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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Abstract

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Introduzione

Lesioni a rivestimento endoteliale di un vaso sanguigno viene riparato attraverso la risposta emostatico, o la formazione di un coagulo di sangue. Quando il sangue permea nella matrice extracellulare, fattori tissutali attivano piastrine nel sangue che facilitano l'iniziazione della cascata coagulativa. Il componente chiave meccanica di questo processo di guarigione è la matrice di fibrina, composto da fibre di fibrina che sono altamente elastica, e può sostenere le grandi forze 1-4. Molti ricercatori hanno studiato la struttura di formazione, e la funzione di fibrina ampiamente negli ultimi decenni 5-13.

I pazienti con malattie come il diabete mellito e falciforme hanno un aumentato rischio di sviluppare complicanze trombotiche, come infarto miocardico, cardiopatia ischemica, e colpi 14-19. Oltre 2 milioni di persone sono di nuova diagnosi di diabete mellito ogni anno negli Stati Uniti. Esistono due tipi di diabete: tipo I, dove lacorpo non riesce a produrre quantità sufficienti di insulina, e tipo II, dove il corpo diventa resistente all'insulina. Tra i pazienti diabetici, malattie cardiovascolari (CVD) è la causa per l'80% della morbilità e la mortalità associate con la malattia 20,21.

Anemia falciforme (SCD) è una malattia genetica del sangue che colpisce più di 100.000 persone negli Stati Uniti 22. SCD è una malattia mutazioni puntiformi che induce le cellule rosse del sangue per diventare a forma di mezzaluna, il che rende difficile per le cellule di passare attraverso il sistema vascolare del sangue 23. Entrambi questi stati di malattia aumentano le probabilità di sviluppare condizioni aterotrombotici nel corpo. Uno dei motivi per questo è il risultato di strutture di fibrina alterata e funzione negli stati malati 14,24-26.

In entrambi diabete e anemia falciforme, c'è ipercoagulazione e l'attività hypofibrinolysis che induce aterotrombosi e malattie cardiovascolari (CVD) rispetto ai pazienti sani 17,27,28. E 'noto che hypofibrinolysis promuove la progressione dell'aterosclerosi e genera eventi ischemici ricorrenti per i pazienti con malattia coronarica precoce 29. Nel manoscritto attuale, abbiamo studiato il ruolo di fibrina proprietà fisiche in questo ambiente particolare. Strutture coagulo di fibrina nei pazienti non malati sono composti da fibre sottili, pori più grandi, e in genere meno densa 14,24. La maggiore porosità e coaguli di fibrina meno fitta in pazienti sani sono stati trovati per facilitare fibrinolisi 16. In condizioni hyperthrombotic quali malattia a cellule falciformi diabetica e, vi è un aumento della produzione di fibrinogeno, causando la concentrazione di fibrinogeno aumentare da livelli normali di 2,5 mg / ml in pazienti sani 30-33. Coaguli di fibrina formata in pazienti diabetici sono stati trovati per essere meno porosa, più rigida, avere più punti di ramificazione, e più densa rispetto a sano, non diapazienti Betica 14,24,33-35. La struttura di fibrina alterata è il risultato di meccanismi di glicazione che si verificano nelle proteine ​​coinvolte nella formazione del coagulo. Non enzimatica (irreversibile) glicazione si verifica quando le molecole di glucosio si legano a residui di lisina sulla molecola fibrinogeno, che inibisce il fattore XIIIa umana (FXIIIa) da glutamina e lisina residui opportunamente incrociati collegano 33,36,37.

L'analisi strutturale delle reti di fibrina è stato ampiamente studiato di recente. In particolare, i ricercatori hanno utilizzato la microscopia elettronica e la ricostruzione 3D delle reti di fibrina, 38 indagati come sia intravascolari (endoteliali) cellule e extravascolari (fibroblasti e muscolari lisce) cellule influenzano la struttura di fibrina 39, viscoelastico utilizzati e l'analisi spettrale per analizzare le strutture di fibrina 40, e correlazioni sviluppati tra struttura di fibrina e le proprietà meccaniche utilizzando approcci sperimentali e computazionali 41 . Il focus di questo studio è stato quello di formulare strutture coagulo in condizioni trombosi cellulare diabetico e falce simulati e di utilizzare la microscopia confocale per l'esame della struttura e funzione dei coaguli in stati malati. Coaguli di fibrina sono formati da fibrinogeno umano, trombina umana, e FXIIIa. I coaguli sono stati lisati con plasmina. Per simulare le condizioni di diabetici, aumento della concentrazione di fibrinogeno è stato incubato in soluzione di glucosio di indurre in vitro fibrinogeno glicazione. Per simulare malattie cella condizioni coagulazione falce, un aumento delle concentrazioni di fibrinogeno sono stati mescolati con ematocrito falciforme raccolti da pazienti, come fatto in precedenza dal nostro gruppo 42. Questi metodi sono stati usati per esaminare la struttura e le funzioni coinvolte nella formazione di coaguli di fibrina fibrinolisi e in condizioni malate, nonché i meccanismi che inducono CVD. Sulla base delle informazioni attuali su queste malattie, le strutture di coagulo di fibrina glicata erano più denso con meno di unnd piccoli pori. I coaguli di fibrina con globuli rossi di pazienti con anemia falciforme (RBC) erano anche più denso e visualizzati aggregazione dei globuli rossi e di cluster di fibrina agglomerati. Questo è un fenomeno ben noto che è stato determinato in precedenza 43. E 'stato anche ipotizzato che il tasso di fibrinolisi sarebbe significativamente più bassa nel coaguli di fibrina glicata con e senza riduzione plasmina rispetto ai sani, di fibrina normale. I risultati hanno mostrato che per coaguli di fibrina glicate, risultati molto diversi tassi lisi stati osservati solo in condizioni di concentrazione di plasmina ridotta. Questa tecnica sperimentale mediante microscopia confocale offre vantaggi significativi rispetto ad altri metodi di imaging perché le cellule e proteine ​​rimangono nel loro stato nativo, che permette la cattura di video in tempo reale dell'attività coagulazione. Questo metodo di coagulazione sinteticamente Induzione è anche più economico e più tempo efficiente di ottenere campioni di pazienti e filtrando individualeproteine ​​ed enzimi. Inoltre, utilizzando proteine ​​ed enzimi separati per sintetizzare coaguli, i coaguli sono stati standardizzati in modo che non ci fosse la variabilità tra i campioni a causa di altre proteine ​​del plasma.

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Protocollo

NOTA: Il seguente protocollo aderisce alle linee guida stabilite dal Institutional Review Board (IRB) presso la Georgia Tech.

1. Raccolta di sangue e Blood Red isolamento delle cellule Procedura

  1. Raccogliere 40-120 ml di sangue da donatori in 10 ml vacutainer eparina. Inizia PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) isolamento entro 4 ore di raccolta. Durante questo tempo, mantenere il sangue a RT.
    NOTA: O / N stoccaggio di sangue in RT o 4 ° C non è raccomandato in quanto questo si tradurrà in minori rendimenti PBMC.
  2. Diluire sangue intero 1: 1 in ghiaccio freddo (4 ° C) PBS sterile.
  3. Pipettare 10 ml di ghiacciata polisaccaride idrofila in un sterile 50 ml tubetto vuoto, conico. Trasferire delicatamente sangue intero diluito in cima al polisaccaride idrofila.
  4. Utilizzare una pipetta 25 ml in presa lenta e sangue pipetta lungo il lato del tubo molto lentamente. Assicurarsi che il sangue non viene miscelato con il saccaride prima Centrifugation perché il polisaccaride idrofila è tossico per le cellule e non, la resa PBMC sarà inferiore.
  5. Centrifugare i campioni di sangue per 30 min a 400 xg a 4 ° C. Se disponibile, ridurre la velocità del freno della centrifuga alla metà del massimo per una migliore separazione dopo centrifugazione.
  6. Aspirare off la frazione di plasma / piastrine del campione di sangue centrifugato. Aspirare accuratamente lo strato polisaccaride idrofila direttamente sopra il livello RBC imballato.
  7. Raccogliere 8-10 ml di eritrociti concentrati e diluire 1: 1 con il non sterile 0,9% NaCl soluzione salina.

2. Microscopia confocale Valutazione di glicata Strutture Clot (simulati Diabetici Clots)

  1. Scongelare fibrinogeno umano e fluorescente coniugato fibrinogeno umano a 37 ° C.
  2. Pipettare il seguente in un 0,5 ml graduato provetta.
    1. Per i sani, normali coaguli fibrinogeno, mescolare fibrinogeno umano con il 10% fluorescente fibrinogeno umanoconiugato in tampone 50 mM Tris / 100 mM NaCl ad una concentrazione di 5 mg / ml.
    2. Per fibrinogeno artificialmente glicata (per simulare coaguli diabetici), incubare fibrinogeno umano e il 10% fluorescente fibrinogeno coniugato in una soluzione 5 mM di glucosio sciolto in 50 mM Tris / NaCl 100 mM per una concentrazione risultante di 6,8 mg / ml.
  3. Coprire le provette micro-centrifuga con un materiale opaco per evitare l'esposizione alla luce. Incubare le provette in un bagno d'acqua a 37 ° per 48 ore.
  4. Fare una camera su un vetrino da microscopio in vetro apponendo un adesivo sottile su 2 lati della diapositiva.
  5. Dopo il periodo di incubazione 48 ore, preparare i reagenti per la formazione di fibrina da sbrinamento FXIIIa e trombina alfa umano RT.
  6. Diluire FXIIIa a 80 U / ml in 5 CaCl mM tampone 2.
  7. Diluire trombina a 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 tampone.
    1. Per coaguli normali, assicurarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 2,5 mg / ml, 20 U / ml e 1 U / ml, rispettivamente, in un volume di 50 microlitri.
    2. Per i coaguli glicata, accertarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 3,4 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, rispettivamente, ad un volume di 50 ml.
  8. Subito pipettare 30 microlitri della soluzione di fibrina nella camera formata dal collante.
  9. Inserire un x 22 mm vetrino di vetro 22 mm con spessore di 0,15 mm su cima alle 2 strati di adesivo. Sigillare i lati aperti con adesivo trasparente per evitare che il coagulo di fibrina si secchi. Assicurarsi che l'adesivo non interagisce con il coagulo di fibrina.
  10. Lasciare i coaguli di fibrina polimerizzare a 21-23 ° C per 2 ore prima di imaging confocale.
  11. Prendere immagini di microscopia confocale dei coaguli utilizzando un microscopio confocale con un obiettivo 40X / 1.30 Olio M27 con 488 nm Argon laser.

3. Microscopia confocale Valutazione della fibrina Clots contenenti globuli rossi di pazienti Sickle Cellulari

  1. Scongelare fibrinogeno umano e fluorescente coniugato fibrinogeno umano a 37 ° C.
  2. Pipettare il seguente in un 0,5 ml graduato provetta.
    1. Per il sano, normale coagulo di fibrina, fibrinogeno umano miscelare con il 10% fluorescente coniugato fibrinogeno umano in tampone 50 mM Tris / 100 mM NaCl ad una concentrazione di 5 mg / ml.
    2. Per i coaguli contenenti SCD eritrociti, mescolare fibrinogeno umano e il 10% fluorescente coniugato fibrinogeno umano in 50 mM Tris / NaCl 100 mM tale che la concentrazione risultante del fibrinogeno è di 10 mg / ml.
  3. Etichettare i globuli rossi isolati (sia normali e quelli di pazienti con anemia falciforme ottenuti dal protocollo di isolamento RBC) utilizzando una soluzione di cellule di etichettatura.
    1. Sospendere le cellule ad una densità di 1 x 10 6 per ml in qualsiasi mezzo di coltura privo di siero prescelto.
    2. Aggiungere 5 microlitri / ml di sospensione cellulare alla soluzione cellulare etichettatura. Mescolare bene delicatamente pipettando delicatamente.
    3. incubare per 20 minuti a 37 ° C.
    4. Centrifugare le provette etichettate sospensione a 1500 rpm per 5 min a 37 ° C.
    5. Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere le cellule in 37 ° C di media.
    6. Ripetere la procedura di lavaggio (3.3.4 e 3.3.5) altre due volte.
  4. Diluire FXIIIa a 80 U / ml in 5 CaCl mM tampone 2.
  5. Diluire trombina a 4 U / ml in 5 mM CaCl 2 tampone.
    1. Per coaguli normali, assicurarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 2,5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, rispettivamente, ad un volume di 50 ml.
    2. Per i coaguli contenenti SCD globuli rossi, accertarsi che le concentrazioni finali di fibrinogeno, FXIIIa, e trombina sono 5 mg / ml, 20 U / ml, e 1 U / ml, rispettivamente, ad un volume di 50 ml.
  6. Pipettare 10 ml di globuli rossi etichettati nella soluzione di fibrina. Pipettare 30 ml di fibrina con globuli rossi sul vetro del microscopio (vedere scorrere la preparazione per glcoaguli ycated).
  7. Lasciare fibrina polimerizzare a 21-23 ° C per 2 ore prima di imaging confocale.
  8. Prendere immagini confocale dei coaguli utilizzando il microscopio confocale, e utilizzare laser con lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm e 633 nm per eccitare fibrina fluorescente e globuli rossi.

4. Microscopia confocale Valutazione della fibrinolisi tariffe in glicata Strutture Clot

  1. Ripetere il protocollo di microscopia confocale di coaguli glicata (Protocollo Fase 2) per la valutazione del tasso di fibrinolisi in grumi glicata.
  2. Non sigillare le estremità della camera con adesivo trasparente. Lasciare i coaguli di fibrina a polimerizzare per 1,5 ore a 21-23 ° C in un contenitore sigillato contenente 250 ml di acqua per evitare la disidratazione.
  3. Dopo la polimerizzazione, ottenere immagini dei coaguli utilizzando il microscopio confocale.
  4. Pipettare plasmina nell'estremità aperta della camera e disperdere la plasmina attraverso il coagulo tramite azione capillare.
    1. Pernormali e glicata esperimenti fibrinolisi con concentrazioni normali, pipette 25 ml a 200 mg / ml di plasmin nella apertura della camera.
    2. Per i coaguli glicata con concentrazioni ridotte, pipetta 25 microlitri a 50 ug / ml nella apertura della camera.
  5. Utilizzare la funzione serie temporale (vedi Figura 1) nel software microscopio confocale a catturare sequenze video in tempo reale della plasmina lisi del coagulo.
    1. Fare clic su modalità di acquisizione e quindi selezionare "Serie Time." Seleziona il numero di cicli e l'intervallo di tempo di registrazione.

5. Calcolo fibrinolisi Tariffe

  1. Determinare il tasso lisi impostando un'area (2,500 micron 2) e calcolando il tempo trascorso necessario per sciogliere la superficie fissa del coagulo. Calcolare il tasso di lisi utilizzando la seguente equazione (figura 2):
    figure-protocol-8459

6. Analisi statistica della fibrinolisi Tariffe

  1. Analizzare i dati di lisi utilizzando software di analisi statistica. Eseguire un ANOVA a senso unico e un post hoc test di Tukey-Kramer 44,45.

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Risultati

Microscopia confocale Analisi di glicata fibrina Strutture Clot

Le immagini microscopia confocale di coaguli normali e glicate sono presentati in Figura 3. Microscopia confocale dei coaguli normali e glicate rivela che coaguli glicate sono più densi con pori inferiori ai coaguli normali con e senza l'aggiunta di FXIIIa durante la polimerizzazione coagulo. Nella Figura 3A e 3B, vi è una concentrazione di fibrina inferiore che crea una s...

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Discussione

Per ottenere dati significativi sulla struttura dei meccanismi di coagulazione in stati di malattia, è importante isolare i fattori coinvolti nella coagulazione per determinare gli effetti delle proteine ​​e cellule in queste condizioni. Questo protocollo è stato sviluppato per i fini della valutazione della struttura del coagulo di fibrina in stati diabetici e SCD in vitro.

E 'necessario comprendere i meccanismi coinvolti nella formazione di fibrina e fibrinolisi in stati...

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Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Riconoscimenti

The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
PBSLife Technologies10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)GE Healthcare45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubesBD Biosciences366643
Human FibrinogenEnzyme Research LaboratoriesN/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugateMolecular ProbesF13191
0.5 ml graduated microcentrifuge tubeFisher Scientific05-408-120
Glucose powderLife Technologies15023-02
FXIIIaEnzyme Research LaboratoriesN/A
VIS Confocal MicroscopeZeiss LSM 510LSM 510
50 mM TrisLonzaS50-642
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma Aldrich449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solutionLife TechnologiesL7781
PlasminEnzyme Research LaboratoriesN/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)Life TechnologiesAM9759
Statistical Modeling SoftwareIBMSPSS Statistics 22

Riferimenti

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