地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

要約

私たちは、ニューロンのCA1-CA3配列を保持するインビトロ折り畳まれていない海馬を開発した。貫​​通微小電極アレイと組み合わせて、神経活動は、長手方向および横方向の向きでモニターすることができる。全体の海馬での伝搬を同時に記録することができますように、この方法は、海馬スライス標本上の利点を提供する。

要約

このプロトコルは、海馬における神経活動をマッピングするための微細加工のアレイと組み合わせる新しいインビトロフラット海馬の準備を調製するための方法を説明します。横断海馬スライス標本は、海馬の電気生理学を研究するための最も一般的な組織調製である。縦海馬スライスはまた、海馬における縦の接続を調べるために開発されました。その厚さは、十分な酸素の拡散を可能にするので、無傷のマウスの海馬はまた、インビトロで維持することができる。組織の一部が欠落している9893のどちらかであるので、これらの3つの調製は、神経伝播への直接アクセスを提供しません。折り畳まれていない無傷の海馬横断し、インビトロで海馬における信号伝搬の全範囲を分析する組織に直接アクセスするための平坦な構成の縦接続の両方を提供する。効果的にtから神経活動を監視するために彼細胞層、カスタムを作製した微小電極アレイ（PMEA）を貫通製折り畳ま海馬に適用する。高さが200μmの64の電極を有するPMEAは、深いマウス海馬の中に神経活動を記録することができます。折り畳ま海馬調製およびPMEAのユニークな組み合わせは、高い信号対雑音比と海馬の二次元CA1-CA3領域における神経活動の伝播速度と方向を研究するための新規のin vitroツールを提供する。

概要

神経信号の神経伝導または伝播を理解することは、脳^1-3の正常な機能および病理学的状態の両方における神経コミュニケーションのメカニズムを決定するために重要である。海馬は、メモリ、および空間追跡などのいくつかの脳機能において基本的な役割を果たしており、劇的に挙動ならびに^1,6に影響^を与えるいくつかの病理学的変化に関与しているため、脳の中で最も広く研究構造の一つである。海馬は複雑な組織を示すが、その構造の異なる要素は、容易に識別され、スライス標本^4-6にアクセスすることができる。海馬の横方向に、神経活動は、歯状回（DG）、CA3、CA1 andsubiculum ^4,5を備え^てトライシナプス経路を介して伝播することが知られている。これは、シナプス伝達および軸索伝導communicatiために主要な役割を果たすと考えられているこの横方向の回路^4,6のオン。しかし、神経信号の伝播が横方向と縦方向^4,6の両方で行われます。これは海馬が完全に伝播⁴の特定の方向に観測を制限スライス標本を使って調べることができないことを意味します。長手方向のスライスは、長手方向軸⁵に沿って軸索経路を調査するために開発された。研究者は、主に横方向と縦軸にそれぞれ⁶に沿って行動固有のガンマ及びシータ振動を観測した。これらの動作は別々に研究されてきた、まだ両方向への同時アクセスは、これらの動作を理解することが重要です。でも無傷の海馬製剤の開発は、海馬⁴の折り畳まれた構造に起因する組織全体を通して伝播を監視することは困難である。折り畳まれていない海馬はパックニューロンへのアクセスを提供します平らな二次元の細胞層^7,8の形態である。

歯状回（DG）（ 図1）を展開することによって、海馬は、横方向及び縦方向の両方の接続がCA3およびCA1の両方を含む二次元のシートに配置された錐体細胞層に無傷のままでいる長方形の形状と平坦な形状を採用している神経伝播を研究するために使用することができる神経組織のフラット部分を残して（ 図^2）8。神経活動は、個々のガラスピペット、マイクロ電極アレイ、刺激電極、ならびに電圧感受性色素^{（VSD）、3,7,8}でモニターすることができる。また、トランスジェニックマウスの遺伝的にコードされた電圧インジケータは、伝播パターン^9を追跡するために使用することができる。

折り畳まれていない海馬ネットワークの平坦な構成は、光学的な方法の記録のためにだけでなく、微小電極アレイに適しています。 M市販の配列のOSTは、平らなまたはロープロファイル電極が製造され、両方の組織スライスと培養神経細胞^10-12に神経活動を記録することができます。しかしながら、信号対雑音比（SNR）は、ニューロンの細胞体は、組織内に深く配置されているので、信号が無傷の組織から得られた場合に減少する。高アスペクト比を有する微小電極アレイは、SNRを改善するために必要とされる。

この効果により、貫通微小電極アレイ（PMEA）が我々の研究室で開発され、折り畳まれていない海馬^7,13に直径20μmと200μmの高さのスパイク64を挿入することにより、組織に直接プローブする能力を提供する。この微小電極アレイは、電位感受性色素イメージングに比べてより高いSNRを有しており、SNRが、実験^7,13の間に安定している。折り畳まれていない海馬準備とPMEAの組み合わせが投資する新しい方法を提供します2次元平面上での神経伝達をIGATE。この技術を用いた実験では、すでに神経活動は、独立して、シナプスや電気シナプス⁷の伝播することが可能となる海馬における神経信号伝搬のメカニズムについての重要な結果が得られている。

プロトコル

注：動物実験プロトコルを見直し、大学で施設内動物管理使用委員会によって承認された。 P20へP10歳の時にいずれかの性別のCD1マウスをこの研究で使用されている。

手術と実験録音1.ソリューション

1. のNaCl 124、KClの3.75、KH ₂ PO 4 1.25、MgSO ₄を2、NaHCO ₃で26、ブドウ糖10、およびCaCl ₂ 2：（mm）を含む通常の人工脳脊髄液（aCSFの）バッファを準備します。実験の開始時に切開した後、同様に洗浄システムのための組織の回復のために、この正常なaCSFのに使用します。
2. スクロース220、塩化カリウム2.95、のNaH ₂ PO 4 1.3、MgSO ₄を2、 _炭酸水素ナトリウム26、ブドウ糖10、およびCaCl ₂ 2：海馬の解剖中に使用して含んでいるショ糖のaCSF（mm）を準備します。無傷の海馬組織標本におけるてんかん様活動を誘導するために、正常なaCSFの少なくとも4アミノピリジン（4-AP）を追加100μMの濃度。

無傷の海馬の準備のために2の外科的処置

1. デシケーターガラスジャー（具体的な材料および装置における第1号）の底でチャンバ内にイソフルラン（1ミリリットル）をドロップし、動物が接触取得していませんので、下段の表面を覆うように、通常の紙タオルを使用液体。その後、瓶にCD1マウスを置き、蓋を閉じます。約1分〜2分間、閉鎖瓶で動物を保​​管してください。息周波数は約1秒あたりのとき、ジャーからマウスを取り外します。
2. 手術台の上でマウスを置き、適切なはさみで首を切る。すぐに断頭した後、約30秒間氷冷（3-4℃）に頭部、酸素スクロースaCSFのを置く。
3. 頭蓋骨の上に皮膚を除去するために、テンポに近い2つの端部にだけでなく、頭の真ん中の線に沿って頭蓋骨をカットする細かいハサミ（特定の材料および機器で5番）を使用してくださいRAL葉。脳を露出させるために、ヘッドの各側にカット頭蓋骨を剥離する鉗子（具体的な材料および装置で第6）を使用します。
4. 慎重に頭蓋骨の底から脳を剥離し、脳と頭蓋骨の頭頂葉の間の隙間にマイクロラボへら（具体的な材料および装置における第8号）を挿入した後、準備された氷のように冷たい上にドロップします（3湿ったろ紙（具体的な材料および装置における第2号）に覆われて-4℃）外科段階。氷冷刃で小脳を外し、脳の正中線を切断して2半球を分離する。その後、氷冷スクロースaCSFのを満たしたビーカー中に分離した2つの半球を配置し、95％O _{2/5％CO 2}でバブリング。
5. 半球の半分を取り、氷冷したろ紙ステージ上に置く。余分なソリューションを吸うために脳を中心に定期的なペーパータオルまたはろ紙を置きます。材料における2ファイアーポリッシュガラスピペットツール（第10号を使用して、脳の中心部の残りの部分から大脳皮質を分離する装置）。
6. 海馬は皮質の内側から露出し、氷冷ステージに置かれた後、組織上の氷冷スクロースのaCSFの2〜3滴を配置し、海馬の周りに余分な溶液を除去する。海馬の両端に皮質との接続を切断します。その後、火災研磨されたガラスのツールで脳から海馬を解剖し、脳の残りの部分を削除します。
7. その白板側を上に向けおよび海馬溝を下に向けて全体の海馬を分離します。すぐに再び組織上の氷冷スクロースのaCSFの2〜3滴をドロップし、ペーパータオルの一片を用いて組織の周りに余分な溶液を除去する。溝（ 図1B、C）を公開する全体海馬を裏返しする火災研磨されたガラスツールを使用します。
8. 通常の光学顕微鏡下では、具体的なMateriに特注のガラス針（11号を挿入溝の方向（ 図1C）に沿ってALSと機器）溝の一端にと鉤状回する歯状回（DG）から、ファイバ接続を切断したりCA1フィールド、。必要に応じて、海馬の中隔と時間的な端をトリミングするために氷のように冷たい刃を適用します。カット溝に（具体的な材料および装置における第12号）カスタムメイドの金属ワイヤループを挿入し、火災研磨されたガラスツールによって海馬の海馬台/ CA1の端部を保持しながら、組織から離れてDGの上に引き出します（ 図1D） 。
9. 上記の展開手順の後、組織上の氷冷スクロースのaCSFの別の2〜3滴を追加し、組織の周りに余分な溶液を除去する。その後、約（エッジ（ 図1E）で氷のように冷たい刃で折り畳まれていない海馬をトリミングし、通常aCSFので満たされた回復室にスパチュラで準備を置き、室温で95％O _{2/5％CO 2}でバブリング25°C）。去る折り畳ま海馬組織は、記録チャンバーにそれを配置する前に約1時間を回復する。
10. 他の脳半球を取り、2.5から2.9のステップを経るためにそれを使用。通常、単一の海馬を展開し、組織酸素化および水和を維持するために継続的に氷のように冷たい蔗糖aCSFのをドロップするように全体の手順を完了するのに約1から2分を取る。

3.実験システムのセットアップ

1. カスタムは、ピングリッドアレイ（PGA）パッケージPMEAを作製し、パッケージ（ 図3B）上のピンのパッドに単一微小電極の各パッドに接続するために、マイクロワイヤボンディングを使用し接着。その後、カスタムメイドの回路基板¹³上のソケットに、パッケージを挿入します。
2. 個別にカスタムメイドの回路基板¹³上の100のゲインで4 kHzとアンプに1ヘルツからバンドパスカットオフ周波数とのフィルタに各微小電極を接続してください。 A / D convは回路基板からのアナログ出力をデジタル化システムertingし、コンピュータのデータを取得し、格納する。
3. 溶液流（ 図4A）のための入口及び出口管を有するアレイの周りにカスタムメイドのプラスチック記録チャンバーを接着。システム内のさまざまなソリューションを維持し、トライ弁によりボトルの出力管に参加し、制御するために、少なくとも2つのボトルを使用してください。記録室にソリューションをガイドされている点滴室で配管システムにトライバルブの出力を接続します。
4. 三バルブと記録チャンバーの入口との間、溶液を記録チャンバーに導かれる前に、制御された温度（35℃）に溶液を加熱する電気ヒータを追加する。フラスコに接続された真空管に液を収集するために真空管に記録チャンバーの出口に取り付ける。この研究では、任意の実験ではすべてのソリューションをリサイクルしないでください。

4. PMEA上に非折り畳み海馬を配置すると、神経活動を記録するために

1. 実験装置を製造するために、通常のaCSFのと4-AP aCSFの持つ別のボトルで1ボトルを埋める。両方のボトル、バブル95％O各実験の当初_{2/5％CO 2。}実験中に選択される解決策を制御するためにトライバルブコネクタを使用してください。集塵容器内に溶液をポンプするチャンバーの出口に真空管を接続します。記録チャンバーにそれを配信する前に、パイプラインを加熱して制御​​された温度レベル（35℃）で溶液を維持する。
2. チャンバ記録の入口と出口が閉じられたときに、記録チャンバー内に折り畳ま海馬を転送し、配置するカスタムメイドガラスピペットスポイトを使用する。顕微鏡下で、組織は溶液中に浮遊している中に、通常の小さなペイントブラシを使用して折り畳まれていない海馬を配置。研究者の方を向いて、下に向けてその白板側に折り畳まれていない海馬を置きCA3エリアまでを指し、およびCA1フィールド。
3. 注意深くチャンバーを乾燥させ、組織アレイ上に下降するまで溶液のレベルを下げて記録チャンバーの端から真空ピペットを用いてチャンバ内の溶液を離れて吸う。その後、慎重にアレイ上に折り畳まれていない海馬を保持するために組織の上にカスタムメイドの組織アンカー（ 図4）（具体的な材料および装置で第14）を配置します。それを補充する記録チャンバーへの溶液の数滴を入れて、徐々に点滴チャンバ内で毎秒約2滴に流量を調整するための入口および出口を開く。
4. 4-APに溶解するaCSFへの液供給を切り替えて、適切に流量を調整し、その後、回復するために約1分間の通常のaCSFた記録室で組織をインキュベートする。約5から10分間aCSFの溶解した4-APで組織をインキュベートした後、研究者は、自発的な活動が表示されたときに信号を記録するためにソフトウェアを起動できます。

5.削除実験後にPMEAからの組織

1. マイクロマニピュレータによる組織アンカーを制御し、徐々に記録チャンバーから組織を持ち上げる。記録チャンバー内の流れを停止し、入口と出口の両方をシャットダウンします。記録チャンバーは、ソリューションとの完全であることや、記録室が満杯でない場合室を埋めるために、溶液の数滴を追加する必要があります。
2. 組織の各コーナーを持ち上げるために小さなペイントブラシを使用してください。組織は、溶液中に浮遊していない場合、組織は、まだアレイの上に座って注意深くチャンバーを乾燥させるために真空管を使用する。その後、慎重に徐々に室を再充填し、記録室がいっぱいになったときに流れを止めるために注入口をシャットダウンする入口を開きます。再び組織の各コーナーを持ち上げるために小さなペイントブラシを適用します。
3. 手順を繰り返し5.2組織がアレイから切り離され、溶液中に浮遊しているまで。組織は、溶液中に浮遊している場合、離れた組織を吸引する真空管を使用する。オープントン彼は、入口に流れと出口に真空を開く。蒸留水でシステムを洗って、それを完全に乾く。

結果

ここで、図面に示されたデータは、4-AP（100μM）を室温で記録チャンバー内の組織のインキュベーションの間に添加するaCSF（25°C）で折り畳ま海馬製剤で記録した。通常、アクティビティが5分以内に開始しますが、高齢の動物からいくつかの海馬組織中でそれは時間がかかることがあります。以前に^14,15を報告したようにPMEAで観察4-APによって誘発される神経細胞の発火は同じです。?...

ディスカッション

海馬の縦方向および横軸が貫通する微小電極アレイと組み合わせて保存されて折り畳まれていない海馬調製物の開発が海馬⁷の解剖接続または神経伝播を研究する強力なツールを提供する。この展開手順は、成体マウスにおける海馬の研究にも適用可能である。この調製物を用いた最近の研究では、4-AP誘発性てんかん様活動は、折り畳まれていない海馬（ 図^6）7,8...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
desiccator jar	LABRECYCLERS Inc.	5410	Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus	N/A	N/A	A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.
Custom made tissue recovery chamber	N/A	N/A	Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco Instruments No.:81995	This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320	This scissors is used to cut the skull of the mice.
Miltex Hysterectomy Forceps	Claflin Medical equipment	CESS-722033-00001	This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula	Cardinal Health		This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula	Cardinal Health		this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush	Lowe's	tem #: 105657                  Model #: 90219	The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper	N/A	N/A	This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor	N/A	N/A	Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.
Custom fabricated microelectrode array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Custom made filter and amplifiers circuits for the array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Data acquisition processor 3400a	Microstar Laboratories	N/A	This is a complete data acquisition system with A/D converter.