). Wenn TTX-resistenter Kontraktionen noch vorhanden sind, ist es empfehlenswert, die Dauer und die Intensität des Reizes in nachfolgenden Experimenten einzustellen.
  4. Für die Ermittlung der Auswirkungen von Drogen auf Pre-oder Post-synaptische Stellen (7A) befolgen Sie die Schritte 1 bis 4.3.2. Etablieren reproduzierbare Antworten auf Carbachol und EFS, dann fügen Medikament X.
  5. Am Ende des Experiments, unclip oder lösen die Streifen, tupfen Sie sie vorsichtig auf ein Stück Seidenpapier, um zusätzliche Flüssigkeit zu beseitigen und messen das Gewicht jeder Streifen mit einer Waage. Auch messen die Länge Gewebe mit einer Schieblehre, um die Querschnittsfläche zu bestimmen. Diese Informationen werden für die Normalisierung von Daten verwendet (siehe Abschnitt 5.4).

5. Datenanalyse

Analyse von Daten mittels geeigneter Software (zB WinDaq, LabChart).

  1. Für spontane Aktivität, wählen Sie ein Fenster von mindestens 30 sec vor und auf dem Höhepunkt der Droge induzierten Antwort und mirasure Amplitude und Frequenz der myogene Aktivität (3).
    1. Verwenden schnelle Fourier-Transformation-Analyse, um das Spektrum von Frequenzen beitragen, Antworten kontraktil und bestimmen, ob es Unterschiede zwischen den verschiedenen Teilen der Blase (zB Kuppel gegen den Hals) oder mit der Entwicklung, Pathologie und Drogen 8.
  2. Für Wirkungen auf glatte Muskulatur Wählen Sie ein Fenster von mindestens 10-30 Sekunden vor und auf dem Höhepunkt der Droge induzierten Reaktion und messen Amplitude der Kontraktion.
  3. Effekte auf neural hervorgerufenen Kontraktionen zu messen Amplitude, Dauer und die Fläche unter der Kurve der Kontraktionen (mindestens 3) vor und an der Spitze des medikamenteninduzierten Reaktion.
    HINWEIS: Es ist notwendig, sowohl die Amplitude und die Fläche unter der Kurve der EFS-induzierten Kontraktionen zu messen, da purinerger und cholinerge Komponenten unterschiedliche Kinetik. Die purinergen Komponente ist schnell und vorübergehend (ATP aktiviert purinergic ionotropen Kanäle wie P2X1, die schnell Einstrom von Calcium zu ermöglichen, dann werden sie zu desensibilisieren) und trägt so mehr zu der Peak-Amplitudengang und kleiner in der Fläche unter der Kurve. Die cholinergen Komponente ist langsamer und anhaltender (ACh aktiviert metabo Muskarinrezeptoren, die mehr Zeit benötigen, um die intrazelluläre Signalwege, die letztlich zu aktivieren Ionenkanäle, die die glatte Muskulatur depolarisieren eine Kontraktion induzieren zu aktivieren). Somit wird die muskarinischen Komponente besser durch Messen der Fläche unter der Kurve erfasst.
  4. Normalisieren die Daten, um Ergebnisse in Streifen und pharmakologische Behandlungen zu vergleichen. Der Parameter für die Normierung gewählt sollte nicht durch die Testverbindungen beeinflusst werden, pathologischen Zustand studiert oder experimentelles Design. Unter diesen Parametern Verwendung Leiste Gewicht, Querschnittsfläche, KCl Reaktionen (4B),% der maximalen Reaktion (7B) oder% der maximalen Reaktion auf einen anderen Kontraktionsmittel(ZB CCH) oder Entspannen Mittel (zB Papaverin).

Ergebnisse

Spontane Aktivität Myogenic

Spontane myogene Aktivität ist ein wichtiger glatten Muskulatur Merkmal, das ändert sich mit der postnatalen Entwicklung 6-9 und Pathologie (zB, SCI, BOO) 3-5 unterzogen. Da diese Aktivität wird angenommen, daß die Symptome der überaktiven Blase (OAB) 2 tragen, ist von großem Interesse für die Entwicklung von wirksamen Behandlungen für OAB und andere Störungen der glatten Muskulatur eine Auswertu...

Diskussion

In dieser Arbeit haben wir beschrieben, in vitro die Kontraktilität der glatten Muskulatur Verfahren, das verwendet werden kann, um eine Anzahl von wichtigen wissenschaftlichen Fragen Blase Physiologie und Pathologie sowie der Unterstützung der Entdeckung neuer Medikamente zur Blase Dysfunktion im Zusammenhang beziehen sich auf eine einfache. Wir haben die Verwendung dieses Verfahrens zur Bewertung der Entwicklungs, pathologischen und pharmakologischen Eigenschaften der glatten Blasenmuskulatur Kontraktilitä...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Danksagungen

Diese Studie wurde von NIH R37 R01 DK57284 DK54824 und Zuschüsse an LB unterstützt

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Tissue Bath System with ReservoirRadnoti, LLC159920isolated tissue baths
Warm water recirculator pumpKent Scientific Corporation TPZ-749to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton SystemDataQ InstrumentsDI-710-UHTo view, record and analyze data
Transbridge Transducer AmplifierWorld Precision InstrumentsSYS-TBM4MTransducer amplifier
Grass stimulatorGrass TechnologiesModel S88Stimulator
Anesthesia SystemKent Scientific Corporation ACV-1205STo anesthetesize the animal
Anesthetizing BoxHarvard Apparatus500116To anesthetesize the animal
Anesthesia MasksKent Scientific Corporation AC-09508To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
SylgardDow Corning Corp184 SIL ELAST KITTo pin, dissect, & cut tissue
Petri DishCorning3160-152To dissect/cut tissue
Insect PinsENTOMORAVIA Austerlitz Insect PinsSize 5To pin tissue
Bench PadVWR International56617-014Absorbent bench underpads
Rat surgical KitKent Scientific Corporation INSRATKITTo remove and dissect tissue
2 Dumont #3 ForcepsKent Scientific Corporation INS500064To remove and dissect tissue
Tissue ForcepsKent Scientific Corporation INS500092To remove and dissect tissue
ScalpelKent Scientific Corporation INS500236To remove and dissect tissue
Scalpel bladeKent Scientific Corporation INS500239To remove and dissect tissue
Professional Clipper Braintree Scientific, Inc.CLP-223 45To remove fur
Suture ThreadFine Science Tools18020-50Tie tissue
Tissue ClipsRadnoti, LLC158802Attach tissue to rod/transducer
1 g weight Mettler Toledo11119525For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:
Sodium chloride
Potassium chloride
Monobasic potassium phosphate
Magnesium sulfate
Dextrose
Sodium bicarbonate
Calcium chloride
Magnesium chloride		 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		To prepare Krebs solution
IsofluraneHenry Schein029405To anesthetesize the animal
 Oxygen tankMatheson Tri Gasox251To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) Matheson Tri GasMoxn00hn36DTo aerate Krebs solutions

Referenzen

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