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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Zusammenfassung

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Einleitung

Schädigung eines Blutgefäßes Endothelauskleidung durch die hämostatische Reaktion oder die Bildung eines Blutgerinnsels repariert. Wenn Blut dringt in die extrazelluläre Matrix, Gewebefaktoren aktiviert Blutplättchen in den Blutstrom, die Einleitung der Gerinnungskaskade zu erleichtern. Der Schlüssel mechanische Komponente dieser Heilungsprozess ist die Fibrinmatrix, von Fibrin Fasern, die hochelastisch sind zusammengesetzt und kann große Kräfte 1-4 zu erhalten. Viele Forscher haben die Bildung Struktur und Funktion von Fibrin ausführlich in den vergangenen Jahrzehnten 5-13 untersucht.

Patienten mit Krankheiten, wie Diabetes mellitus und Sichelzellen ein erhöhtes Risiko der Entwicklung von thrombotischen Komplikationen wie Herzinfarkte, ischämische Herzerkrankungen und Schlaganfälle 14-19. Über 2 Millionen Menschen neu mit Diabetes mellitus diagnostiziert jedes Jahr in den Vereinigten Staaten. Es gibt zwei Arten von Diabetes: Typ I, wo dieKörper nicht ausreichende Mengen an Insulin und Typ II, wo der Körper wird resistent gegen Insulin zu produzieren. Unter Diabetikern, kardiovaskulärer Erkrankung (CVD) ist die Ursache für die 80% der Morbidität und Mortalität, die mit der Krankheit assoziiert 20,21.

Sichelzellanämie (SCD) ist eine genetisch bedingte Blutgerinnungsstörung, die mehr als 100.000 Menschen in den Vereinigten Staaten 22 wirkt. SCD ist eine Punkt-Mutation Krankheit, die roten Blutkörperchen bewirkt, halbmondförmige geworden, dass es schwierig für die Zellen durch die Blutgefäßsystem 23 übergeben. Beide Krankheitszuständen erhöht die Chancen der Entwicklung atherothrombotischer Bedingungen im Körper. Einer der Gründe dafür ist, auf einer veränderten Fibrin Struktur und Funktion in erkrankten Zuständen 14,24-26.

In beiden Diabetes und Sichelzellanämie, gibt es Hyperkoagulation und Hypofibrinolyse Aktivität, die Atherothrombose und kardiovaskulären Erkrankungen induziert (CVD) im Vergleich zu gesunden Patienten 17,27,28. Es ist bekannt, dass Hypofibrinolyse fördert Atherosklerose Progression und erzeugt rezidivierende ischämische Ereignisse bei Patienten mit vorzeitigem Koronararterienerkrankung 29. In der aktuellen Manuskript untersuchten wir die Rolle von Fibrin physikalischen Eigenschaften in diesem besonderen Ambiente. Fibringerinnsel Strukturen in nicht erkrankten Patienten werden von dünnen Fasern, größere Poren, und in der Regel weniger dicht 14,24 zusammen. Die erhöhte Porosität und weniger dicht Fibringerinnseln in gesunden Patienten wurde gefunden, dass die Fibrinolyse 16 erleichtern. In hyperthrombotischen Bedingungen wie diabetische und Sichelzellanämie, gibt es eine Erhöhung in der Produktion von Fibrinogen, wodurch der Fibrinogenkonzentration um vom Normalniveau von 2,5 mg / ml in gesunden Patienten 30-33 erhöhen. Fibringerinnseln in diabetischen Patienten gebildet haben sich als weniger porös, steifer, mehr Verzweigungspunkte, und dichter im Vergleich zu gesunden, nicht-diaBetic Patienten 14,24,33-35. Die veränderte Fibrinstruktur ist ein Ergebnis der Glykierung Mechanismen, die in den Proteinen der Gerinnselbildung beteiligt auftreten. Nichtenzymatische (irreversibel) Glykosylierung tritt auf, wenn Glukose-Moleküle binden an Lysinresten auf der Fibrinogen-Molekül, das die menschliche Faktor XIIIa (FXIIIa) ordnungsgemäß Vernetzungs Glutamin und Lysin-Reste 33,36,37 hemmt.

Die Strukturanalyse von Fibrin-Netzwerken wurde ausgiebig vor kurzem untersucht. Insbesondere haben Forscher Elektronenmikroskopie und 3D-Rekonstruktion von Fibrin-Netzwerken 38, untersucht, wie auch intravaskuläre (endotheliale Zellen) und extravaskuläre (Fibroblasten und glatte Muskelzellen) Zellen beeinflussen Fibrinstruktur 39, verwendet viskoelastischen und Spektralanalyse zu Fibrin Strukturen 40 analysiert und verwendet entwickelten Korrelationen zwischen Fibrin Struktur und mechanischen Eigenschaften mit experimentellen und theoretischen Ansätze 41 . Der Fokus der vorliegenden Studie war es Gerinnsel Strukturen unter simulierten diabetischen und Sichelzellen Thrombose Bedingungen formulieren und konfokale Mikroskopie zur Untersuchung der Struktur und Funktion der Blutgerinnsel in Krankheitszuständen verwendet werden. Fibringerinnsel wurden aus menschlichem Fibrinogen, humanes Thrombin und FXIIIa gebildet. Die Gerinnsel wurden mit Plasmin lysiert. Diabetischer Bedingungen zu simulieren, wurde erhöhte Konzentration an Fibrinogen in der Glukoselösung inkubiert, um eine in vitro Glykierung Fibrinogen induzieren. Um Sichelzellanämie Gerinnungsbedingungen zu simulieren, wurden erhöhte Fibrinogenkonzentrationen mit Sichelzellen Hämatokrit von Patienten gesammelt, wie zuvor von unserer Gruppe 42 getan gemischt. Diese Verfahren wurden verwendet, um die Struktur und die Funktionen in Fibringerinnselbildung und Fibrinolyse bei Krankheitszuständen beteiligt sind, sowie die Mechanismen, die CVD induzieren zu untersuchen. Basierend auf den aktuellen Informationen über diese Krankheiten waren die glykosylierten Fibringerinnsel Strukturen dichter mit weniger einnd kleineren Poren. Die Fibringerinnsel mit roten Blutzellen von Sichelzellpatienten (RBCs) wurden ebenfalls dichter und angezeigt Aggregation der Erythrozyten und agglomeriert Fibrin Clustern. Dies ist ein gut etabliertes Phänomen, das zuvor 43 festgestellt hat. Es wurde auch vermutet, dass die Fibrinolyse Quote wäre in glykosylierten Fibringerinnsel mit und ohne reduzierte Plasmin im Vergleich zu gesunden, normalen Fibrin deutlich geringer. Die Ergebnisse zeigten, dass für glykosyliertes Fibringerinnseln, signifikant Lyserate Ergebnisse wurden nur unter den Bedingungen einer reduzierten Plasminkonzentration beobachtet. Dieses experimentelle Technik der Verwendung der konfokalen Mikroskopie bietet signifikante Vorteile gegenüber anderen bildgebenden Verfahren, weil die Zellen und Proteine ​​in ihrem nativen Zustand, der die Erfassung von Echtzeitvideo der Gerinnungsaktivität ermöglicht bleibt. Diese Methode synthetisch induzierenden Blutgerinnung ist auch billiger und zeiteffizienter als Erhalt von Patientenproben und Ausfiltern einzelneProteine ​​und Enzyme. Ferner ergeben sich mit getrennten Proteine ​​und Enzyme, um Gerinnsel zu synthetisieren, die Gerinnsel wurden standardisiert, so dass es nicht die Variabilität zwischen den Proben als Folge von anderen Proteinen im Plasma.

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Protokoll

HINWEIS: Das folgende Protokoll befolgt die vom Institutional Review Board (IRB) an der Georgia Tech Richtlinien.

1. Blutentnahme und Rotes Blutkörperchen Isolierungsverfahren

  1. Sammeln Sie 40 bis 120 ml Blut von Spendern in 10 ml Heparin-Vacutainer-Röhrchen. Starten PBMC (periphere Blut mononukleären Zellen) Isolierung innerhalb von 4 Stunden der Sammlung. Während dieser Zeit halten Blut bei RT.
    HINWEIS: O / N Lagerung von Blut in RT oder bei 4 ° C wird nicht empfohlen, da dies zu niedrigeren PBMC Ausbeute führen.
  2. Verdünnen Sie Vollblut 1: 1 in eiskaltem (4 ° C) sterile PBS.
  3. Je 10 ml eiskaltem hydrophile Polysaccharid in eine leere, sterile 50 ml konischen Röhrchen. Verdünntem Vollblut übertragen Sie leicht über der hydrophilen Polysaccharid.
  4. Verwenden Sie eine 25 ml Pipette in Zeiteinstellung und Pipetten Blut an der Seite des Rohres sehr langsam. Sicherzustellen, dass das Blut nicht mit der Saccharid vor Centri vermischtfugation weil das hydrophile Polysaccharid Zellen toxisch, und ansonsten wird die PBMC Ausbeute niedriger sein.
  5. Zentrifuge Blutproben für 30 min bei 400 × g bei 4 ° C. Falls verfügbar, verringern die Bremsgeschwindigkeit der Zentrifuge auf die Hälfte der maximalen zur besseren Trennung nach der Zentrifugation.
  6. Absaugen des Plasmas / Thrombozytenfraktion der zentrifugierten Blutprobe. Sorgfältig absaugen die hydrophile Polysaccharid Schicht direkt über der RBC-Schicht verpackt.
  7. Sammeln Sie 8-10 ml gepacktes Erythrozyten und verdünnt 1: 1 mit unsterilen 0,9% NaCl Kochsalzlösung.

2. konfokale Mikroskopie Bewertung der Glykiertes Clot Strukturen (Simulated Diabetische Blutgerinnsel)

  1. Abzutauen Humanfibrinogen und fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat bei 37 ° C.
  2. Pipettieren Sie die folgenden zu einem 0,5 ml-Messmikrozentrifugenröhrchen.
    1. Für die gesunde, normale Fibrinogen gerinnt, mischen, Fibrinogen mit 10% fluoreszenzmarkierten FibrinogenKonjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl-Puffer bei einer Konzentration von 5 mg / ml.
    2. Künstlich glykiertes Fibrinogen (diabetische Gerinnsel zu simulieren), Inkubation Humanfibrinogen und 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einer 5 mM Lösung von Glucose in 50 mM Tris / 100 mM NaCl bei einer resultierenden Konzentration von 6,8 mg / ml.
  3. Umfassen die Mikrozentrifugenröhrchen mit einem undurchsichtigen Material, um Belichtung zu vermeiden. Die Röhrchen in ein 37 ° C Wasserbad für 48 Stunden inkubieren.
  4. Machen Sie eine Kammer auf einen Glasobjektträger durch Aufbringen eines dünnen Klebe auf 2 Seiten des Schlittens.
  5. Nach 48 Stunden Inkubationszeit vorzubereiten Reagenzien für die Fibrinbildung durch Auftauen FXIIIa und Menschen alpha Thrombin bei RT.
  6. Verdünne FXIIIa bis 80 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
  7. Verdünnte Thrombin bis 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
    1. Für normale gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 2,5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
    2. Für die glykierte gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 3,4 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
  8. Unmittelbar Je 30 ul der Fibrin-Lösung in die durch den Kleber gebildete Kammer.
  9. Legen Sie eine 22 mm x 22 mm Deckglas mit einer Dicke von 0,15 mm auf der Oberseite der zwei Klebstoffschichten. Verschließen Sie die offenen Seiten mit klaren Klebstoff, um das Fibringerinnsel austrocknet. Sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht mit dem Fibringerinnsel interagieren.
  10. Lassen Sie die Fibringerinnsel zu 21-23 ° C für 2 Stunden, bevor die konfokale Abbildung zu polymerisieren.
  11. Nehmen Sie die konfokale Mikroskopie Bilder der Gerinnsel mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x / 1,30 Oil M27 Objektiv mit einem 488 nm Argon-Laser.

3. konfokale Mikroskopie Bewertung von Fibringerinnseln haltigen Erythrozyten von Sichelzellanämie Patienten

  1. Abzutauen Humanfibrinogen und fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat bei 37 ° C.
  2. Pipettieren Sie die folgenden zu einem 0,5 ml-Messmikrozentrifugenröhrchen.
    1. Für den gesunden, normal Fibringerinnsels mischen menschlichem Fibrinogen mit 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl-Puffer bei einer Konzentration von 5 mg / ml.
    2. Für die Gerinnsel enthaltenden SCD RBCs mischen Humanfibrinogen und 10% fluoreszierend markierten Fibrinogen-Konjugat in einem 50 mM Tris / 100 mM NaCl, daß die resultierende Konzentration der Fibrinogen 10 mg / ml.
  3. Beschriften Sie die isolierten Erythrozyten (sowohl normale als auch jene von Sichelzellpatienten von der RBC-Isolierungsprotokoll erhalten wird) mit einem Zell-Markierungslösung.
    1. Suspend-Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 6 pro ml in jeder gewählten serumfreien Kulturmedium.
    2. Mit 5 ul / ml der Zellsuspension in Zellmarkierungslösung. Gut mischen durch vorsichtiges Pipettieren vorsichtig.
    3. Inkubieren für 20 min bei 37 ° C.
    4. Zentrifugieren der markierten Suspension Röhrchen bei 1.500 UpM für 5 min bei 37 ° C.
    5. Entfernen Sie den Überstand und sanft wieder die Zellen in 37 ° C Medium.
    6. Wiederholen Sie den Waschvorgang (3.3.4 und 3.3.5) zwei weitere Male.
  4. Verdünne FXIIIa bis 80 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
  5. Verdünnte Thrombin bis 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 Puffer.
    1. Für normale gerinnt, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin sind 2,5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
    2. Für die Gerinnsel enthaltenden SCD RBCs, sicherzustellen, dass die Endkonzentrationen an Fibrinogen, Faktor XIIIa und Thrombin werden 5 mg / ml, 20 U / ml, und 1 U / ml in einem Volumen von 50 ul.
  6. Je 10 ul der markierten roten Blutkörperchen in das Fibrin-Lösung. Pipette 30 ul des Fibrin mit Erythrozyten auf das Mikroskop Glas (siehe Vorbereitung gl schiebenycated Blutgerinnsel).
  7. Ermöglichen das Fibrin auf 21-23 ° C für 2 Stunden, bevor die konfokale Abbildung zu polymerisieren.
  8. Nehmen konfokale Bilder der Gerinnsel mit dem konfokalen Mikroskop, und nutzen Anregungslaser mit Wellenlängen von 488 nm und 633 nm, um die Fluoreszenz-markierten Fibrin und Erythrozyten anregen.

4. konfokale Mikroskopie Bewertung der Fibrinolyse Preise in Glykiertes Clot Strukturen

  1. Wiederholen der Konfokalmikroskopie Protokoll von glykiertem Blutgerinnsel (Protocol Schritt 2) für die Fibrinolyse Rate Auswertung in glykierten Gerinnsel.
  2. Verschließen Sie nicht die Enden der Kammer mit klaren Klebstoff. Lassen Sie die Fibringerinnsel für 1,5 h bei 21-23 ° C in einem geschlossenen Gehäuse, das 250 ml Wasser, um Austrocknung zu verhindern polymerisieren.
  3. Nach der Polymerisation erhalten Bilder der Gerinnsel mit dem konfokalen Mikroskop.
  4. Pipette Plasmin in das offene Ende der Kammer und verteilen das Plasmin durch das Gerinnsel durch Kapillarwirkung.
    1. Fürder normale und der glykierten Fibrinolyse Experimente mit normalen Konzentrationen, Pipetten 25 ul mit 200 ug / ml Plasmin in die Öffnung der Kammer.
    2. Für die glykierte Gerinnseln mit reduzierten Konzentrationen Pipette 25 ul bei 50 ug / ml in die Öffnung der Kammer.
  5. Verwenden Sie den Zeitreihen-Funktion (siehe Abbildung 1) in der konfokalen Mikroskop-Software, um Echtzeit-Videoaufnahmen von der Plasmin Lyse des Gerinnsels zu erfassen.
    1. Klicken Erfassungsmodus und wählen Sie "Time Series". Wählen Sie die Anzahl der Zyklen und die Aufnahmezeitintervall.

5. Berechnung Fibrinolyse Preise

  1. Bestimmen Sie die Lyse Rate, indem Sie einen Bereich (2500 & mgr; m 2) und der Berechnung der verstrichenen Zeit erforderlich ist, um einen festen Bereich der Gerinnsel aufzulösen. Errechnen Lyserate Verwendung der folgenden Gleichung (2):
    figure-protocol-8467

6. Statistische Analyse der Fibrinolyse Preise

  1. Analysieren Sie die Lyse-Daten mit Hilfe statistischer Analyse-Software. Führen Sie eine one-way ANOVA und post hoc Tukey-Kramer-Test 44,45.

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Ergebnisse

Konfokale Mikroskopie Analyse der Glykiertes Fibringerinnsel Strukturen

Konfokales Mikroskopiebilder von normalen und glykiertem Blutgerinnsel sind in Abbildung 3 dargestellt. Die konfokale Mikroskopie-Analyse der normalen und glykiertem Blutgerinnsel zeigt, dass glykiertes Blutgerinnsel sind dichter mit kleineren Poren als die normalen Gerinnsel sowohl mit als auch ohne Zusatz von FXIIIa während der Gerinnsel Polymerisation. In 3A und 3B ist

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Diskussion

Um aussagekräftige Daten über die Struktur des Gerinnungsmechanismen bei Krankheitszuständen zu erhalten, ist es wichtig, die Faktoren der Blutgerinnung beteiligt sind, um die Effekte der Proteine ​​und Zellen unter diesen Bedingungen zu bestimmen, zu isolieren. Dieses Protokoll wurde zum Zweck der Untersuchung der Struktur des Fibringerinnsels bei diabetischen und SCD Zustände in vitro entwickelt.

Es ist notwendig, um die Mechanismen in der Fibrinbildung und Fibrinolyse bei...

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Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)GE Healthcare45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubesBD Biosciences366643
Human FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesN/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugateMolecular ProbesF13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tubeFisher Scientific05-408-120
Glucose powderLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
VIS Confocal MicroscopeZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solutionLife TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Statistical Modeling SoftwareIBMSPSS Statistics 22

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