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要約

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

要約

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

概要

血管の内皮内層に損傷は止血応答、または血栓の形成を通じて修復される。血液は、細胞外マトリックスに浸透すると、組織因子は、凝固カスケードの開始を容易に血流中の血小板を活性化する。この治癒過程の重要な機械的な構成要素は、高弾性であるフィブリン繊維からなるフィブリンマトリックスであり、かつ大きな力1-4を維持することができる。多くの研究が盛んに過去数十5-13フィブリンの形成構造、および機能を研究している。

例えば、糖尿病および鎌状赤血球のような疾患を有する患者は、心筋梗塞、虚血性心疾患、および脳卒中14-19として血栓性合併症を発症するリスクを有する。 200万人以上の人が新たに米国で毎年糖尿病と診断されている。タイプI：糖尿病には2つの種類があります本体は、体がインスリン抵抗性となり、インスリン、およびタイプII、十分な量を生産することができない。糖尿病患者では、心血管疾患（CVD）は、疾患20,21に関連する罹患率および死亡率の80％の原因である。

鎌状赤血球症（SCD）は、米国22で10万人以上の人々に影響を与える遺伝的血液疾患です。 SCDは難しい細胞が血管系23を通過できるようにすること、三日月形になるように、赤血球を引き起こす点突然変異疾患である。これらの疾患状態の両方は、体内のア​​テローム血栓性の状態を発症する可能性を高める。この理由の一つは、疾患状態14,24-26における変化したフィブリン構造と機能の結果である。

糖尿病や鎌状赤血球症の両方において、アテローム血栓症および心血管疾患（Cを誘導し、凝固亢進とhypofibrinolysis活動がありますVD）健康な患者17,27,28と比較した。これはhypofibrinolysisは、アテローム性動脈硬化症の進行を促進し、早期冠動脈疾患を有する患者について29再発虚血イベントを拘禁することが知られている。現在の原稿では、この特定の設定で、フィブリンの物理的特性の役割を調べた。非疾患患者におけるフィブリン血餅の構造は、薄い繊維、より大きな孔、及び一般に低密度の14,24で構成されている。健康な患者における気孔率の増加及び低密度のフィブリン塊は、線溶16を容易にすることが見出されている。糖尿病及び鎌状赤血球症などhyperthrombotic条件で、健康な患者30-33に2.5 mg / mlの正常レベルから増加するフィブリノーゲン濃度を引き起こすフィブリノゲン産生の増加がある。健康な、非直径と比較して、糖尿病患者に形成されたフィブリン塊は、以上の分岐点を有する、より高密度、より剛性の、多孔性の低いことが見出されているbetic患者14,24,33-35。改変されたフィブリン構造が血栓形成に関与するタンパク質中に存在する糖化メカニズムの結果である。グルコース分子が適切に架橋グルタミンおよびリジン残基33,36,37からのヒト第XIIIa因子（活性化XIII因子）を阻害フィブリノゲン分子、上のリジン残基に結合したときに非酵素（不可逆）糖化が起こる。

フィブリンネットワークの構造解析は、最近広く研究されている。特に、研究者は、電子顕微鏡および血管（内皮）細胞および血管外（線維芽細胞および平滑筋）双方の細胞がフィブリン構造40を分析するフィブリン構造39を利用粘弾性スペクトル解析にどのように影響するかを調べたフィブリンネットワーク38の3D再構成などを利用している実験を使用してフィブリン構造と機械的特性との間の相関を開発し、計算は、41に近づく 。現在の研究の焦点は、シミュレートされた糖尿病及び鎌状赤血球症条件下血餅構造を定式化し、疾患状態における血塊の構造および機能の検査のために、共焦点顕微鏡を使用することであった。フィブリン塊は、ヒトフィブリノーゲン、ヒトトロンビン、および活性化XIII因子から形成された。血栓は、プラスミンを用いて溶解した。糖尿病状態をシミュレートするために、フィブリノゲン濃度の増加は、 インビトロでのフィブリノーゲン糖化を誘発するためにグルコース溶液中でインキュベートした。鎌状赤血球症凝固条件をシミュレートするために、増加したフィブリノゲン濃度は、我々のグループ42によって、以前に行われたように患者から採取した鎌状赤血球ヘマトクリットと混合した。これらの方法は、構造および機能病的条件下でのフィブリン塊の形成及びフィブリン溶解に関与するだけでなく、CVDを誘導するメカニズムを調べた。これらの疾患についての現在の情報に基づいて、糖化されたフィブリン塊構造は、少数のAでより高密度であったND小さな孔。鎌状赤血球患者からの赤血球（RBC）とフィブリン塊はまた、より高密度でありRBCおよび凝集フィブリンクラスターの凝集を示した。これは、以前に43決定された十分に確立された現象である。また、線維素溶解率が健全な、正常なフィブリンと比較して減少しプラスミンとない糖化フィブリン塊に有意に低いであろうと仮説を立てた。結果は、糖化フィブリン塊のために、著しく異なる溶解速度の結果だけ減少プラスミン濃度の条件下で観察されたことを示した。細胞およびタンパク質が凝固活性のリアルタイムビデオのキャプチャを可能にするそれらの天然の状態で残っているため、共焦点顕微鏡を使用して、この実験的手法は、他の撮像方法を超える有意な利点を提供する。合成的に誘導凝固のこの方法は、患者のサンプルを取得し、個々のフィルタリングより効率的で安価でより多くの時間であるタンパク質および酵素。サンプル間のばらつきは、プラズマ中の他のタンパク質の結果として存在しなかったように、また、血栓を合成するために分離されたタンパク質および酵素を使用することにより、血栓を標準化した。

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プロトコル

注：以下のプロトコルは、ジョージア工科大学の治験審査委員会（IRB）によって設定されたガイドラインに準拠しています。

1.採血およ​​び赤血球単離法

  1. 10ミリリットルのヘパリン化バキュテナーチューブ中にドナーからの血液の40〜120ミリリットルを収集します。コレクションの4時間以内にPBMC（末梢血単核細胞）の分離を開始します。この時間中、RTで血液を保つ。
    注：これは下PBMCの収量になりますようにRTまたは4℃における血液のO / Nストレージが推奨されていません 。
  2. 氷冷（4℃）を滅菌PBSで1：全血の1希釈する。
  3. ピペット空、無菌の50mlの円錐チューブに氷のように冷たい親水性多糖類の10ミリリットル。静かに親水性多糖類の上に希釈した全血を移す。
  4. 非常にゆっくりとチューブの側面に沿ってゆっくり設定やピペット血液中の25ミリリットルピペットを使用してください。血液が前にセントリに糖類と混合されていないことを確認してくださいfugation親水性多糖類は、細胞に対して毒性とそうでない場合であるため、PBMCの収率が低くなります。
  5. 4℃で400×gで30分間遠心血液サンプル。可能な場合は、遠心分離後の良好な分離のための最大値の半分に遠心分離機のブレーキ速度を低下させる。
  6. 遠心分離した血液サンプルの血漿/血小板分画から吸引する。慎重に直接パックRBC層の上に親水性の多糖類の層を吸引除去する。
  7. パックされたRBCの8〜10ミリリットルを収集し、1希釈する：非無菌の0.9％NaCl生理食塩水で1を。

2.共焦点顕微鏡評価糖化の血塊構造（模擬糖尿病血塊）

  1. 37℃でのヒトフィブリノーゲンおよび蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を解凍。
  2. マイクロ遠心チューブを卒業した0.5ミリリットルに次のようにピペット。
    1. 健康、通常のフィブリノゲンの塊については、10％の蛍光標識したヒトフィブリノーゲンヒトフィブリノゲンをミックス5 mg / mlの濃度で50mMのトリス/ 100mMのNaCl緩衝液中のコンジュゲート。
    2. 人工的に糖化フィブリノゲンは、（糖尿病血栓をシミュレートするため）6.8 mg / mlでの得られた濃度50mMのトリス/ 100mMのNaClに溶解したグルコースの5 mM溶液中のヒトフィブリノーゲンおよび10％の蛍光標識されたフィブリノゲン結合体をインキュベートする。
  3. 光への曝露を避けるために、不透明材料を用いたマイクロ遠心管を覆う。 48時間、37℃の水浴中でチューブをインキュベートする。
  4. スライドの2側面に薄い接着剤を貼り付けてガラス顕微鏡スライド上室を作る。
  5. 48時間のインキュベーション期間の後、RTで活性化XIII因子およびヒトαトロンビンを解凍することによってフィブリン形成のための試薬を調製する。
  6. 5のCaCl 2のバッファに80 U / mlに活性化XIII因子を希釈します。
  7. 5のCaCl 2のバッファに4 U / mlにトロンビンを希釈します。
    1. 通常の血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度は2.5メートルであることを確認G / mlで、20 U / mlで、それぞれ50μlの容量で1単位/ ml、。
    2. 糖化血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度がそれぞれ50μlの容量で、3.4 mg / mlの、20 U / mlとし、1単位/ mlであることを確認してください。
  8. すぐに接着剤によって形成されたチャンバー内にフィブリン溶液を30μlのピペット。
  9. 接着剤の2層の上に0.15ミリメートルの厚さの22ミリメートル×22 mmのガラスカバースリップを置きます。乾燥からフィブリン塊を防止するための明確な接着剤で開放側をシール。接着剤はフィブリン塊と相互作用しないことを確認してください。
  10. フィブリン塊は、共焦点イメージングの前に2時間21〜23℃で重合することができるようにします。
  11. 488nmのアルゴンレーザーを40X / 1.30オイルM27レンズを共焦点顕微鏡を用いて血栓の共焦点顕微鏡画像を取る。

鎌状赤血球患者からRBCを含むフィブリン塊の3共焦点顕微鏡評価

  1. 37℃でのヒトフィブリノーゲンおよび蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を解凍。
  2. マイクロ遠心チューブを卒業した0.5ミリリットルに次のようにピペット。
    1. 健康な、正常なフィブリン塊のために、5mg / mlの濃度で50mMのトリス/ 100mMのNaCl緩衝液中の10％の蛍光標識されたヒトフィブリノーゲン複合体とヒトフィブリノゲンを混ぜる。
    2. SCD RBCを含む塊、ヒトフィブリノーゲン及び50mMトリス/ 100mMのNaClフィブリノーゲンの得られる濃度が10 mg / mlであるような、10％、蛍光標識されたヒトフィブリノゲン結合体を混合する。
  3. 細胞標識溶液を使用して（通常のとRBC分離プロトコルから取得した鎌状赤血球患者からのもの両方）を単離したRBCにラベルを付けます。
    1. 任意の選択された無血清培地1ml当たり1×10 6の密度で細胞を懸濁。
    2. 細胞標識溶液に細胞懸濁液の5μL/ mlのを追加します。優しく穏やかにピペッティングでよく混ぜる。
    3. は37℃で20分間インキュベートする。
    4. 37℃で5分間1500 rpmで標識されたサスペンションチューブを遠心する。
    5. 上清を除去し、静かに37℃の培地中の細胞を再懸濁。
    6. 洗浄手順（3.3.4および3.3.5）をさらに2回繰り返します。
  4. 5のCaCl 2のバッファに80 U / mlに活性化XIII因子を希釈します。
  5. 5のCaCl 2のバッファに4 U / mlにトロンビンを希釈します。
    1. 通常の血栓のために、フィブリノゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度がそれぞれ50μlの容量で、2.5 mg / mlの、20 U / mlとし、1単位/ mlであることを確認してください。
    2. SCD RBCを含む塊については、フィブリノーゲン、活性化XIII因子、およびトロンビ​​ンの最終濃度は、50μlの容量でそれぞれ5 mg / mlの、20 U / mlであり、1 U / mlであること。確実
  6. フィブリン溶液へのラベルRBCのピペットを10μl。ピペット顕微鏡ガラス上のRBCとフィブリンの30μL（GLのための準備をスライドを参照してくださいycated血栓）。
  7. フィブリンは、共焦点イメージングの前に2時間21〜23℃で重合することができるようにします。
  8. 共焦点顕微鏡を使用して血餅の共焦点画像を撮影し、蛍光標識したフィブリンおよび赤血球を励起して488nmと633nmの波長の励起レーザを利用する。

糖化クロット構造における線維素溶解料金の4共焦点顕微鏡評価

  1. 糖化血栓における線維素溶解率評価のための糖化血栓（プロトコルステップ2）の共焦点顕微鏡プロトコルを繰り返します。
  2. 明確な接着剤を用いて、チャンバの両端をシールしないでください。フィブリン塊は、脱水を防ぐために、250mlの水を含む密閉筐体に21〜23℃で1.5時間重合することができるようにします。
  3. 重合後、共焦点顕微鏡を用いて血栓の画像を得る。
  4. チャンバーの開放端にピペットプラスミンおよび毛管作用を介して、血餅を介してプラスミンを分散させる。
    1. のために通常の濃度は、ピペット室の​​開口部にプラスミン200μgの/ mlの25μlを、正常と糖化線維素溶解実験。
    2. 減少した濃度、ピペット室の​​開口部には50μg/ mlで25μlの糖化血栓のために。
  5. 時系列機能を使用する血餅を溶解するプラスミンのリアルタイムのビデオ映像をキャプチャするために、共焦点顕微鏡ソフトウェア（ 図1参照）。
    1. 取得モードをクリックし、選択して "時系列"をサイクル数と記録時間間隔を選択します。

5.フィブリン溶解料金の計算

  1. 面積（2500ミクロン2）を設定し、血餅の固定領域を溶解するのに必要な経過時間を計算することにより、溶解速度を決定する。以下の式（ 図2）を使用して、溶解率を計算する。
    figure-protocol-4206

フィブリン溶解料金の6.統計解析

  1. 統計分析ソフトウェアを使用して溶解データを分析する。一方向ANOVAおよび事後テューキー·クレーマー検定44,45を実行します。

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結果

糖化フィブリンクロット構造の共焦点顕微鏡分析

正常および糖化血栓の共焦点顕微鏡画像を図3に示されている。通常の糖化血栓の共焦点顕微鏡分析は、糖化血餅とし、血餅重合中の活性化XIII因子を添加せずに両方の正常な凝血塊よりも小さい孔を有するより緻密であることが明らかである。 図3Aおよび3Bに、より高いフィブリン濃?...

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ディスカッション

疾患状態における凝固機構の構造についての意味のあるデータを得るためには、これらの条件下でのタンパク質および細胞の効果を決定するために、凝固に関与する因子を単離することが重要である。このプロトコルは、in vitroで 、糖尿病およびSCDの状態でフィブリン塊の構造を調査する目的で開発された。

改変された条件は、凝固亢進、アテローム血栓症、お?...

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開示事項

The authors have nothing to disclose.

謝辞

The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)GE Healthcare45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubesBD Biosciences366643
Human FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesN/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugateMolecular ProbesF13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tubeFisher Scientific05-408-120
Glucose powderLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
VIS Confocal MicroscopeZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solutionLife TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Statistical Modeling SoftwareIBMSPSS Statistics 22

参考文献

  1. Averett, R. D., et al. A Modular Fibrinogen Model that Captures the Stress-Strain Behavior of Fibers. Biophysical Journal. 103, 1537-1544 (2012).
  2. Carlisle, C. R., et al. The mechanical properties of individual, electrospun fibrinogen fibers. Biomaterials. 30, 1205-1213 (2009).
  3. Falvo, M. R., Gorkun, O. V., Lord, S. T. The molecular origins of the mechanical properties of fibrin. Biophysical Chemistry. 152, 15-20 (2010).
  4. Guthold, M., Cho, S. S. Fibrinogen Unfolding Mechanisms Are Not Too Much of a Stretch. Structure. 19, 1536-1538 (2011).
  5. Gerth, C., Roberts, W. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots II: Linear viscoelastic behavior in shear creep. Biophysical Chemistry. 2 (74), 208-217 (1974).
  6. Nelb, G. W., Kamykowski, G. W., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. v. shear modulus, creep, and creep recovery of fine unligated clots. Biophysical Chemistry. 13 (81), 15-23 (1981).
  7. Roberts, W. W., Kramer, O., Rosser, R. W., Nestler, F. H. M., Ferry, J. D. Rheology of fibrin clots. I.: Dynamic viscoelastic properties and fluid permeation. Biophysical Chemistry. 1, 152-160 (1974).
  8. Ryan, E. A., Mockros, L. F., Weisel, J. W., Lorand, L. Structural Origins of Fibrin Clot Rheology. Biophysical Journal. 77, 2813-2826 (1999).
  9. Weisel, J. W. Fibrin assembly. Lateral aggregation and the role of the two pairs of fibrinopeptides. Biophysical Journal. 50, 1079-1093 (1986).
  10. Weisel, J. W. The mechanical properties of fibrin for basic scientists and clinicians. Biophysical Chemistry. 112, 267-276 (2004).
  11. Wolberg, A. S. Thrombin generation and fibrin clot structure. Blood Reviews. 21, 131-142 (2007).
  12. Wolberg, A. S., Campbell, R. A. Thrombin generation, fibrin clot formation and hemostasis. Transfusion and Apheresis Science. 38, 15-23 (2008).
  13. Yeromonahos, C., Polack, B., Caton, F. Nanostructure of the Fibrin Clot. Biophysical Journal. 99, 2018-2027 (2010).
  14. Dunn, E. J. Fibrinogen and fibrin clot structure in diabetes. Herz. 29, 470-479 (2004).
  15. Gladwin, M. T., Sachdev, V. Cardiovascular abnormalities in sickle cell disease. Journal of the American College of Cardiology. 59, 1123-1133 (2012).
  16. Collet, J. P., et al. Altered Fibrin Architecture Is Associated With Hypofibrinolysis and Premature Coronary Atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  17. Carr, M. E. Diabetes mellitus: a hypercoagulable state. Journal of Diabetes and its Complications. 15, 44-54 (2001).
  18. Ajjan, R. A., Ariëns, R. A. S. Cardiovascular disease and heritability of the prothrombotic state. Blood Reviews. 23, 67-78 (2009).
  19. Standeven, K. F., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The molecular physiology and pathology of fibrin structure/function. Blood Reviews. 19, 275-288 (2005).
  20. American Diabetes Association. , Available from: http://www.diabetes.org/ (2014).
  21. Alzahrani, S., Ajjan, R. Review article: Coagulation and fibrinolysis in diabetes. Diabetes and Vascular Disease Research. 7, 260-273 (2010).
  22. Sickle Cell Disease Association of America, Inc. , Available from: http://www.sicklecelldisease.org/ (2014).
  23. Stuart, M. J., Nagel, R. L. Sickle-cell disease. The Lancet. 364, 1343-1360 (2004).
  24. Dunn, E. J., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. The influence of type 2 diabetes on fibrin structure and function. Diabetologia. 48, 1198-1206 (2005).
  25. Dunn, E. J., Philippou, H., Ariëns, R. A. S., Grant, P. J. Molecular mechanisms involved in the resistance of fibrin to clot lysis by plasmin in subjects with type 2 diabetes mellitus. Diabetologia. 49, 1071-1080 (2006).
  26. Famodu, A., Reid, H. Plasma fibrinogen levels in sickle cell disease. Tropical and geographical medicine. 39, 36-38 (1987).
  27. Richardson, S., Matthews, K., Stuart, J., Geddes, A., Wilcox, R. Serial Changes in Coagulation and Viscosity during Sickle-Cell Crisis. British journal of haematology. 41, 95-103 (1979).
  28. Ataga, K. I., Orringer, E. P. Hypercoagulability in sickle cell disease: a curious paradox. The American Journal of Medicine. 115, 721-728 (2003).
  29. Collet, J. P., et al. Altered fibrin architecture is associated with hypofibrinolysis and premature coronary atherothrombosis. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 26, 2567-2573 (2006).
  30. Barazzoni, R., et al. Increased Fibrinogen Production in Type 2 Diabetic Patients without Detectable Vascular Complications: Correlation with Plasma Glucagon Concentrations. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 85, 3121-3125 (2000).
  31. Ceriello, A. Coagulation activation in diabetes mellitus: the role of hyperglycaemia and therapeutic prospects. Diabetologia. 36, 1119-1125 (1993).
  32. Mayne, E. E., Bridges, J. M., Weaver, J. A. Platelet adhesiveness, plasma fibrinogen and factor VIII levels in diabetes mellitus. Diabetologia. 6, 436-440 (1970).
  33. Weisel, J. W. Fibrinogen and fibrin. Advances in protein chemistry. 70, 247-299 (2005).
  34. Collet, J., et al. Influence of Fibrin Network Conformation and Fibrin Fiber Diameter on Fibrinolysis Speed Dynamic and Structural Approaches by Confocal Microscopy. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 20, 1354-1361 (2000).
  35. Jörneskog, G., et al. Altered properties of the fibrin gel structure in patients with IDDM. Diabetologia. 39, 1519-1523 (1996).
  36. Svensson, J., et al. Acetylation and glycation of fibrinogen in vitro occur at specific lysine residues in a concentration dependent manner: A mass spectrometric and isotope labeling study. Biochemical and Biophysical Research Communications. 421, 335-342 (2012).
  37. Pieters, M., et al. Glycation of fibrinogen in uncontrolled diabetic patients and the effects of glycaemic control on fibrinogen glycation. Thrombosis Research. 120, 439-446 (2007).
  38. Baradet, T. C., Haselgrove, J. C., Weisel, J. W. Three-dimensional reconstruction of fibrin clot networks from stereoscopic intermediate voltage electron microscope images and analysis of branching. Biophysical journal. 68, 1551-1560 (1995).
  39. Campbell, R. A., Overmyer, K. A., Selzman, C. H., Sheridan, B. C., Wolberg, A. S. Contributions of extravascular and intravascular cells to fibrin network formation, structure, and stability. Blood. 114, 4886-4896 (2009).
  40. Curtis, D. J., et al. A study of microstructural templating in fibrin-thrombin gel networks by spectral and viscoelastic analysis. Soft Matter. 9, 4883-4889 (2013).
  41. Kim, E., et al. Correlation between fibrin network structure and mechanical properties: an experimental and computational analysis. Soft Matter. 7, 4983-4992 (2011).
  42. Keegan, P. M., Surapaneni, S., Platt, M. O. Sickle cell disease activates peripheral blood mononuclear cells to induce cathepsins k and v activity in endothelial cells. Anemia. 2012, 201781(2012).
  43. Allison, A. Properties of sickle-cell haemoglobin. Biochemical Journal. 65, 212(1957).
  44. Kuehl, R. O. Design of experiments : statistical principles of research design and analysis. , 2nd ed, Cengage Learning. Pacific Grove, CA. (2000).
  45. Lindman, H. R. Analysis of variance in experimental designs. , Springer-Verlag Publishing. New York, N.Y., USA. (1992).
  46. Pan, W., Galkin, O., Filobelo, L., Nagel, R. L., Vekilov, P. G. Metastable Mesoscopic Clusters in Solutions of Sickle-Cell Hemoglobin. Biophysical Journal. 92, 267-277 (2007).
  47. Wootton, D. M., Popel, A. S., Alevriadou, B. R. An experimental and theoretical study on the dissolution of mural fibrin clots by tissue-type plasminogen activator. Biotechnology and bioengineering. 77, 405-419 (2002).
  48. Sazonova, I. Y., et al. 127 Mathematic model of fibrin clot lysis by plasmin. Fibrinolysis and Proteolysis. 12, Suppl 1. 45(1998).

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