Neural Activity Propagazione in ippocampale preparazione piegato con un penetrante Micro-elettrodo Array

Riepilogo

Abbiamo sviluppato un ippocampo spiegato in vitro che conserva CA1-CA3 array di neuroni. In combinazione con la matrice di micro-penetrante elettrodi, attività neurale può essere monitorato in entrambi gli orientamenti longitudinali e trasversali. Questo metodo fornisce vantaggi rispetto fettine ippocampali come la propagazione in tutta nell'ippocampo possibile registrare contemporaneamente.

Abstract

Questo protocollo descrive un metodo per preparare una nuova preparazione in vitro nell'ippocampo piatta combinata con una matrice di micro-lavorato per mappare l'attività neuronale nell'ippocampo. La trasversale preparato fetta ippocampo è la preparazione dei tessuti più comuni per studiare ippocampo elettrofisiologia. Una fetta longitudinale ippocampo è stato sviluppato anche per indagare le connessioni longitudinali nell'ippocampo. L'ippocampo intatti mouse possono anche essere mantenute in vitro perché il suo spessore consenta un'adeguata diffusione dell'ossigeno. Tuttavia, questi tre preparazioni non forniscono un accesso diretto alla propagazione neurale dal momento che alcuni dei tessuti è mancante o piegato. L'ippocampo intatta unfolded fornisce sia connessioni longitudinali in una configurazione piatta per l'accesso diretto al tessuto di analizzare la piena portata di propagazione del segnale nell'ippocampo in vitro e trasversale. Al fine di monitorare efficacemente l'attività neurale da tegli strato di cellule, un fatto del penetrante gamma di micro-elettrodi (PMEA) è stato fabbricato e applicato l'ippocampo spiegato. Il PMEA con 64 elettrodi di 200 micron di altezza potrebbe registrare l'attività neurale in profondità all'interno dell'ippocampo di topo. La combinazione unica di un preparato hippocampal dispiegata e PMEA fornisce un nuovo strumento in vitro per studiare la velocità e la direzione di propagazione dell'attività neurale nei bidimensionali regioni CA1-CA3 dell'ippocampo con un alto rapporto segnale-rumore.

Introduzione

Informazioni conduzione neurale o propagazione dei segnali neurali è cruciale per determinare il meccanismo di comunicazione neurale sia nel normale funzionamento e condizioni patologiche nel cervello ^1-3. L'ippocampo è una delle strutture più studiati nel cervello in quanto svolge ruolo fondamentale in molte funzioni cerebrali come la memoria, e il monitoraggio del territorio ed è coinvolto in diverse alterazioni patologiche che influenzano notevolmente il comportamento e ^1,6. Sebbene, l'ippocampo presenta una struttura complessa, i vari elementi della struttura possono essere facilmente identificate ed accessibili nella preparazione fetta ^4-6. Nella direzione trasversale dell'ippocampo, attività neurale è noto per propagare attraverso la via tri-sinaptica che compongono il giro dentato (DG), CA3, CA1 andsubiculum ^4,5. Si ritiene che la trasmissione sinaptica e conduzione assonale svolgono un ruolo importante per communicatiin questo circuito trasversale ^4,6. Tuttavia, la propagazione del segnale neurale avviene sia trasversale e longitudinale ^4,6. Questo implica che l'ippocampo non può essere completamente studiato utilizzando preparazioni fetta che limitano l'osservazione ad una particolare direzione di propagazione ^4. La fetta longitudinale è stato sviluppato per studiare le vie assonale lungo l'asse longitudinale ^5. I ricercatori hanno osservato gamma e theta oscillazioni specifici comportamenti prevalentemente lungo la trasversale e assi longitudinali rispettivamente ^6. Questi comportamenti sono stati studiati separatamente, ma l'accesso simultaneo a due direzioni è cruciale per capire questi comportamenti. Anche con lo sviluppo della preparazione dell'ippocampo intatta, è difficile controllare la propagazione tutto il tessuto a causa della struttura ripiegata-dell'ippocampo ^4. L'ippocampo spiegato fornisce l'accesso ai neuroni imballatoin una forma di un piano bidimensionale strato di cellule ^7,8.

Con dispiegarsi giro dentato (DG) (Figura 1), l'ippocampo adotta una forma appiattita con una configurazione rettangolare, in cui entrambe le connessioni longitudinali e trasversali rimangono intatti con lo strato di cellule piramidali disposti in un foglio bidimensionale contenente sia CA3 e CA1, lasciando un pezzo di tessuto neurale che può essere usato per studiare la propagazione neurale (Figura 2) ^8. L'attività neurale può essere monitorato con i singoli pipette di vetro, matrici di microelettrodi, elettrodi stimolanti, così come coloranti sensibili tensione (VSD) ^3,7,8. Inoltre, geneticamente codificato indicatore di tensione da topi transgenici possono essere utilizzati per monitorare lo schema di propagazione ^9.

La configurazione piatta della rete dell'ippocampo spiegato è adatto per la registrazione metodo ottico, ma anche per una matrice microelettrodo. Most degli array disponibili in commercio sono fabbricati con elettrodi profilo piatto o basso e in grado di registrare l'attività neurale in entrambe le fette di tessuto e colture di neuroni ^10-12. Tuttavia, il rapporto segnale-rumore (SNR) diminuisce quando i segnali sono ottenuti da un tessuto intatto dal soma dei neuroni si trovano più in profondità nel tessuto. Schiere di elettrodi microelettrodi con elevati rapporti di aspetto sono necessari per migliorare il SNR.

A tal fine, una matrice microelettrodo penetrante (PMEA) è stato sviluppato nel nostro laboratorio, e fornisce la capacità di sondare direttamente nel tessuto inserendo 64 picchi con un diametro di 20 micron e 200 micron altezza nell'ippocampo unfolded ^7,13 . Questa matrice microelettrodo ha una maggiore SNR rispetto sensibili di imaging colorante tensione e il SNR rimane stabile durante un esperimento ^7,13. La combinazione della preparazione dell'ippocampo dispiegata e PMEA fornisce un nuovo modo di investireiGate propagazione neurale su un piano bidimensionale. Gli esperimenti con questa tecnica hanno già dato risultati significativi sui meccanismi di propagazione del segnale neurale nell'ippocampo cui attività neurale in grado di propagarsi autonomamente di sinapsi sinaptici o elettrici ^7.

Protocollo

NOTA: Animal protocolli sperimentali sono stati esaminati e approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale presso l'università. CD1 topi di entrambi i sessi, all'età di P10 a P20 sono utilizzati in questo studio.

1. Le soluzioni per la chirurgia e la registrazione sperimentale

1. Preparare tampone normale liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) contenente (mM): NaCl 124, KCl 3,75, KH ₂ PO 4 1,25, MgSO ₄ 2, _NaHCO3 26, destrosio 10, e CaCl ₂ 2. Utilizzare questo normale aCSF per il recupero dei tessuti dopo la dissezione, così come per il sistema di lavaggio all'inizio dell'esperimento.
2. Preparare saccarosio aCSF che viene utilizzata durante la dissezione dell'ippocampo e contiene (mm): 220 saccarosio, KCl 2,95, NaH ₂ PO4 1.3, MgSO ₄ 2, ₃ NaHCO 26, destrosio 10, e CaCl ₂ 2. Per indurre attività epilettiforme nella preparazione del tessuto dell'ippocampo intatta, aggiungere 4-aminopiridina (4-AP) alla normalità aCSF ala concentrazione di 100 mM.

2. Procedura chirurgica per l'Hippocampus preparazione Intact

1. Goccia isoflurano (1 ml) nella camera al fondo di un barattolo di vetro essiccatore (No.1 in materiali specifici e attrezzature) e usare un tovagliolo di carta normale per coprire la superficie della fase inferiore in modo che l'animale non entrare in contatto con il liquido. Quindi, posizionare il mouse CD1 nel barattolo e chiudere il coperchio. Mantenere l'animale nel vaso chiuso per circa 1 min per 2 min. Quando la frequenza respiro è di circa uno al secondo, rimuovere il mouse dal vaso.
2. Posizionare il mouse sul palco chirurgia e decapitarlo con un adeguato forbici. Subito dopo decapitazione, posizionare la testa nel ghiacciata (3-4 ° C), saccarosio ossigenato aCSF per circa 30 sec.
3. Utilizzare forbici fini (No.5 in materiali specifici e Equipment) per rimuovere la pelle sulla parte superiore del cranio e di tagliare il cranio lungo la linea centrale della testa, nonché a due estremità vicino il tempolobo ral. Utilizzare pinze (# 6 in materiali specifici e attrezzature) per sbucciare cranio tagliata verso ogni lato della testa, al fine di esporre il cervello.
4. Inserire un laboratorio spatola micro (No. 8 in materiali specifici e attrezzature) nella fessura tra i lobi parietali del cervello e del cranio a sbucciare con attenzione il cervello dal fondo del cranio e poi rilasciarlo su un preparato ghiacciata (3 -4 ° C) fase chirurgica ricoperta con carta da filtro bagnata (n.2 in materiali specifici e attrezzature). Rimuovere il cervelletto con una lama di ghiaccio-refrigerati e separare i due emisferi tagliando la linea mediana del cervello. Poi, posizionare i due emisferi separati in un bicchiere pieno di saccarosio aCSF ghiacciato bollito con il 95% O _2/5% di CO _2.
5. Prendere una metà dell'emisfero e posto sulla scena carta da filtro ghiacciata. Posizionare asciugamani di carta regolari o carta da filtro in tutto il cervello a succhiare la soluzione supplementare. Utilizzare due strumenti pipetta di vetro al fuoco lucido (# 10 in Materiali eEquipment) per separare la corteccia dal resto della parte centrale del cervello.
6. Dopo l'ippocampo è esposta all'interno della corteccia e messo in fase gelata, collocare due o tre gocce di ghiacciata saccarosio aCSF sul tessuto e poi rimuovere la soluzione supplementare intorno nell'ippocampo. Tagliare le connessioni con la corteccia a due estremità dell'ippocampo. Poi, sezionare l'ippocampo fuori del cervello con gli strumenti di vetro fuoco lucidato e rimuovere la parte restante del cervello.
7. Separare l'intero ippocampo con il lato rivolto verso l'alto e alveus ippocampale solco rivolto verso il basso. Rilasciare rapidamente due o tre gocce di ghiacciata saccarosio aCSF sul tessuto di nuovo e rimuovere la soluzione extra intorno il tessuto utilizzando un foglio di carta assorbente. Utilizzare uno strumento di vetro fuoco lucido per girare su tutto ippocampo per esporre il solco (Figura 1B, C).
8. Sotto un microscopio ottico normale, inserire un ago di vetro su misura (No. 11 in specifico Materials e Impianti) in un'estremità del solco e tagliare le connessioni di fibre, di giro dentato (DG) per subiculum o il campo CA1, lungo la direzione del solco (Figura 1C). Applicare una lama ghiacciata per tagliare i setto e temporali estremità dell'ippocampo se necessario. Inserire un anello di filo metallico su misura (n ° 12 in materiali specifici e attrezzature) nel solco di taglio e tirare su il DG di distanza dal tessuto tenendo la fine subiculum / CA1 dell'ippocampo da uno strumento di fuoco in vetro lucido (Figura 1D) .
9. Seguendo la procedura sopra dispiegamento, aggiungere altri due o tre gocce di saccarosio aCSF ghiacciata sul tessuto e rimuovere la soluzione supplementare intorno al tessuto. Quindi, tagliare l'ippocampo spiegato con la lama ghiacciata ai bordi (Figura 1E) e posizionare la preparazione da una spatola nella camera di recupero riempita con aCSF normale e gorgogliare con 95% O _2/5% di CO ₂ a RT (circa 25 ° C). Lasciareil tessuto ippocampo spiegato di recuperare circa 1 ora prima di metterlo nella camera di registrazione.
10. Prendere l'altro emisfero del cervello e usarlo per passare attraverso passaggi 2,5-2,9. Di solito, prendere circa 1 a 2 minuti per completare l'intera procedura di dispiegare un solo ippocampo e drop ghiacciata saccarosio aCSF continuamente per mantenere il tessuto ossigenato e idratata.

Setup 3. sistema sperimentale

1. Colla un PMEA fabbricato personalizzato su un Pin Grid Array (PGA) pacchetto e utilizzare micro bonding cavo per collegare ogni pad da un singolo microelettrodo al pad di un perno sulla confezione (Figura 3B). Quindi, inserire il pacchetto nella presa su un circuito su misura ^13.
2. Collegare individualmente ogni microelettrodi per i suoi filtri con banda passante frequenza di taglio da 1 Hz a 4 KHz e amplificatori con guadagno del 100 sul circuito misura ^13. Digitalizzare l'uscita analogica del circuito da un A / D convSistema erting, e acquisire e memorizzare i dati su un computer.
3. Colla un camera di registrazione di plastica su misura intorno l'array con aspirazione e tubo di uscita per il flusso della soluzione (Figura 4A). Utilizzare almeno due bottiglie di mantenere diverse soluzioni nel sistema, e unire e controllare il tubo di uscita delle bottiglie da un tri-valvola. Collegare l'uscita del tri-valvola per un sistema di tubi con una camera di gocciolamento IV, che guida la soluzione nella camera di registrazione.
4. Tra il tri-valvola e l'ingresso della camera di registrazione, aggiungere un riscaldatore elettrico per riscaldare la soluzione a temperatura controllata (35 ° C) prima che la soluzione è guidato alla camera di registrazione. Attaccare l'uscita della camera di registrazione di un tubo a vuoto per raccogliere la soluzione in un pallone collegato valvolare. Non riciclare alcuna soluzione in ogni esperimento in questo studio.

4. Posizionamento del Hippocampus piegato sul PMEA per registrare l'attività neurale

1. Per preparare il setup sperimentale, riempire una bottiglia con aCSF normale e una bottiglia con 4-AP aCSF. In entrambe le bottiglie, la bolla del 95% O _2/5% di CO ₂ fin dall'inizio di ogni esperimento. Utilizzare un connettore a tre valvole per controllare che la soluzione sarà selezionato durante un esperimento. Collegare un tubo a vuoto all'uscita della camera per pompare la soluzione in un contenitore di polvere. Riscaldare il gasdotto prima consegna nella camera di registrazione e mantenere la soluzione ad un livello di temperatura controllata (35 ° C).
2. Quando l'ingresso e l'uscita della camera di registrazione sono chiusi, utilizzare una misura contagocce pipetta di vetro per trasferire e posizionare l'ippocampo spiegato nella camera di registrazione. Sotto il microscopio, posizionare l'ippocampo spiegato utilizzando un normale piccolo pennello, mentre il tessuto è fluttuante nella soluzione. Posizionare l'ippocampo spiegato con il lato rivolto verso il basso alveus, zona CA3 che punta lontano, e il campo CA1 punta verso il ricercatore.
3. Succhiare attenzione via la soluzione nella camera con una pipetta di aspirazione dal bordo della camera di registrazione per abbassare il livello della soluzione fino a quando la camera viene essiccato e il tessuto viene abbassato sulla matrice. Poi, posizionare accuratamente un ancoraggio tessuto misura (Figura 4) (No. 14 in specifici materiali e attrezzature) sulla parte superiore del tessuto per contenere l'ippocampo spiegato sulla matrice. Mettere alcune gocce di soluzione nella camera di registrazione a riempirlo, e gradualmente aprire l'ingresso e l'uscita per regolare la portata di circa due gocce al secondo nella camera di gocciolamento IV.
4. Incubare il tessuto nella camera di registrazione con normale aCSF per circa 1 min a recuperare, quindi passare il rifornimento della soluzione di 4-AP aCSF sciolto e regolare la portata correttamente. Incubare il tessuto in 4-AP sciolti aCSF per circa 5 a 10 minuti e poi il ricercatore potrebbe iniziare il software per registrare il segnale quando appare attività spontanea.

5. RimozioneTessuto dalla PMEA Dopo un esperimento

1. Controllare l'ancoraggio del tessuto da un micromanipolatore e gradualmente sollevare il tessuto dalla camera di registrazione. Spegnere sia ingresso e uscita per arrestare il flusso nella camera di registrazione. La camera di registrazione dovrebbe essere pieno di soluzione o aggiungere qualche goccia di soluzione per riempire la camera se la camera di registrazione non è pieno.
2. Utilizzare un piccolo pennello per sollevare ogni angolo del tessuto. Se il tessuto non è fluttuante nella soluzione, poi impiegare il tubo vuoto per asciugare la camera accuratamente con il tessuto ancora seduto sulla matrice. Quindi aprire accuratamente l'ingresso per riempire progressivamente la camera e chiudere l'ingresso per arrestare il flusso quando la camera di registrazione è pieno. Applicare il piccolo pennello per sollevare di nuovo ogni angolo del tessuto.
3. Ripetere passaggio 5.2 finché il tessuto viene staccato dalla matrice e galleggianti nella soluzione. Se il tessuto è fluttuante nella soluzione, quindi utilizzare il tubo a vuoto per aspirare il tessuto di distanza. Aprire tegli flusso in ingresso e aprire il vuoto nella presa. Lavare il sistema con acqua distillata e asciugarlo.

Risultati

I dati riportati nelle figure qui sono stati registrati nella preparazione nell'ippocampo spiegato con 4-AP (100 mM) aCSF aggiunto durante l'incubazione del tessuto nella camera di registrazione a RT (25 ° C). Normalmente l'attività inizia entro 5 minuti, ma in alcuni tessuti ippocampali dagli animali più anziani potrebbe richiedere più tempo. La cottura neuronale 4 AP-indotta osservato con il PMEA è lo stesso come precedentemente riportato ^14,15. Poiché gli elettrodi hanno un'altezza di...

Discussione

Lo sviluppo della preparazione dell'ippocampo spiegato, dove gli assi longitudinali e trasversali dell'ippocampo sono conservati in combinazione con una matrice microelettrodo penetrante, fornisce un potente strumento per studiare le connessioni anatomia o propagazione neurale nell'ippocampo ^7. Questa procedura dispiegarsi è applicabile per lo studio ippocampo in topi adulti anche. Recenti studi con questa preparazione hanno mostrato che l'attività epilettiforme 4-AP-indotta potrebbe propaga...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
desiccator jar	LABRECYCLERS Inc.	5410	Place regular paper towels at the bottome of the jar for animal anesthesia use.
A blade and Custome made surgical stage for unfolding hippocampus	N/A	N/A	A petri dish is place upside down (in the center) in the ice with a wet filter paper place on top of it.
Custom made tissue recovery chamber	N/A	N/A	Plastic tubes were glued with plastic mesh at the bottom and bubbled with 95% O2/ 5% CO2 in the aCSF.
Straight Operating Scissors	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco Instruments No.:81995	This scissors is used to   decapitate the mice.
Integra Miltex Goldman-Fox Scissors	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           No.:5-SC-320	This scissors is used to cut the skull of the mice.
Miltex Hysterectomy Forceps	Claflin Medical equipment	CESS-722033-00001	This Forceps is used to peel the cut skull to expose the brain
Micro Spatula	Cardinal Health		This micro spatula is used to tranfer the whole brain of a semisphere into the recorering chamber.
Frey Scientific Stainless Steel Semi-Micro Spatula	Cardinal Health		this semi micro spatula is used to tranfer the unfolded hippocampus into the glucose aCSF in the recovering chamber.
small paint brush	Lowe's	tem #: 105657                  Model #: 90219	The one with the smallest size in a normal paint brush package
Fire polished glass help tool	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass needle	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes.
Custom made glass tool with a metal wire loop	N/A	N/A	This tool was fire polished and made from the regular Pasteur glass pipettes with a reshaped metal wire loop.
Custom made glass solution dropper	N/A	N/A	This tool was  made from the regular Pasteur glass pipettes with its tips cut and a rubber head attached with the cut end.
Custom made tissue anchor	N/A	N/A	Nylon fiber mesh was glued on a insulated copper wire ring. The tissue anchor was hold by an micromanipulator.
Custom fabricated microelectrode array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Custom made filter and amplifiers circuits for the array	N/A	N/A	More detail about the array please refer to  Kibler, et al, 2011.
Data acquisition processor 3400a	Microstar Laboratories	N/A	This is a complete data acquisition system with A/D converter.