JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yazıda, farmakolojik ajanlar ve sinir uyarımına tepki olarak, düz kas kasılmalarını değerlendirilmesi için bir in vitro yöntem, bir basit, ancak güçlü sunar. Ana uygulamalar ilaç tarama ve anlayış doku fizyoloji, farmakoloji, patoloji ve vardır.

Özet

Biz, bir in vitro mesane düz kas kasılmasını ölçmek için bir yöntem, ve fizyolojik ve farmakolojik düz kas özellikleri yanı sıra patoloji ile uyarılan değişiklikler araştırmak için kullanımını tarif eder. Bu yöntem, cerrahi ve farmakolojik preparatların istikrar ve sağkalımı etkilediği manipülasyonları, insan dokusunun kullanılması ve / veya pahalı kimyasalların kullanımı gibi in vivo deneylerde karşılaşılan başlıca metodolojik zorlukları, üstesinden gelirken, mesane fonksiyonlarının anlaşılmasına önemli bilgi sağlar. Aynı zamanda sağlıklı ve patolojik koşullarda her mesane bileşenin (yani düz kas, mukoza, sinirler) özelliklerini araştırmak için bir yol sağlar.

Mesane, bir anestezi verilen hayvanın, Krebs çözeltisi içine yerleştirildi ve şeritler halinde kesilir kaldırılır. Şeritler Krebs çözeltisi ile sıcak doldurulmuş bir odacığm içine yerleştirilir. Bir ucu bir izometrik tensio bağlı olduğubüzülme kuvveti ölçmek için n, dönüştürücü, diğer uç, sabit bir çubuk takılır. Doku doğrudan banyosuna veya in vivo mesane kasılmaları tetikleyen benzer sinirleri aktive elektrik alan uyarımı elektrotlar tarafından bileşikler ekleyerek uyarılır. Bu yöntemin kullanılması, gelişme esnasında ve deneysel omurilik yaralanması sonrası kendiliğinden düz kas kontraktilitesini değerlendirmek göstermektedir, nörotransmisyon (ilgili vericileri ve alıcıları), yumuşak kas aktivitesinin modülasyonunda rol oynayan faktörler doğası, tek tek bileşenlerin mesane rolü, ve türleri ve farmakolojik maddelere yanıt organ farklılıklar. Buna ek olarak, verici serbest kalmasına ve / veya düz kas gevşemesi, ilaç yapı-aktivite ilişkileri ve değerlendirme dahil olan hücre içi yolları araştırmak için kullanılabilir.

In vitro olarak, düz kaslar yöntemi yaygın olarak kullanılmaktadır fo50 yıldır r ve önemli ölçüde mesane fonksiyon anlayışımıza yanı sıra halen mesane yönetimi için klinik olarak kullanılan bileşiklerin ilaç gelişmesine katkıda veriler sağlamıştır.

Giriş

Mesane düz kas idrar eleme ortaya çıkarmak için idrar depolamaya izin vermek için gevşer ve sözleşmeler. Gevşeme içsel düz kas özellikleri ile ve detrusor beta adrenerjik reseptörleri (β insan 3 AR) aktive sempatik sinirler norepinefrin (NE) tonik salınımı, aracılık eder. Işeme sempatik girişini engellemek ve ACh / ATP mesane düz kasını 1 sözleşme için serbest parasempatik sinirleri aktive ederek elde edilir. Beyin ve / veya omurilik yaralanması, nörodejeneratif hastalıklar, diyabet, mesane çıkım tıkanıklığı veya interstisyel sistit gibi çeşitli patolojik durumlar, derinden hayatın 2 hastanın kalitesi üzerinde ciddi etkileri olan, mesane fonksiyon değiştirebilir. Düz kas, afferent ve efferent sinirleri ve / veya: Bu koşullar, bir veya daha fazla bileşen mesane etkileyerek düz kasının kasılma kuvveti üzerinde etkisimukoza.

In vivo ve mesane fonksiyonu çalışma için birkaç in vitro yöntemler geliştirilmiştir. In vivo sistometri mesane fonksiyon temel ölçüsüdür. Bu fizyolojik koşullara yakın altında bilgileri toplama sağlayan bir sağlam hazırlanması olsa da, yumuşak kas şeritlerin kullanımı tercih edildiği durumlar da vardır. Bu, cerrahi ve / veya farmakolojik manipülasyonlar hayatta kalmasını ve in vivo preparasyonun stabilitesini veya etkileyebilecek durumlara dahil çalışmalar, insan doku veya pahalı kimyasal maddelerin kullanılmasını gerektirir zaman. Bu yöntem, aynı zamanda, mesane her bir bileşeninin ilaçlar, yaş ve patoloji etkilerinin incelenmesini kolaylaştırmaktadır, düz kas, mukoza, afferent ve efferent sinirleri yani.

Mesane şeritler bilimsel bir dizi soru cevap birçok grup tarafından yılda istihdam edilmiştir. Bunlar eva için kullanıldımiyojenik spontan aktivitede bir değişiklik ölçmek üze- re patoloji ile indüklenen. Bu aktivite aşırı aktif mesane (AAM), aciliyeti ve sıklığı, belirtilere katkıda bulunduğuna inanılan ve bu nedenle AAM 3-9 için geliştirilen ilaç için bir hedef olduğunu. Mesane şeritler de rahatlama ya da düz kas kasılmasını ya ikna etmek için hedef olabilir iyon kanalları ve / veya reseptörleri ve / veya hücre içi yollar keşfetme amacı ile düz kas tonusunu modüle myojenik ve nöronal faktörleri araştırmak için kullanıldı 3,10- 13. Diğer çalışmalar patoloji 14,15 tarafından uyarılan vericileri ve ilgili reseptörleri ve değişiklikler de dahil olmak nörotransmisyonun doğasına odaklanmıştır. Buna ek olarak, yöntem, organ 19-21 ve ilaç yapı-aktivite ilişkisinin değerlendirilmesi 22-24 arasında, farklı türlerdeki 16-18'den dokular arasındaki karşılaştırmalar için kullanılmıştır. Bu yöntemin bir uzantısı MEASUR için kullanılmıştırefferent sinirler 25 yerden verici salınımı üzerindeki ilaçların etkisini e. Ayrıca, dokuların (mesane, üretra, gastrointestinal sistem, GI) (araştırma için onaylanmış ameliyatlar veya organ donör dokudan), insan veya hayvan hasat ve spinal kord yaralanması (SKY), mesane çıkım tıkanıklığı dahil olmak üzere hayvan modellerinde çeşitli çeşitli (BOO), veya interstisyel sistit (IC) bu tekniği kullanılarak incelenmiştir edilebilir.

Bu yazıda yukarıda belirtilen çeşitli bilimsel soruları için gerekli deneysel protokolleri ile birlikte bu yöntemin kullanımı, göstermektedir.

Protokol

Burada açıklanan tüm prosedürler Pittsburgh Üniversitesi IACUC komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Çözümler

  1. Reçeteye göre Krebs çözeltisi hazırlayın. NaCl 118, KCl 4.7, CaCl2 1.9, MgSO 4 1.2, NaHCO3 24.9, KH 2 PO 4 1.2, dekstroz 11.7: mM Kompozisyon.
  2. % 95 O2,% 5 CO2 ile Krebs havalandırır ve deney boyunca kullanılmak üzere bir 37 ° C su banyosu içine koyun. Bir yana koyun, oda sıcaklığında gece havalandırılmış Krebs çözeltisi 200 ml doku diseksiyon için kullanılır.
  3. Havalandırılmış Krebs pH (~ 7.4) ve ozmolariteyi (~ 300 mOsm) ölçün.

2. Deney Seti-up (şematik Şekil 1A)

  1. (% 95 O2,% 5 CO2) 10 ml Krebs ile gaz odaları doldurun.
  2. 37 ° C'ye kadar ısıtmak için odaları su sirkülasyon pompası başlanması; gerekli ekipman açın: amplifikatör (ler), uyarıcı (ler) ve kayıt yazılımı.
  3. 1 g ağırlık çeviricilerine kalibre.

3. Doku (Şekil 1B)

: Aşağıdaki adımları; (~ 10-12 haftalık 200-250 gr) bir yetişkin naif dişi Sprague Dawley sıçanın kesesi çıkarın

  1. Diseksiyon alanı ve gerekli araçları hazırlayın: elektrikli tıraş, diş forseps, neşter bıçak, kesme makasları, Microscissors, iki diseksiyon forseps, doku klipleri (veya ipek dikiş), Krebs ile Sylgard kaplı diseksiyon çanak (yazarlar Dumont forseps # 3 tercih) doku diseksiyonu pimleri.
  2. Indüksiyon odasında izofluran inhalasyonu (O 2% 4) ile hayvan anestezisi. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözlerin veteriner merhem kullanın. Sürekli solunum hızını, dış uyaranlara yanıt, ve refleks çekilme arka uzuv kaybı gözlemleyerek anestezi düzeyini izlemek.
  3. Hayvan tıraş alt karın bir anestezi zamanrea. Bir orta hat karın kesi yoluyla pelvik organların maruz. Mesane ve üretra tanımlayın. Proksimal üretraya yakın mesane boynu kesilerek kesesi çıkarın. Havalandırılmış Krebs çözeltisi ile doldurulmuş Sylgard kaplı çanak hemen doku yerleştirin.
  4. Gerekirse, bu zamanda ek doku kaldırmak: üretra, gastrointestinal (Gl) sistemi ve / veya prostat parçaları, vs
  5. IACUC onaylanmış yöntemler (örneğin, anestezik doz aşımı ya da bir ikincil yöntem izledi CO 2 boğulma) kullanarak hayvan kurban.
  6. Daha fazla diseksiyon için doku stabilize, mesane kubbesi, boyun ve üreterler yoluyla doku kesme işaretçilerine yerleştirin. Doku germeyin. Yağ, bağ dokusu, proksimal üretra ve üreter varsa çıkarın.
  7. Düz bir sayfası oluşturmak için kubbeye tabanından mesane açın, serozayı tarafı aşağı / lümen tarafı yukarı (Şekil 1B). Doku her köşesinde kesme işaretçilerine yerleştirin. Mesane dom KaldırE ve boyun doku.
  8. Deneyin amacı mukozasında (ürotelyum ve lamina propria - diyagram Şekil 1C bakınız) katkısını belirlemek için ise düz kas kasılması için, ile ve ekli mukozasında olmadan detrüsör şeritler özelliklerini karşılaştırın. Bunun için, şeritler dokusunun kesilmesi öncesinde, dikkatli bir şekilde, iris bir tahlil mikroskobu altında makas ve ince forseps yay kullanarak mukoza tabakasının çıkarın. Deneyin sonunda, mukoza tamamen çıkarılmasını teyit etmek için H & E boyaması için şeritler sabitleyin. Bu prosedür, fare mesane daha fare mesane daha kolay olduğuna dikkat edin.
  9. ~ 2 x 8 mm (Şekil 1B) şeritler halinde kubbe tabandan boyuna doku kesilir. Kravat ya da her şeridin iki ucunda bir doku klip ekleyin.
    NOT: Bir fare mesane, genellikle 4 şeritler halinde kesilebilir, ancak dilimlerin sayısını artırabilir veya azaltmak hayvan / mesane boyutuna bağlı olarak değişir.
  10. Exper şerit aktarmaimental odaları. Bir doku kasılmasını ölçen bir kuvvet transformatörüne, her bir şeridin ucunu, sabit bir cam / metal çubuğun diğer takın.
    Not: Doku odaları boyutu (20 mi ya da daha büyük 0.2 mi) değişir. Kemirgen mesanesi için tipik odaları şeritler tamamen solüsyona daldırılır edilmesi için yeterli bir yükseklik sağlamak 5-20 mi vardır. Bazı odaları yerleşik uyarım elektrotları, başkaları ile değil gelir. Bakım türlü elektriksel alan stimülasyonu güvenilir değildir, tüm elektrotların bağlantıları iyi durumda olmasını sağlamak için alınmalıdır.
  11. Temel tansiyon, 1 g (~ 10 mi) içindeki ulaşıncaya kadar yavaşça doku germe her şerit kuvvet belirli bir miktarda uygulanır. Başlangıçta doku başlangıç ​​gerilmesinde bir azalma olarak kaydedildiği dinlenmek eğilimindedir. Yıkama doku yaklaşık ve sıcak gazlı Krebs kullanarak her 15 dk her yıkamadan sonra 1 g temel gerginliğini ayarlayın. (Temel tansiyon istikrarlı doku ~ için 1-2 saat kadar ya da gelmesini sağlayınyani başka doku gevşeme).
  12. ~ 5 dakika için ya da bir plato yanıt kadar banyoya doğrudan KCI (80 mM) eklenerek test dokusu canlılığı ulaşılır. KCI yüksek konsantrasyonlarda yanıtlar da deney sırasında ya da deneyin sonunda tekrarlanır ve (veri analiz bölümü altında normalleştirme bakınız) şeritler diğer ilaçlara yanıtları arasında ya da normalize etmek için kullanılabilmektedir.
  13. Sıcak gazlı Krebs ile yıkayın doku birden çok kez (3-5x) doku ön arıtma koşulları dönmek için izin vermek.

4. Stimülasyon Protokolleri

  1. SCI, Yİ, veya yenidoğanlarda gibi farklı hayvan modellerinde düz kas şeritleri kullanmak, spontan myojenik aktivite veya düz kas tonusu üzerinde patoloji etkilerini araştırmak. Şekil 2 gelişimi sırasında mesane spontan aktivite değişiklikleri araştırmak amacıyla bu yöntemin kullanımını göstermektedir ve SKY sonrası. Buna ek olarak, çeşitli ilaç sp modüle etmek için de kullanılabilirontaneous faaliyet. Şekil 3, spontan aktivite ve düz kas üzerindeki KCNQ kanal modülatörlerinin, flupirtinin ve XE991, etkisini göstermektedir.
  2. Doğrudan belirlenen zaman aralıklarında banyosuna konsantre stok çözeltilerinden bileşiklerin ilave edilmesi ile, farmakolojik düz kas uyarımı konstrukt konsantrasyon yanıt eğrileri için. Araç ve zaman etkilerinin hesaba paralel şeritler halinde ilaç ve araç kullanın.
    1. 1000x son çalışma konsantrasyonu istenilen Test bileşiklerinin stok çözeltileri hazırlanır. 10 5 M, 3 x 10 5 M, 10 4 M, 3 x 10 4 M, 10 3 M, 3 x 10 3 M: karbakol (CCH), bir muskarinik reseptör agonisti, aşağıda stoklarını 10 -2 M. Banyosu içinde nihai konsantrasyonlar 10 -5 M (Şekil 4C, D) ile 10 M -8. 10 -8 M, 10 -7: neuromedin B (NMB'de), bir bombesin reseptör alt 1 agonisti için aşağıdaki stokları hazırlamakM, 10 -6 M, 10 5 M, 10 4 M, 10 3 M ve banyo içinde nihai konsantrasyonlar olarak 10 -11 M'ye 10 -6 M CCh ve NMB Hem doku kasılmasını artması beklenmektedir.
    2. Bu cevap, bir plato (Şekil 4C, D) ulaşana kadar bir 10 ml doku banyosuna için, kısa sürede her CCh stok çözeltisinden 10 ul ekle. Paralel şeritler halinde, taşıyıcının (su) eşit bir şekilde artırmıştır. Benzer şekilde, her neuromedin B stok çözeltisi 10 ul her ~ 5 dakika ekleyin.
      NOT: Şekil 4 farklı türlerden şeritler halinde düz kas tonusu üzerinde NMB'de ve CCH uyarıcı etkisini gözlemleyin.
    3. Bir uyarıcı madde, genellikle CCH veya KCl ile ön-sözleşmeli dokuda düz kasların gevşemesi özelliklerini incelemek.
    4. Bir agonist tepkisini bloke etmek için, stimülasyon Agonisti önce doku penetrasyonu izin vermek için antagonisti ile 10-20 dakika boyunca ön-işleme tabi doku.
  3. Sinir stimülasyonu içindüz kas simülasyonu olarak da adlandırılan elektrik alan uyarımı (EFS) 3.13 adım 1 ila takip ve aşağıda açıklandığı gibi devam edin. EFS, seçici olarak düz kas sinirlerinin karşı aktif hale getirmek için tasarlanmıştır. Uyarılması için parametrelerin dikkatle doğrudan düz kas uyarmayı önlemek üzere seçilmelidir.
    1. Stimülasyon parametreleri Kurmak: Aşağıdaki adımlarda açıklanan ve Şekil 5A, B de gösterildiği gibi uyarıcı (tek darbeler veya trenler), süresi (darbe süresi ve tren süresi), sıklığı ve şiddeti, tipi.
      1. Tek darbe uyarım, seti darbe süresi, inter-uyaran aralığı ve istenen uyaranların sayısı için. Her zamanki stimülasyon süre parametreleri istenilen aralıklarla (Şekil 5A) teslim 0.05-0.3 msn süresince tek sinyallerdir. Uyaran yoğunluğu için adımı 4.3.1.4 izleyin.
      2. Tren uyarılması için, tren süresini ve inter tren aralığını ayarlayın. Mesane dokusu için tipik değerler 3-10 sn en az 1 m teslim edilirayrı olarak (Şekil 5B). Doku yorgunluk (yani EFS kasılmaları kontrol döneminde azalma) oluşursa, arası tren aralığını artırın.
      3. Bir tren bakliyat tren uyaranlara sıklığını (dizi Kurmak - Şekil 5B). 0.5-50 Hz arasındaki bir frekans tepkisi eğrisi. Kesesi için tipik frekans ATP ve ACh ile aracılık tekrar üretilebilir ve kararlı kasılmalar elde 10-20 Hz bulunmaktadır. Bu yöntem, kolinerjik ve sinirsel purinerjik mekanizmaların katkısını araştırmak için nasıl kullanılabileceğini gösteren Şekil 5 fare mesane şeritler EFS uyarısına frekansa bağımlı tepkiler dikkate alınmalıdır.
      4. Uyaranın şiddeti Kurmak: daralmanın genlik bir plato ulaşıncaya kadar (kullanarak trenler frekans sabit tutarsanız) sistematik uyaran yoğunluğunu (voltaj) artar.
      5. Bağlı olarak uyaran yoğunluğunu ayarlayınDeney hedefliyoruz. Amaç, nöral-uyarılmış kasılma artırmak için ise, o zaman kasılma büyüklüğü ~ maksimum kontraksiyonun% 50 olacak şekilde, submaksimal yoğunluğu kullanılır. Amaç, nöral-uyarılmış kasılma azaltmak için ise, daha sonra ~ en yüksek amplitüdde% 80 doku yorgunluğu önlemek için yoğunluğunu ayarlamak için.
    2. Stimülasyon parametreleri (süresi, sıklığı ve yoğunluğu) oluşturulduktan sonra, EFS- için 20-30 dk uyuşturucu testi öncesinde stabilize kasılmaları uyarılmış ~ izin verir.
      NOT: (; 0.5-1 mcM TTX) sinir iletim, Na + kanal blokörü, tetrodotoksin'in blok sinir iletimi için EFS seçiciliği doğrulamak için. TTX nispeten kolay yıkar gibi, deney başında bu adımı gerçekleştirin. Buna ek olarak, (aşama 4.3.5 bkz. Aşağıda), deneyin sonunda bu gerçekleştirin.
    3. Son işleme konsantrasyonları için 1,000x de stok çözelti hazırlayın: alfa, beta-metilen ATP (ABMA, purinerjik alıcı aktivatörüve desensitize edici) -2 10 E, atropin (muskarinik alıcı antagonisti) 3 M 10 (Şekil 5C). Şekil 6'da başka örnekler dikkate alınmalıdır. 5HT4 reseptör agonisti, sisaprid ile (3 x 10 -6 M, 10 -6 M, 3 x 10 5 M, 10 5 M, 3 x 10 4 M, 10 4 M, 3 x 10 -3 M, 10 -3 M), doku kasılma ve SB-203186 (3 x 10 -3 M), bir 5HT4 reseptör antagonisti artırır sisapridi etkilerini tersine çevirir.
    4. EFS (Şekil 5C) üzerindeki etkilerini ABMA atropin ve test edilmesi için, iki kontrol frekans tepkisi eğrileri gerçekleştirin. 10 uM'lik bir son konsantrasyon elde etmek üzere banyo 10 -2 M ABMA 10 ul. Bu durum düz kas purinerjik reseptörlerinin doğrudan uyarılması doku küçülecek. Başlangıca yanıt döndükten sonra, frekans tepkisi eğrileri tekrarlayın. Son bir concentrat için 10 -3 M atropin 10 ul ekle1 uM'lik iyonu temsil etmektedir. (Muskarinik reseptörleri bloke atropin için gerekli) ~ 10 dakika, tekrar frekans tepkisi eğrileri sonra. Paralel şeritler halinde, her bir adımda, taşıyıcı olarak, su, 10 ul ekle.
      Not: Şekil 6 'da, diğer örnekler için, tanımlı zaman aralıklarında (~ 15 dakikada; tartışmaya bakınız) her sisaprid stok çözeltisi 10 ul doğrudan banyoya SB-203186 stok solüsyonu, 10 ul ve ardından ve üzerindeki etkisini izlemek daralma EFS neden oldu. Paralel şeritler halinde, aracın, 10 ul DMSO ilave edin. Sisapridin etkilerini incelemek, Şekil 6 'da insan mesane karaciğer, akciğer dokularında EFS uyarılmış kasılma bir 5HT4 reseptör agonisti,. İlave olarak, insan mesane ve ileum dokularda EFS uyarılmış kasılmaları üzerindeki etkisini DMSO, sisapridin için araç, gözlemlemek .
    5. EFS protokol sonunda Na + kanal blokörü, tetrodotoksin'in (TTx ile nöral iletimi bloke ederek EFS seçiciliğini doğrulamak; 0.5-1 &181. M). TTX dirençli kasılmalar hala varsa, daha sonraki deneylerde uyaran süresini ve yoğunluğunu ayarlamak için tavsiye edilir.
  4. Öncesi veya post-sinaptik sitelerinde (Şekil 7A) ilaçların etkilerini belirlemek için 4.3.2 izleyin 1. Karbakole tekrarlanabilir yanıtları oluşturulması ve EFS, daha sonra uyuşturucu X eklemek
  5. Deneyin sonunda, sökülüp takılmasını veya şeritler çöz ekstra sıvı ortadan kaldırmak ve bir denge kullanarak her bir şeridin ağırlığı ölçmek için ince kağıt parçası üzerine nazikçe bekletin. Ayrıca, enine kesit alanı belirlemek için bir kumpas kullanılarak doku uzunluğunu ölçer. Bu bilgiler veri normalizasyonu için kullanılır (bölüm 5.4).

5. Veri Analizi

Yeterli yazılımını kullanarak verileri analiz (örneğin, Windaq, LabChart).

  1. Spontan aktivite için, önce ve ilaç kaynaklı yanıt ve beni zirvesine en az 30 saniye, bir pencere seçmekaşure genlik ve Miyojenik aktivite sıklığı (Şekil 3).
    1. Mesane farklı parçaları arasındaki farklar vardır yanıtları kasılma olup olmadığını katkıda frekansların spektrumunu belirlemek için hızlı Fourier dönüşüm analizi kullanın (örneğin, boyun vs kubbe) veya geliştirme, patoloji, ve uyuşturucu 8 ile.
  2. Düz kas üzerindeki etkiler için, önce ve ilaç uyarımlı tepkisinin zirvesine en az 10-30 saniyelik bir pencere seçmek ve büzülme genlik ölçmektedir.
  3. Nöral ile uyarılan kasılmaları üzerindeki etkiler için, önce ve ilaca bağlı yanıtının tepe noktasında kasılmaları eğrisi (en az 3) altında genlik, süresi ve alanı ölçer.
    Not: Bu, purinerjik ve kolinerjik bileşenler farklı olan bir kinetiğe sahiptir, çünkü EFS uyarılan kasılmaların eğri altındaki alanı, hem de amplitüd ve ölçmek gereklidir. Purinerjik bileşen hızlı ve geçicidir (ATP purinergi aktivekalsiyum hızlı akışını izin veren bu P2X1 c iyonotropik kanallar, daha sonra bu şekilde, eğri altındaki alan en yüksek amplitüdü yanıt daha az katkıda) desensitize. Kolinerjik bileşeni (ACh sonuçta bir daralma ikna etmek düz kas depolarize iyon kanallarını aktive hücre içi yolları aktive daha fazla zamana ihtiyaç metabotropik muskarinik reseptörleri aktive) yavaş ve sürekli olduğunu. Dolayısıyla, muskarin ile ilgili bölümü eğri altındaki alanın ölçülmesi ve daha iyi yakalanır.
  4. Şeritler ve farmakolojik tedavilerde sonuçlarını karşılaştırmak mümkün veri normalleştirmek. Normalleştirme için seçilen parametre patolojik durum, araştırma veya deney tasarımı, test bileşikleri ile etkilenmemelidir. Bu parametreler, kullanım şerit ağırlığına enine kesit alanı, KCI tepkisinin (Şekil 4B), bir kasılma ajana en yüksek tepkinin maksimum tepki (Şekil 7B) ve%% 'si arasında,(Örneğin, CCh) veya rahatlatıcı maddeler (örneğin, papaverin).

Sonuçlar

Spontan andMyogenic Etkinlik

Spontan Miyojenik etkinlik sonrası gelişim 6-9 ve patoloji (örneğin, SCI, Yİ) 3-5 ile değişikliğe uğrar önemli bir düz kas özelliğidir. Bu aktivite aşırı aktif mesane (AAM), 2 belirtilerine katkıda inanılmaktadır çünkü, onu modüle reseptörleri, hücre içi yollar ve farmakolojik ajanların bir değerlendirme, AAM ve diğer düz kas fonksiyon bozuklukları için etkili tedaviler gel...

Tartışmalar

Bu yazıda mesane fizyolojisi ve patolojisi, yanı sıra mesane bozukluklarının tedavisinde yeni ilaçların keşfini yardım ile ilgili önemli bilimsel sorular çok sayıda adrese kullanılabilir vitro düz kas kasılması yönteminde basit bir tarif. Biz, mesane düz kas kasılmasının, gelişim, patolojik ve farmakolojik özellikler (Şekil 2-4), sinir iletimini modülasyonu (Şekil 5-7A), tür farkları (Şekil 4), organ farklılıkları değer...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.

Teşekkürler

Bu çalışma LB NIH R37 DK54824 ve R01 DK57284 hibe ile desteklenmiştir

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Tissue Bath System with ReservoirRadnoti, LLC159920isolated tissue baths
Warm water recirculator pumpKent Scientific Corporation TPZ-749to keep tissue baths to 37 °C
Computer
Data Acquisiton SystemDataQ InstrumentsDI-710-UHTo view, record and analyze data
Transbridge Transducer AmplifierWorld Precision InstrumentsSYS-TBM4MTransducer amplifier
Grass stimulatorGrass TechnologiesModel S88Stimulator
Anesthesia SystemKent Scientific Corporation ACV-1205STo anesthetesize the animal
Anesthetizing BoxHarvard Apparatus500116To anesthetesize the animal
Anesthesia MasksKent Scientific Corporation AC-09508To anesthetesize the animal
Materials and Surgical Instruments
SylgardDow Corning Corp184 SIL ELAST KITTo pin, dissect, & cut tissue
Petri DishCorning3160-152To dissect/cut tissue
Insect PinsENTOMORAVIA Austerlitz Insect PinsSize 5To pin tissue
Bench PadVWR International56617-014Absorbent bench underpads
Rat surgical KitKent Scientific Corporation INSRATKITTo remove and dissect tissue
2 Dumont #3 ForcepsKent Scientific Corporation INS500064To remove and dissect tissue
Tissue ForcepsKent Scientific Corporation INS500092To remove and dissect tissue
ScalpelKent Scientific Corporation INS500236To remove and dissect tissue
Scalpel bladeKent Scientific Corporation INS500239To remove and dissect tissue
Professional Clipper Braintree Scientific, Inc.CLP-223 45To remove fur
Suture ThreadFine Science Tools18020-50Tie tissue
Tissue ClipsRadnoti, LLC158802Attach tissue to rod/transducer
1 g weight Mettler Toledo11119525For transducer calibration
Chemicals
Krebs Solution:
Sodium chloride
Potassium chloride
Monobasic potassium phosphate
Magnesium sulfate
Dextrose
Sodium bicarbonate
Calcium chloride
Magnesium chloride		 
Sigma
Fisher
Fisher
Fisher
Fisher
Sigma
EMD
Baker		 
S7653
P217-500
P285-3
M65-500
D16-500
S5761
CX0130-2
2444		To prepare Krebs solution
IsofluraneHenry Schein029405To anesthetesize the animal
 Oxygen tankMatheson Tri Gasox251To use with anesthesia system
Carbogen Tank (95% Oxygen; 5% Carbon Dioxide) Matheson Tri GasMoxn00hn36DTo aerate Krebs solutions

Referanslar

  1. Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nat Rev Neurosci. 9, 453-466 (2008).
  2. Andersson, K. E. Detrusor myocyte activity and afferent signaling. Neurourol Urodyn. 29, 97-106 (2010).
  3. Artim, D. E., et al. Developmental and spinal cord injury-induced changes in nitric oxide-mediated inhibition in rat urinary bladder. Neurourology and urodynamics. 30, 1666-1674 (2011).
  4. Kita, M., et al. Effects of bladder outlet obstruction on properties of Ca2+-activated K+ channels in rat bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 298, 1310-1319 (2010).
  5. Barendrecht, M. M., et al. The effect of bladder outlet obstruction on alpha1- and beta-adrenoceptor expression and function. Neurourol Urodyn. 28, 349-355 (2009).
  6. Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. Postnatal development of myogenic contractile activity and excitatory innervation of rat urinary bladder. The American journal of physiology. 247, 972-978 (1984).
  7. Ng, Y. K., de Groat, W. C., Wu, H. Y. Smooth muscle and neural mechanisms contributing to the downregulation of neonatal rat spontaneous bladder contractions during postnatal development. American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology. 292, 2100-2112 (2007).
  8. Szell, E. A., Somogyi, G. T., de Groat, W. C., Szigeti, G. P. Developmental changes in spontaneous smooth muscle activity in the neonatal rat urinary bladder. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 285, 809-816 (2003).
  9. Szigeti, G. P., Somogyi, G. T., Csernoch, L., Szell, E. A. Age-dependence of the spontaneous activity of the rat urinary bladder. J Muscle Res Cell Motil. 26, 23-29 (2005).
  10. Frazier, E. P., Braverman, A. S., Peters, S. L., Michel, M. C., Ruggieri, M. R. Does phospholipase C mediate muscarinic receptor-induced rat urinary bladder contraction. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 322, 998-1002 (2007).
  11. Xin, W., Soder, R. P., Cheng, Q., Rovner, E. S., Petkov, G. V. Selective inhibition of phosphodiesterase 1 relaxes urinary bladder smooth muscle: role for ryanodine receptor-mediated BK channel activation. American journal of physiology. Cell physiology. 303, 1079-1089 (2012).
  12. Frazier, E. P., Peters, S. L., Braverman, A. S., Ruggieri, M. R., Michel, M. C. Signal transduction underlying the control of urinary bladder smooth muscle tone by muscarinic receptors and beta-adrenoceptors. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 377, 449-462 (2008).
  13. Svalo, J., et al. The novel beta3-adrenoceptor agonist mirabegron reduces carbachol-induced contractile activity in detrusor tissue from patients with bladder outflow obstruction with or without detrusor overactivity. European journal of pharmacology. 699, 101-105 (2013).
  14. Yokota, T., Yamaguchi, O. Changes in cholinergic and purinergic neurotransmission in pathologic bladder of chronic spinal rabbit. J Urol. 156, 1862-1866 (1996).
  15. Bayliss, M., Wu, C., Newgreen, D., Mundy, A. R., Fry, C. H. A quantitative study of atropine-resistant contractile responses in human detrusor smooth muscle, from stable, unstable and obstructed bladders. J Urol. 162, 1833-1839 (1999).
  16. Kullmann, F. A., McKenna, D., Wells, G. I., Thor, K. B. Functional bombesin receptors in urinary tract of rats and human but not of pigs and mice, an in vitro study. Neuropeptides. 47, 305-313 (2013).
  17. Sadananda, P., Kao, F. C., Liu, L., Mansfield, K. J., Burcher, E. Acid and stretch, but not capsaicin, are effective stimuli for ATP release in the porcine bladder mucosa: Are ASIC and TRPV1 receptors involved. European journal of pharmacology. 683, 252-259 (2012).
  18. Maggi, C. A., et al. Species-related variations in the effects of capsaicin on urinary bladder functions: relation to bladder content of substance P-like immunoreactivity. Naunyn-Schmiedeberg's archives of pharmacology. 336, 546-555 (1987).
  19. Kullmann, F. A., et al. Effects of the 5-HT4 receptor agonist, cisapride, on neuronally evoked responses in human bladder, urethra, and ileum. Autonomic neuroscience : basic & clinical. 176, 70-77 (2013).
  20. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Human tachykinin NK2 receptor: a comparative study of the colon and urinary bladder. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30, 632-639 (2003).
  21. Zoubek, J., Somogyi, G. T., De Groat, W. C. A comparison of inhibitory effects of neuropeptide Y on rat urinary bladder, urethra, and vas deferens. The American journal of physiology. 265, 537-543 (1993).
  22. Warner, F. J., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationship of neurokinin A(4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the effect of amino acid substitutions on receptor affinity and function. Biochem Pharmacol. 63, 2181-2186 (2002).
  23. Warner, F. J., Mack, P., Comis, A., Miller, R. C., Burcher, E. Structure-activity relationships of neurokinin A (4-10) at the human tachykinin NK(2) receptor: the role of natural residues and their chirality. Biochem Pharmacol. 61, 55-60 (2001).
  24. Dion, S., et al. Structure-activity study of neurokinins: antagonists for the neurokinin-2 receptor. Pharmacology. 41, 184-194 (1990).
  25. Somogyi, G. T., Zernova, G. V., Yoshiyama, M., Yamamoto, T., de Groat, W. C. Frequency dependence of muscarinic facilitation of transmitter release in urinary bladder strips from neurally intact or chronic spinal cord transected rats. British journal of pharmacology. 125, 241-246 (1998).
  26. Andersson, K. E., Wein, A. J. Pharmacology of the lower urinary tract: basis for current and future treatments of urinary incontinence. Pharmacological reviews. 56, 581-631 (2004).
  27. D’Agostino, G., Condino, A. M., Gallinari, P., Franceschetti, G. P., Tonini, M. Characterization of prejunctional serotonin receptors modulating [3H]acetylcholine release in the human detrusor. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics. 316, 129-135 (2006).
  28. Hawthorn, M. H., Chapple, C. R., Cock, M., Chess-Williams, R. Urothelium-derived inhibitory factor(s) influences on detrusor muscle contractility in vitro. British journal of pharmacology. 129, 416-419 (2000).
  29. Chaiyaprasithi, B., Mang, C. F., Kilbinger, H., Hohenfellner, M. Inhibition of human detrusor contraction by a urothelium derived factor. J Urol. 170, 1897-1900 (2003).
  30. Testa, R., et al. Effect of different 5-hydroxytryptamine receptor subtype antagonists on the micturition reflex in rats. BJU international. 87, 256-264 (2001).
  31. Craggs, M. D., Rushton, D. N., Stephenson, J. D. A putative non-cholinergic mechanism in urinary bladders of New but not Old World primates. J Urol. 136, 1348-1350 (1986).
  32. Fry, C. H., Bayliss, M., Young, J. S., Hussain, M. Influence of age and bladder dysfunction on the contractile properties of isolated human detrusor smooth muscle. BJU international. 108, 91-96 (2011).
  33. Kennedy, C., Tasker, P. N., Gallacher, G., Westfall, T. D. Identification of atropine- and P2X1 receptor antagonist-resistant, neurogenic contractions of the urinary bladder. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 27, 845-851 (2007).
  34. Levin, R. M., Danek, M., Whitbeck, C., Haugaard, N. Effect of ethanol on the response of the rat urinary bladder to in vitro ischemia: protective effect of alpha-lipoic acid. Molecular and cellular biochemistry. 271, 133-138 (2005).
  35. Malysz, J., Afeli, S. A., Provence, A., Petkov, G. V. Ethanol-mediated relaxation of guinea pig urinary bladder smooth muscle: Involvement of BK and L-type Ca2+ channels. American journal of physiology. Cell physiology. 306, 45-58 (2013).
  36. Longhurst, P. A., Briscoe, J. A., Rosenberg, D. J., Leggett, R. E. The role of cyclic nucleotides in guinea-pig bladder contractility. British journal of pharmacology. 121, 1665-1672 (1997).
  37. Takahashi, R., Yunoki, T., Naito, S., Yoshimura, N. Differential effects of botulinum neurotoxin A on bladder contractile responses to activation of efferent nerves, smooth muscles and afferent nerves in rats. J Urol. 188, 1993-1999 (2012).
  38. Sadananda, P., Chess-Williams, R., Burcher, E. Contractile properties of the pig bladder mucosa in response to neurokinin A: a role for myofibroblasts. British journal of pharmacology. 153, 1465-1473 (2008).
  39. Liu, G., Daneshgari, F. Alterations in neurogenically mediated contractile responses of urinary bladder in rats with diabetes. American journal of physiology. Renal physiology. 288, 1220-1226 (2005).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 90Krebst r farkl l klarIn vitroD z kas kas lmassinir stim lasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır