관통 마이크로 전극 배열을 펼친 해마 준비에 신경 활동 전파

요약

우리는 뉴런의 CA1-CA3 배열을 유지 체외 펼쳐진 해마를 개발했다. 관통 마이크로 전극 배열과 결합하여 신경 활동 모두 종 방향 및 횡 방향으로 모니터링 할 수있다. 전체 해마 전파를 동시에 기록 할 수 있으므로이 방법은 해마 슬라이스 제제에 비해 많은 장점을 제공한다.

초록

이 프로토콜은 해마 신경 활동에 매핑하는 마이크로 머신 어레이와 결합 체외 플랫 해마 준비 새로운 제조 방법을 설명한다. 가로 해마 슬라이스 준비는 해마의 전기 생리학을 연구하는 가장 일반적인 조직의 준비입니다. 길이 해마 슬라이스는 해마 연결 길이를 조사하기 위하여 개발되었다. 그 두께가 충분한 산소 확산을 허용하기 때문에 본래 마우스 해마는 시험관 내에서 유지 될 수있다. 조직의 일부가 누락되거나 접혀 하나이기 때문에, 이러한 세 가지 제제는 신경 전달에 대한 직접 액세스를 제공하지 않는다. 펼쳐진 그대로 해마는 가로와 체외에서 해마의 신호 전파의 전체 범위를 분석 할 수있는 조직에 직접 액세스를위한 평면 구성의 종 방향 연결을 모두 제공합니다. 효과적으로 t에서 신경 활동을 모니터하기 위해서그 세포층, 정의를 제조 하였다 마이크로 전극 어레이 (PMEA)을 만들어 관통 펼친 해마인가. 높이 200 μm의 64 전극 PMEA 깊은 마우스 해마 내부의 신경 활동을 기록 할 수있다. 펼친 해마 준비 및 PMEA의 독특한 조합 잡음비 높은 신호 해마의 이차원 CA1-CA3 영역의 속도 및 신경 활동의 전파 방향을 연구하는 새로운 시험관 도구를 제공한다.

서문

신경 신호의 신경 전도 또는 전파를 이해하는 것은 뇌 ^1-3의 정상적인 기능 및 병리학 적 조건 모두에서 신경 통신의기구의 결정에 매우 중요하다. 해마는 메모리, 및 공간 추적 같은 몇몇 뇌 기능에 중요한 역할을 극적 행동뿐만 아니라 ^{1,6- 영향} 여러 병리학 적 변화에 관여하기 때문에 뇌에서 가장 광범위하게 연구 한 구조이다. 해마가 복잡한 조직을 나타내고 있지만, 그 구조의 다른 요소가 용이하게 식별되고 슬라이스 제조 ^4-6에 액세스 할 수있다. 해마의 횡단 방향으로, 신경 활동은 치아 이랑 (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5-를 포함 트라이 시냅스 경로를 통해 전파하는 것으로 알려져있다. 이 시냅스 전달 축삭 전도의 대화를 위해 중요한 역할 것으로 여겨진다이 가로 회로 ^4,6에에. 그러나, 신경 신호의 전달 종횡 ^4,6 모두에서 발생한다. 이 해마가 완전히 전파 ^(4)의 특정 방향으로의 관찰을 제한 조각 제제를 사용하여 조사 할 수 없다는 것을 의미한다. 세로 슬라이스 종축을 따라 ⁵ 축삭 경로를 조사하기 위해 개발되었다. 연구자들은 주로 가로 및 세로 축에 각각 ⁶ 함께 행동 별 감마 세타 진동을 관찰했다. 이러한 동작은 개별적으로 연구되고있다, 아직 두 방향에 대한 동시 접근이 이러한 행동을 이해하는 것이 중요하다. 심지어 그대로 해마 제제의 발달로 인한 해마 ^(4)의 절첩 구조로 조직 전체에 걸쳐 전파를 모니터하는 것은 곤란하다. 펼쳐진 해마는 포장 뉴런에 대한 액세스를 제공합니다이차원 평면 셀 ^7,8 층의 형태 일 수있다.

치아 이랑 (DG) (도 1)을 전개함으로써, 해마, 종횡 연결 모두 CA3 및 CA1이 모두 함유 이차원 시트에 배치 된 피라미드 전지 층으로 그대로 유지되는 직사각형 구성으로 편평한 형상을 채용 신경 전달을 조사하기 위해 이용 될 수 신경 조직의 평평한 부분을 이탈 (도 2) ^8. 신경 활동이어서 개별 유리 피펫, 미세 전극 배열, 자극 전극뿐만 아니라, 전압 감응 염료 (VSD) ^{-3,7,8-으로} 모니터링 할 수있다. 또한, 트랜스 제닉 마우스에서 유전자 부호화 전압 표시기 전파 패턴 ^(9)을 추적하는 데 사용될 수있다.

펼친 해마 네트워크의 평면 구성은 광 기록 방법뿐만 아니라 미세 전극 배열에 매우 적합하다. M시중에서 판매하는 배열의 OST는 평면 또는 로우 프로파일 전극을 제조하고 조직 슬라이스 배양 신경 세포 ^10-12 모두에서 신경 활동을 기록 할 수 있습니다. 뉴런의 소마가 조직으로 깊은 위치 보낸 신호가 그대로 조직으로부터 수득되는 경우에는, 신호 대 잡음비 (SNR)가 감소한다. 고 종횡비 미세 전극 배열은 SNR을 향상시키기 위해 필요하다.

이러한 취지, 관통 미세 전극 배열 (PMEA)은 실험실에서 개발되었으며, 펼친 해마 ^7,13으로 20 ㎛, 직경 200 ㎛, 높이 64 스파이크를 삽입하여 조직으로 조사 할 수있는 기능을 제공한다 . 미세 전극이 배열은 전압 감응 염료 촬상에 비해 더 높은 SNR을 가지고 있으며, SNR은 실험 ^7,13 동안 안정적으로 유지. 해마 펼친 준비 및 PMEA의 조합은 투자 할 수있는 새로운 방법을 제공한다2 차원 평면 위에 신경 전달을 igate. 이 기술을 사용하는 실험들은 이미 신경 활동 독립적 시냅스 또는 전기 시냅스 ^(7)의 전파 될 수있다 해마에서 신경 신호 전달 기전에 대한 의미있는 결과를 수득했다.

프로토콜

참고 : 동물 실험 프로토콜을 검토하고 대학에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. P20에 P10의 나이에 하나의 섹스 CD1 마우스는이 연구에 사용됩니다.

수술 및 실험 녹화 1. 솔루션

1. 염화나트륨 (124)의 KCl 3.75, KH ₂ PO4 1.25, _황산 2의 _NaHCO3 (26), 포도당 (10), 및 _CaCl2를 2 : (MM)를 포함하는 일반 인공 뇌척수액 (ACSF) 버퍼를 준비합니다. 실험의 처음에 세척 시스템뿐만 아니라, 박리 후의 조직이 정상 복구 ACSF 사용.
2. 해마 해부하는 동안 사용 과달 자당 ACSF 준비 (MM) : 자당 (220)의 KCl 2.95,의 NaH ₂ PO 4 1.3, _황산 2의 _NaHCO3 (26), 포도당 (10), 및 염화칼슘 _{2 2.} 그대로 해마 조직 준비 간질 활성을 유도하기 위해, 정상인 ACSF에 4- 아미노 피리딘 (4-AP)를 추가100 μM의 농도.

본래 해마 준비 2. 수술

1. 건조기 유리 항아리 (특정 재료 및 장비 1 위)의 하단에있는 챔버로 이소 플루 란 (1 ml)에 드롭하고 동물과 접촉하지 않도록 하단부의 표면을 커버하기 위해 정기적 종이 타월을 사용하여 액체. 그런 다음, 항아리에 CD1 마우스를 넣고 뚜껑을 닫습니다. 약 1 분 ~ 2 분 동안 닫힌 항아리에 동물을 유지합니다. 숨 주파수가 약 1 초 당을 때, 항아리에서 마우스를 제거합니다.
2. 수술 단계에 마우스를 올려 놓고 적절한 가위로 목을 베다. 즉시 참수 한 후, 약 30 초 동안 얼음처럼 차가운 (3-4 ° C에서)로 머리, 산소 자당 ACSF을 배치합니다.
3. 두개골의 상단에있는 피부를 제거하고 템포에 가까운 두 끝에서뿐만 아니라 머리의 중간 선을 따라 두개골을 잘라 미세 가위 (특정 재료 및 장비에 5 호)를 사용하여RAL 로브. 사용 포셉 (특정 재료 및 장비에 번호 6) 뇌를 노출하기 위해 머리의 양쪽으로 절단 된 두개골을 벗겨합니다.
4. 조심스럽게 두개골의 바닥에서 머리를 떼어 다음에 그것을 드롭 뇌와 두개골의 두정엽 사이의 간격에 마이크로 랩 주걱 (특정 재료 및 장비에 8 번)를 삽입 준비된 얼음처럼 차가운 (3 특정 재료 및 장비)에 젖은 종이 필터 (2 번으로 덮여 -4 ° C) 수술 단계. 얼음 냉각 블레이드와 소뇌를 제거하고 뇌의 중간 선을 절단하여 두 개의 반구를 분리합니다. 그런 다음, 95 %, _O2 / 5 % CO _2와 버블 얼음처럼 차가운 자당 ACSF 가득 비커에 분리 된 2 개의 반구를 배치합니다.
5. 얼음처럼 차가운 필터 종이 무대에 반구과 장소의 절반을 가져 가라. 추가 솔루션을 빨아 뇌 주위가 일반 종이 타월이나 종이 필터를 놓습니다. 재료에 두 화재 연마 유리 피펫 도구 (제 10 호를 사용하여장비) 뇌의 중앙 부분의 나머지 부분에서 피질을 분리한다.
6. 해마는 대뇌 피질의 내부에서 노출과 얼음처럼 차가운 무대에 배치 된 후, 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 두 세 방울을 위치하게 한 후, 해마 주변에 여분의 용액을 제거. 해마의 두 끝에서 대뇌 피질로 연결을 잘라. 그런 다음, 불을 연마 유리 도구를 사용하여 뇌에서 해마를 해부 뇌의 나머지 부분을 제거합니다.
7. 그 alveus면이 위를 향하게하고 해마 고랑이 아래로 향하도록하여 전체 해마를 분리합니다. 신속하게 다시 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 두 세 방울을 떨어 뜨리고 종이 타월의 조각을 사용하여 조직의 주위에 여분의 용액을 제거. 고랑 (그림 1B, C)를 노출 전체 해마를 넘겨 화재 연마 유리 도구를 사용합니다.
8. 일반 광학 현미경, 특정 Materi에서 사용자 지정으로 만든 유리 바늘 (11 호를 삽입루게릭 병 및 고랑의 한쪽 끝으로 장비)과 고랑의 방향 (그림 1C)을 따라, 치아 subiculum 할 이랑 (DG) 또는 CA1 필드에서 광섬유 연결을 잘라. 필요한 경우 해마의 중격 및 시간 끝 트림 얼음처럼 차가운 칼날을 적용합니다. 절단 고랑에 (특정 재료 및 장비에 번호 12) 사용자 정의 만든 금속 와이어 루프를 삽입하고 화재 광택 유리 도구에 의해 해마의 subiculum / CA1 끝을 잡고 조직에서 떨어져 DG 세워 (그림 1D) .
9. 위의 전개 과정에 따라, 조직에 얼음처럼 차가운 자당 ACSF의 또 다른 두 세 방울을 추가하고 조직의 주위에 여분의 용액을 제거. 그리고, 에지 (도 1E)에 빙냉 블레이드 펼친 해마 트림 및 약 (RT에서 정상 ACSF 채운 95 %, _O2 / 5 % CO _2로 버블 회수 챔버로 주걱 의해 제제를 배치 25 ° C). 휴가펼친 해마 조직은 기록 챔버로 배치하기 전에 약 1 시간을 복구한다.
10. 다른 뇌 반구를 타고 2.5-2.9 단계를 진행하는 데 사용. 일반적으로, 하나의 해마를 전개하고 산소와 수화 조직을 유지하기 위해 지속적으로 얼음처럼 차가운 자당 ACSF을 드롭 모든 절차를 완료하는 데 약 1 ~ 2 분을.

3. 실험 시스템 설치

1. 핀 그리드 어레이 (PGA) 패키지에 맞춤 제작 PMEA 접착제 및 패키지 (도 3B)에 대한 핀의 패드로 단일 미세 전극으로부터 각 패드를 연결하는 마이크로 와이어 본딩을 사용한다. 그런 다음, 사용자 정의 - 만든 회로 기판 ^(13)의 소켓에 패키지를 삽입합니다.
2. 개별적으로 맞춤 제작 한 회로 기판 ^(13)에 100의 이득과 4 kHz와 앰프에 1 Hz에서에서 대역 통과 차단 주파수와의 필터에 각각의 미세 전극을 연결합니다. A / D 전환 수에 의해 회로 보드로부터의 아날로그 출력을 디지털화erting 시스템을 포함하고, 컴퓨터에 데이터를 수집 및 저장한다.
3. 용액의 흐름 (도 4A)에 대한 입구 및 출구 튜브 어레이와 주변 주문품 플라스틱 기록 챔버를 붙인다. 시스템에서 다른 솔루션을 유지하고, 결합하고 트라이 밸브에 의해 병의 출력 튜브를 제어하기 위해 적어도 두 병을 사용. 기록 챔버로 안내되는 용액 IV 드립 챔버와 배관 시스템 트라이 밸브의 출력을 연결한다.
4. 트라이 - 밸브 및 기록 챔버의 입구 사이에, 용액 기록 챔버로 안내되기 전에 제어 된 온도 (35 ° C)의 해결책을 가열하는 전기 히터를 추가한다. 진공관 접속 플라스크에 용액을 수집 진공관에 기록 챔버의 출구를 연결. 이 연구에서 어떤 실험에서 모든 솔루션을 재활용하지 마십시오.

4. PMEA에 펼친 해마를 배치하면 신경 활동을 기록합니다

1. 실험 장치를 준비하려면, 하나의 정상 ACSF 병, 4-AP ACSF 또 다른 병을 채 웁니다. 두 병, 거품, 95 % O, 각 실험의 처음 ₂ / 5 % CO _2. 실험 기간 동안 선택 될 솔루션을 제어하는​​ 트라이 밸브 커넥터를 사용합니다. 먼지통으로 용액을 펌핑 챔버의 출구에 진공 튜브를 연결한다. 상기 기록 챔버로 전달하기 전에 파이프 라인을 가열하고 조절 된 온도 레벨 (35 ° C)에서 용액을 유지한다.
2. 기록 챔버의 입구 및 출구가 폐쇄되는 경우, 상기 기록 챔버로 펼친 해마 옮기고 배치 주문품 유리 피펫 드롭퍼를 사용한다. 현미경, 조직이 솔루션에 떠있는 동안 정기적 작은 페인트 붓을 사용하여 전개 된 해마를 놓습니다. 그 alveus 측이 멀리 가리키는, CA3 영역을 아래로 향하게하고, CA1 필드가 연구자를 가리키는 펼친 해마를 놓습니다.
3. 조심스럽게 건조 챔버 및 조직이 배열 될 때까지 하강하여 액면을 낮출 기록 챔버의 에지로부터 진공 피펫을 이용하여 챔버 내의 용액을 얻어 빨아. 그런 다음, 조심스럽게 배열에 펼쳐진 해마를 개최 조직의 상단에 사용자 정의 만든 조직 앵커 (그림 4) (특정 재료 및 장비의 제 14 호)를 배치합니다. IV 드립 챔버에서 초당 약 2 방울로 유량을 조정하는 입구 및 출구를 리필하고 서서히 열고 기록 챔버 내로 용액 몇 방울을 넣어.
4. 복구하기 위해 약 1 분 동안 정상으로 기록 ACSF 챔버 내의 조직을 인큐베이션 한 후 4-AP ACSF에 용해 액 공급 전환 적절히 유량을 조정한다. 약 5 내지 10 분 동안 용해 된 ACSF 4-AP의 조직을 인큐베이션 한 후 연구원 운동량이 나타나면 신호를 기록하는 소프트웨어를 시작할 수있다.

5. 제거실험 후 PMEA에서 조직

1. 미세 조작기에 의해 조직을 제어하고 앵커 서서히 기록 챔버로부터 조직을 들어 올려. 녹화 실의 흐름을 중지 입구와 출구를 모두 종료합니다. 기록 액 챔버는 가득이거나 기록 챔버는 가득 차지 않은 경우에 챔버를 채우기 위해 용액의 몇 방울을 추가한다.
2. 조직의 각 모서리를 들어 올리려면 작은 페인트 브러시를 사용합니다. 조직이 용액에 떠 있지 않으면, 조직은 여전히​​ 어레이에 앉아 신중 챔버 건조 진공관을 채용한다. 그런 다음 조심스럽게 점진적으로 챔버를 채우고 기록 챔버가 가득 차면 흐름을 중지 입구를 종료 입구를 엽니 다. 다시 조직의 각 모서리를 들어 올려 작은 페인트 브러시를 적용합니다.
3. 조직까지 단계를 반복 5.2 배열에서 분리하고, 용액에 떠있다. 조직이 용액에 떠있는 경우, 거리 티슈 빨아 진공 튜브를 사용한다. 열기 t그는 입구에 흘러 출구에서 진공을 엽니 다. 증류수로 시스템을 세척하고 건조.

결과

여기서 도면에 도시 된 데이터는 4-AP (100 μM) RT에서 기록 챔버 내의 조직 배양 동안 첨가 ACSF (25 ° C)로 펼친 해마 제제에 기록 하였다. 일반적으로 활동은 5 분 이내에 시작되지만 나이가 동물에서 일부 해마 조직에서 시간이 더 오래 걸릴 수 있습니다. 이전에보고 된 ^14,15 PMEA 관찰 4-AP 유도 된 신경 소성 동일하다. 전극이 200 ㎛의 높이를 가지기 때문에, 전극 팁은 단지 밖으로 전지 층

토론

해마의 종 방향 및 횡 방향 축이 관통하는 미세 전극 배열과 조합 보존 펼친 해마 제제의 개발은, 해마 ⁷ 해부학 신경 연결 또는 전파를 조사하는 강력한 도구를 제공한다. 이 전개 절차는 성인 쥐에서 해마를 공부에 적용됩니다. 이러한 준비와 최근의 연구는 4-AP에 의한 간질 활동이 펼쳐진 해마의 전체 영역에 걸쳐 대각선 파면 (그림 6) ^7,8로 전파 할 수 있음을 보여 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
desiccator jar	LABRECYCLERS Inc.	5410	Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus	N/A	N/A	A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.
Custom made tissue recovery chamber	N/A	N/A	Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco Instruments No.:81995	This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320	This scissors is used to cut the skull of the mice.
Miltex Hysterectomy Forceps	Claflin Medical equipment	CESS-722033-00001	This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula	Cardinal Health		This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula	Cardinal Health		this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush	Lowe's	tem #: 105657                  Model #: 90219	The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper	N/A	N/A	This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor	N/A	N/A	Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.
Custom fabricated microelectrode array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Custom made filter and amplifiers circuits for the array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Data acquisition processor 3400a	Microstar Laboratories	N/A	This is a complete data acquisition system with A/D converter.