Нейронной активности распространения в разложенном гиппокампа подготовки с проникающим Micro-электрода массив

Резюме

Мы разработали развернутый гиппокамп в пробирке, которая сохраняет CA1-Ca3 массив нейронов. В сочетании с проникающим массива микро-электрода, нейронной активности можно наблюдать как в продольном, так и в поперечном направлениях. Этот способ обеспечивает преимущества по сравнению с гиппокампа препаратов срезов в распространение в целых гиппокампа могут быть записаны одновременно.

Аннотация

Этот протокол описывает способ получения нового препарата в пробирке с плоским гиппокампа в сочетании с микро-механической обработке массива для отображения нейронной активности в гиппокампе. Поперечный срез гиппокампа препарат является получение наиболее распространенным ткани гиппокампа для изучения электрофизиологии. Продольная гиппокампа ломтик был разработан для того, чтобы исследовать продольных связей в гиппокампе. В интактных гиппокампа мыши также могут быть сохранены в пробирке, поскольку его толщина позволяет адекватную диффузию кислорода. Тем не менее, эти три препарата не обеспечивают прямой доступ к нейронной распространения, так как некоторые из ткани либо отсутствует, либо сложить. Развернутая нетронутыми гиппокамп обеспечивает как поперечные и продольные связи в плоской конфигурации для прямого доступа к ткани для анализа в полной мере распространения сигнала в гиппокампе в пробирке. Для того, чтобы эффективно контролировать нейронную активность от ТОн клеточный слой, выполненный на заказ проникающего массив микро-электрода (PMEA) был изготовлен и наносили на развернутом гиппокампа. PMEA с 64 электродами 200 мкм в высоту может записывать нейронной активности в глубине гиппокампа мыши. Уникальное сочетание развернутой гиппокампа подготовки и PMEA обеспечивает новый инструмент в пробирке для изучения скорость и направление распространения нейронной активности в двумерных CA1-CA3 регионах гиппокампа с высоким отношением сигнала к шуму.

Введение

Понимание нервной проводимости или распространение нейронных сигналов имеет решающее значение для определения механизма нейронной связи как в нормальной функции и патологических состояний, в головном мозге ^1-3. Гиппокамп является одним из наиболее широко изученных структур в головном мозге, так как он играет фундаментальную роль в различных функций мозга, таких как память и пространственное слежение и участвует в нескольких патологических изменений, которые существенно влияют поведение, а ^1,6. Хотя, гиппокамп обладает сложной организацией, различные элементы его конструкции могут быть легко идентифицированы и доступны в подготовке среза ^4-6. В поперечном направлении гиппокампе, нейронной активности, как известно, распространяются через три-синаптический пути, которые включают в зубчатой ​​извилине (ГД), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5. Считается, что синаптическая передача и аксонов проводимости играют важную роль для communicatiв этой поперечной схеме ^4,6. Тем не менее, распространение сигнала нейронной происходит как в поперечном и продольном направлениях ^4,6. Это означает, что гиппокамп не может быть полностью исследована с помощью препараты срезов, которые ограничивают наблюдение к определенному направлению распространения ^4. Продольный срез был разработан, чтобы исследовать аксонов пути вдоль продольной оси ^5. Исследователи наблюдали поведение конкретных гамма и тета-колебаний преимущественно вдоль поперечных и продольных осей соответственно ^6. Такое поведение были изучены отдельно, но одновременный доступ к обоим направлениям имеет решающее значение для понимания такого поведения. Даже при развитии интактного препарата гиппокампа, трудно контролировать распространение на протяжении всего ткани за счет сложенного-структуры гиппокампа ^4. Развернутая гиппокамп обеспечивает доступ к упакованных нейроновв виде плоской двумерной клеточного слоя ^7,8.

По разворачивается зубчатой ​​извилине (DG) (рисунок 1), гиппокамп принимает уплощенную форму с прямоугольной конфигурации, в которой оба поперечных и продольных связей остаются нетронутыми с пирамидальной слоя клеток, расположенных в двумерной листа, содержащего как CA3 и CA1, оставляя плоскую часть нервной ткани, которые могут быть использованы для исследования нейронной распространение (рисунок 2) ^8. Нейронной активности может контролироваться с отдельных стеклянных пипеток, микроэлектродов массивов, стимулирующих электродов, а также напряжения чувствительных красителей (VSD) ^3,7,8. Кроме того, генетически кодируемых индикатор напряжения от трансгенных мышей могут быть использованы для отслеживания шаблон для размножения ^9.

Плоская конфигурация разложенном гиппокампа сети хорошо подходит для оптической записи метода, но и для массива микроэлектродов. MOST из коммерчески доступных массивов изготавливаются с плоскими или низкопрофильных электродов и может записывать активность нейронов в обоих срезов тканей и культивируемых нейронов ^10-12. Тем не менее, отношение сигнал-шум (ОСШ) уменьшается, когда сигналы получены из интактного ткани, так как сомы нейронов расположены глубже в ткани. Микроэлектродные электродов массивы с высокими пропорциями требуется, чтобы улучшить SNR.

С этой целью, проникая микроэлектрод массив (PMEA) была разработана в нашей лаборатории, а также предоставляет возможность непосредственно зонда в ткани, вставив 64 шипов с диаметром 20 мкм и высотой 200 мкм в развернутых гиппокампа ^7,13 , Этот массив микроэлектродов имеет более высокий SNR по сравнению с изображениями чувствительной красителя напряжения и SNR остается стабильным во время эксперимента ^7,13. Сочетание разложенном гиппокампа подготовки и PMEA обеспечивает новый способ инвестироватьIGATE нейронной распространении над двумерной плоскости. Эксперименты, использующие этот метод уже дали значительные результаты о механизмах распространения нервного сигнала в гиппокампе при этом нейронная активность может распространяться независимо от синаптических и электрических синапсов ^7.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Animal экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животного в университете. CD1 мышей обоего пола в возрасте от P10 до P20 используются в данном исследовании.

1. Решения для хирургии и экспериментальной записи

1. Подготовка нормального искусственного спинномозговой жидкости (ACSF) буфера, содержащего (мМ): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO4 1,25, MgSO ₄ 2, NaHCO ₃ 26, декстроза 10, и CaCl ₂ 2. Эта нормальной ACSF для восстановления тканей после вскрытия, а также для стирки системы в начале эксперимента.
2. Подготовка сахарозы ACSF, который используется во время гиппокампа вскрытия и содержит (мМ): Сахароза 220, KCl 2,95, NaH ₂ PO 4 1,3, MgSO ₄ 2, NaHCO ₃ 26, декстроза 10, и CaCl ₂ 2. Для того, чтобы побудить эпилептиформная деятельность в неповрежденном гиппокампе тканевого препарата, добавить 4-аминопиридин (4-AP) к нормальной ACSF наконцентрация 100 мкМ.

2. Хирургические процедуры для неповрежденном гиппокампа подготовки

1. Оставьте изофлурана (1 мл) в камере в нижней части сушильной печи стеклянную банку (№ 1 в конкретных материалов и оборудования) и использовать обычную бумажную салфетку, чтобы покрыть поверхность нижней ступени, так животное не войти в контакт с жидкость. Затем поместите CD1 мышь в банку и закройте крышку. Держите животное в закрытом кувшине около 1 мин до 2 мин. Когда частота дыхания составляет около одного в секунду, удалить мышь из банки.
2. Наведите на сцене хирургии и обезглавить с подходящим ножницами. Сразу же после обезглавливания, поместите голову в ледяную (3-4 ° С), кислородом сахарозы ACSF около 30 сек.
3. Используйте тонких ножниц (№ 5 в конкретных материалов и оборудования), чтобы удалить кожу на верхней части черепа и сократить череп вдоль средней линии головы, а также на двух концах рядом с темпомRAL доле. Используйте пинцет (№ 6 в конкретных материалов и оборудования) для того чтобы слезть вырезать череп к каждой стороне головы, чтобы выставить на мозг.
4. Вставьте микро лаборатории шпателем (№ 8 в конкретных материалов и оборудования) в зазор между теменной долей мозга и черепа, чтобы тщательно очистить мозг от нижней части черепа, а затем перетащите его на подготовленный ледяной (3 -4 ° C) Хирургический этап покрыты влажной фильтровальной бумаги (№ 2 в конкретных материалов и оборудования). Удалить мозжечок с охлажденного льдом лезвия и разделить два полушария за счет сокращения средней линии мозга. Затем поместите два разделенных полушарий в стакан, наполненный ледяной сахарозы ACSF продувают 95% O _2/5% CO _2.
5. Возьмите одну половину полушария и место на сцене фильтровальной бумаги ледяной. Поместите регулярные Бумажные полотенца или фильтровальной бумаги вокруг мозга, чтобы сосать дополнительную решения. Используйте две пожарные-полированного стекла пипеток инструменты (№ 10 в материалах иОборудование), чтобы отделить кору от остальной части центральной части головного мозга.
6. После гиппокамп подвергается изнутри коры и поставить на ледяной сцене, поместите два или три капли ледяной сахарозы ACSF на ткань, а затем удалить лишние раствора вокруг гиппокампа. Разрежьте связи с коры на двух концах гиппокампа. Затем, рассекают гиппокамп из мозга с огнем полированного стекла инструментов и снимите оставшуюся часть мозга.
7. Разделить всю гиппокамп с его Alveus стороной вверх и гиппокампа борозда вниз. Быстро падает два или три капли ледяной сахарозы ACSF на ткани снова и удалить лишнюю раствор вокруг ткани использованием кусок бумажным полотенцем. Используйте пожарной полированное стекло инструмент, чтобы перевернуть весь гиппокамп, чтобы разоблачить борозды (рис 1B, C).
8. Под нормальной оптического микроскопа, вставьте на заказ стеклянные игольчатые (№ 11 в конкретных материаALS и оборудование) в один конец борозды и сократить соединения волокна, из зубчатой ​​извилины (ГД), чтобы Основание гиппокампа или области СА1, вдоль направления борозды (рис 1С). Нанесите ледяной клинок, чтобы урезать перегородки и временные концы гиппокампе, если это необходимо. Вставьте ковка проволочную петлю (№ 12 в конкретных материалов и оборудования) в вырез борозды и потяните за DG от ткани, держа конец Основание гиппокампа / CA1 гиппокампа в результате пожара полированного стекла инструмента (рис 1D) ,
9. После разворачивается процедуру, описанную выше, добавить еще два или три капли ледяной сахарозы ACSF на ткани и удалить лишнюю раствора вокруг ткани. Затем, обрезать развернутый гиппокамп с ледяной лезвия по краям (рис 1E) и поместите подготовку шпателем в восстанавливающейся камере, заполненной нормальной ACSF и ыми с 95% O _2/5% CO ₂ при комнатной температуре (около 25 ° С). Оставлятьразвернутая гиппокамп ткани для восстановления около 1 часа до размещения его в записи камеры.
10. Возьмите другое полушарие мозга и использовать его, чтобы пройти через этапы от 2,5 до 2,9. Как правило, занимает около 1 до 2 минут, чтобы закончить всю процедуру, чтобы развернуть единую гиппокамп и падение ледяной сахарозы ACSF постоянно держать ткань кислородом и увлажненной.

Настройка 3. Экспериментальная система

1. Клей на заказ, изготовленный РМЕА на Pin Grid Array (PGA) пакета и использовать микро проводного соединения для подключения каждого площадку из одного микроэлектродом на площадку штифта на упаковке (рис 3б). Затем вставьте пакет в гнездо на заказ плате ^13.
2. Индивидуально подключения каждого микроэлектрода его фильтров с полосовой частоты среза от 1 Гц до 4 кГц и усилителей с коэффициентом усиления 100 на заказ сделал плате ^13. Оцифровка аналогового выхода из печатной платы с помощью A / D CONVerting систему, а принимать и хранить данные на компьютере.
3. Клей на заказ пластиковую камеру для записи вокруг массива с впускным и выпускным шлангом для потока раствора (рис 4а). Использование по меньшей мере, две бутылки, чтобы различные решения в системе, а также участвовать и контролировать выходной трубопровод из бутылок по три-клапана. Подключите выход три-клапан к системе трубопроводов с капельницами камеры, которая направляет решение в записи камеры.
4. Между три-клапана и входом записи камеры, добавить электрический нагреватель для нагревания раствора до контролируемой температуре (35 ° C) до того, как раствор направляется в камеру записи. Прикрепите выход из записи камеры в вакуумную трубку, чтобы собрать раствор в вакуумной трубки, подключенного колбу. Не заменяю какого-либо решения в любом эксперименте в данном исследовании.

4. Размещение разложенном гиппокампа на PMEA Для записи нейронной активности

1. Чтобы подготовить экспериментальную установку, заполните одну бутылку с нормальным ACSF и еще одну бутылку с 4-AP ACSF. В обоих бутылок, пузырьков 95% O _2/5% CO ₂ с самого начала каждого эксперимента. Использование соединителя три-клапана, чтобы управлять, какое решение будет выбран в ходе эксперимента. Подключение вакуумную трубку на выходе из камеры для перекачки раствора в пылесборнике. Нагреть трубопровода перед подачей его в камеру записи и сохранить решение на контролируемом уровне температуры (35 ° C).
2. Когда на входе и выходе из записи камеры закрыты, использовать на заказ стекло пипетки пипетки перенести и поставить развернутый гиппокамп в записи камеры. Под микроскопом, поместите развернутую гиппокамп с помощью регулярного небольшой кисти, а ткань, плавающие в растворе. Поставьте развернутый гиппокамп с его Alveus стороной вниз, Ca3 область указывая прочь, и CA1 поля, направленного в сторону исследователя.
3. Осторожно отсасывают раствор в камере с помощью вакуумного пипетки от кромки камеры записи, чтобы понизить уровень раствора в камере до тех пор, пока сушат и ткань опускают на массиве. Затем осторожно поместить на заказ ткани якорь (рис 4) (№ 14 в конкретных материалов и оборудования) на верхней части ткани, чтобы держать развернутую гиппокамп на массив. Положите несколько капель раствора в записи камеры, чтобы пополнить его, и постепенно открыть вход и выход для регулировки расхода около двух капель в секунду в IV капельнице.
4. Инкубируйте ткани в записи камеры с нормальной ACSF в течение приблизительно 1 мин, чтобы восстановить, а затем переключить подачу раствора до 4-AP, растворенного ACSF и регулировать расход должным образом. Инкубируйте ткани в 4-AP, растворенного ACSF в течение приблизительно от 5 до 10 мин, а затем исследователь может запустить программное обеспечение для записи сигнала, когда появляется спонтанной активности.

5. СнятиеТкань из PMEA после эксперимента

1. Управление ткани якорем микроманипулятор и постепенно поднять ткани, из записи камеры. Выключите впускного и выпускного отверстия, чтобы остановить поток в записи камеры. Камера Запись должна быть полной раствором или добавить несколько капель раствора, чтобы заполнить камеру, если камера Запись не является полной.
2. Используйте маленькую кисть, чтобы поднять каждый угол ткани. Если ткань не плавает в растворе, а затем использовать вакуумную трубку, чтобы высохнуть камеру осторожно ткани по-прежнему сидит на массиве. Затем осторожно открыть отверстие постепенно пополнить камеру и закрыли отверстие, чтобы остановить поток, когда камера записи заполнена. Нанесите небольшое кисть, чтобы поднять каждый угол ткани снова.
3. Повторите шаг 5,2 до ткани отделяется от массива и плавающий в растворе. Если ткань плавает в растворе, а затем использовать вакуумную трубку, чтобы сосать ткани от отеля. Открыть тон течь на входе и открыть вакуум в розетку. Вымойте систему дистиллированной водой и высушить его.

Результаты

Данные, показанные на чертежах здесь были записаны в разложенном подготовки гиппокампа с 4-AP (100 мкМ), добавленного во ACSF инкубации ткани в записи камеры при комнатной температуре (25 ° C). Обычно деятельность начинается в течение 5 мин, но в некоторых гиппокампа ткани от старых животных это...

Обсуждение

Развитие разложенном подготовки гиппокампе, где продольные и поперечные оси гиппокампа сохраняются в комбинации с проникающим массива микроэлектродов, представляет собой мощный инструмент для исследования соединений анатомии или нервных распространение в гиппокампе ^7. Это ра...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
desiccator jar	LABRECYCLERS Inc.	5410	Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus	N/A	N/A	A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.
Custom made tissue recovery chamber	N/A	N/A	Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco Instruments No.:81995	This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320	This scissors is used to cut the skull of the mice.
Miltex Hysterectomy Forceps	Claflin Medical equipment	CESS-722033-00001	This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula	Cardinal Health		This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula	Cardinal Health		this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush	Lowe's	tem #: 105657                  Model #: 90219	The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper	N/A	N/A	This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor	N/A	N/A	Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.
Custom fabricated microelectrode array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Custom made filter and amplifiers circuits for the array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Data acquisition processor 3400a	Microstar Laboratories	N/A	This is a complete data acquisition system with A/D converter.