植物の氷核と氷伝播の研究のための高解像度赤外線サーモグラフィ（HRIT）の使用

要約

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

要約

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

概要

植物が活発に増殖している場合に発生する凍結温度は、植物がほとんど、あるいは全く凍結耐性を持っている場合は特に、致死することができます。このような霜のイベントは、多くの場合、農業生産に壊滅的な影響を持っていると、特に高山、サブ北極および北極の生態系^1-6に、植物の自然集団におけるコミュニティ構造を形成する上で重要な役割を果たすことができます。深刻な春の霜のエピソードは、近年^7-9でアメリカと南アメリカの果実生産に大きな影響を持っていた、より一般的な平均低温が続く暖かい天候の早期発症によって悪化されています。初期の暖かい天気がない霜耐性^1,3,10-12にはほとんど持っているすべてのそれらの新芽、葉、花の成長を活性化し、破壊するために芽を誘導します。このような不安定な天候パターンは、進行中の気候変動の直接的反映であることが報告されており、foresための一般的な天候パターンであることが予想されますeeable今後^13。増加霜耐性を提供することができ、経済的で効果的、かつ環境に配慮した経営手法や農薬を提供する努力は、理由のホストのための限られた成功を収めているが、これは、部分的に凍結耐性植物に回避メカニズムを凍結の複雑な性質に起因することができます。 ¹⁴

植物における霜の生存に関連する適応メカニズムは、伝統的に凍結耐性と回避を凍結、2つのカテゴリに分類されています。前者は、植物が存在し、その組織中の氷の脱水効果に関連する応力を許容することができ、遺伝子の特定のセットで規制生化学的機構に関連しています。後者は、典型的であるが、単独で、プラント¹⁴であれば、氷の形を決定し、植物の構造的側面 ​​と関連しないが。広告としての凍結回避の有病率にもかかわらず、aptive機構は、少し研究は、基礎となるメカニズム、凍結回避の調節を理解する最近で専念してきました。読者は、この問題に関するより詳細のための最近の総説¹⁵と呼ばれています。

低温での氷の形成は簡単なプロセスのように見えるかもしれないが、多くの要因が植物組織中での氷の核形成温度を決定することに寄与し、それが工場内に広がりますか。このような外因性および内因性の核の氷の存在などのパラメータ、不均一な対均一核イベント、熱ヒステリシス（不凍液）タンパク質、特定の糖および他のオスモライトの存在、および植物の構造的側面のホストがすべての重要なを再生することができます植物における凍結過程における役割。まとめると、これらのパラメータは、氷が開始され、それがどのように成長される植物は、凍結する温度に影響を与えます。また、得られた氷結晶の形態に影響を与えることができます。種々の方法は、磁気共鳴イメージング^{（MRI）17、}低温顕微鏡^18-19、低温走査型電子顕微鏡（LTSEM、核磁気共鳴分光法^（NMR）16を含む実験室条件下で植物における凍結過程を研究するために使用されています）。実験室とフィールドの設定で、植物全体の²⁰凍結は、しかし、主に熱電対を用いて監視されています。凍結を研究するための熱電対の使用は、水が液体から固体への相転移を受ける熱の放出（融解エンタルピー）に基づいています。凍結次に、発熱事象として記録される^。21-23を熱電対は、植物中で凍結研究において選択される典型的な方法であるにもかかわらず、その使用は、凍結事象の間に得 ​​られた情報の量を制限する多くの制限を有します。例えば、熱電対とそれがどのように伝播するか、氷が植物で開始されている場所を特定することはほぼ不可能に困難であり、それも速度で伝播している場合、一部の組織は、氷のない残っている場合。

高解像度の赤外線サーモグラフィ^{（HRIT）24-27}の進歩は、しかし、差動撮影モードで使用する場合は特に、植物全体で凍結プロセスに関する情報を取得する能力を大幅に増加している^。28-33本報告書では、凍結プロセスの様々な態様およびどこで、どのような温度で氷植物において開始される様々なパラメータに影響を研究するためのこの技術の使用を記載しています。プロトコルは高い、零下の温度での草本植物での凍結開始外因性核剤として作用する氷核活性（INA）細菌、 シュードモナスシリン （CIT-7）の能力を実証することが発表されます。

高解像度赤外線カメラ

このレポートに記載されたプロトコルおよび実施例は、高解像度の赤外線を利用しますビデオ放射計。放射計（ 図1）は、赤外線および可視スペクトル画像と温度データの組合せを供給する。カメラのスペクトル応答は、7.5から13.5ミクロンの範囲であり、640×480ピクセルの解像度を提供します。内蔵カメラで生成された可視スペクトルの画像が複雑な、熱画像の解釈を容易にする、リアルタイムでのIR画像と融合させることができます。カメラ用レンズの範囲は、クローズアップ、顕微鏡観察を行うために使用することができます。カメラは、スタンドアロンモードで使用、またはpropietaryソフトウェアを使用してラップトップコンピュータとインターフェースし、制御することができます。ソフトウェアが記録されたビデオに埋め込まれた温度データの様々な得るために使用することができます。これは、赤外線放射計の多種多様な商業的に入手可能であることに注意することが重要です。したがって、研究者が知識豊富な製品エンジニアとの意図された用途を議論していることと、研究者は、任意の仕の能力をテストすることが不可欠ですC放射計は、必要な情報を提供します。記載されているプロトコルで使用される撮像放射計は、アクリルボックスに発泡スチロールI N温暖化と冷却のプロトコルの間に結露への暴露を抑止するためで絶縁（ 図2）が配置されています。この保護は、すべてのカメラやアプリケーションのために必要とされません。

プロトコル

植物材料の調製

1. 対象植物材料（ ギボウシ属またはインゲンマメ ）のいずれかの葉や植物全体を使用してください。

氷核活性（INA）細菌を含有する水溶液の調製

1. メーカーの方向に100％グリセロールを10g / Lを用いて調製シュードモナス寒天Fに25℃でペトリ皿で培養INA菌、 シュードモナスシリン （株CIT-7）。
2. 必要になるまで培養した後、十分に4℃の場所に成長しているが、氷核活性の高いレベルを確保する前に2日間4℃で維持。
3. 使い捨て、プラスチックで寒天の表面から一枚板からの細菌を掻き取りまたは再利用可能な金属へらを使用して場所の時に脱イオン水を10〜15ミリリットルに25ミリリットルの使い捨てキュベットに。濃度が1×10 ^{9〜1×10 7}の範囲であるべきです^。· ミリリットル^-1。溶液が濁って表示されます。濃度はおおよそのことのみ必要があるとして、血球計または分光光度計を用いて濃度を確認する必要はありません。
4. 細菌を配布する10秒の最低キュベットを渦。
   注：結果INA混合物の特定の濃度は重要ではなく、記載されているプロトコルは、氷核活性の適切なレベル以上のものを提供します。 INA菌とこの水の混合物を、核実験の後半で使用されます。

3.凍結実験のセットアップ

1. 保護アクリルボックス内の高解像度赤外線カメラ（SC-660）を配置しているので、箱の前面の開口部を介してレンズのプロジェクトやボックスの後部開口部を介してノートパソコンや記録装置出口にカメラを接続する配線。箱の蓋を固定して、そのすべての意志の場所に環境室や冷凍庫の内部にボックスを配置OW主題植物材料が見られます。
   1. 反射された赤外線エネルギーからの干渉を防止するために、黒画用紙にチャンバの壁の内側を覆うことにより、植物材料の周りに暗い背景を提供します。
   2. 可視波長での記録画像が必要とされる場合、光源からの発熱を最小限に抑えるためにLED照明でチャンバーを取り付けます。植物がカメラで見えるようにするために、このようなバッテリ駆動クローゼット光または他の小型LED素子としての照明の唯一の最小値は、必要とされます。
      1. 対象植物材料の可視画像が撮影されると、LED照明をオフにします。ポートまたはチャンバ内の他の開口を介して、カメラへのすべての外部有線接続（コンピュータにFireWire接続、電源コードなど）を配布します。
   3. チャンバ内の温度勾配を回避または低減するために発泡絶縁材料を使用してポートまたは開口部に余分なスペースを埋めます。 1℃のチャンバーの初期温度を設定します。
2. 植物材料は、カメラの視野内にあり、植物材料は、リモート表示画面または選択されたソフトウェアの中に表示されるように、植物または植物の部分を合わせ。
3. 植物は、従来の制御凍結実験を開始する、植物材料の大きさに応じて、1時間に30分1℃で平衡化することを可能にします。これは、凍結実験が開始されると、植物の温度は何度により空気温度に遅れないことを保証します。植物材料の温度が空気温度の0.5℃以内である場合に平衡が達成されます。
   1. 鉢植えの植物を使用する場合には鉢植えの土の上に発泡スチロール断熱材の層を配置します。植物が平衡化した後は、室内の冷却開始。
      注：ポットの土壌表面上に絶縁層が植物の周囲の空気をポットから継続熱損失の量を低減し、FREから根を防ぎezing、このように一般的に起因する土壌中の残留熱本の巨大なタンクに自然の中で霜イベント中に発生しません。
4. 3.4.1-3.4.4で説明したように、所望のカメラパラメータ（カラー·パレット、温度範囲、関心の特定の領域など ） を設定します。
   1. ライブ画像を見ながら温度変化を表示するには、虹のパレットを選択します。
   2. ソフトウェアだけで画像の下に配置された温度·バーを調整することにより、5℃に温度スパンを設定します。
   3. 選択されたパレット（レインボー）で定義されているように擬似カラー画像に赤外線データを変換するためのリニアスケール（アルゴリズム）を選択し、5℃に温度の範囲を設定し、画像に基づいて自動的に追跡します。実験を行いながら別の方法として、手動で設定された範囲を調整します。
      1. SOFTWが提供する目的の定義された領域内の特定の点の温度または平均温度を使用してくださいです。 。記録されたビデオシーケンスから、または画像ファイルに埋め込 ​​まれた情報から、全ての画素の温度データを取得する3 ResearchIRソフトウェアの中から代表的なスクリーンショットを示します。
   4. 興味のある特定のポイントを表す植物組織上の位置にカーソルを置きます。ポイント（サイズは1 -3画素）、ボックス、線、楕円、または円として関心領域を定義します。ポイントまたは形状の複数の組み合わせは、画像の上に配置することができます。
5. ビデオシーケンスを記録します
   1. 60 Hzで、記録を手動で停止されるのを記録するためにカメラを設定します。
   2. 録画したビデオファイルが配置されるコンピュータまたは外部ドライブ上の場所を示しています。
   3. 録音開始。
      注：大規模なビデオファイルが生成されますので、外付けハードドライブへの録音を強くお勧めします。録画したビデオファイルは、後にNEを含む部分のみを含むように編集することができますcessary情報。これは、大幅にファイルサイズを小さくします。
   4. 0.5 -1.0°Cで増分室の温度を下げます。植物の温度が空気温度と平衡になるまで待ってから、0.5〜1.0°Cで再び温度を下げます。観察される植物組織の質量とその形態に応じて、平衡化は10〜15分かかることがあります。従って、約4℃/ hrの冷却速度を与えます。
   5. 植物のフリーズとの観測が完了するまで、このように続けます。凍結プロセスが完了したときに記録を終了します。
      注意：それらは同じ温度であるため、植物材料と背景が同じ色である場合に、植物組織は、空気温度で平衡化しました。背景温度や植物組織の温度が同じであるため、再度温度を下げるまで、植物材料を可視化することが困難であり、植物組織とAとの間の温度差がありますIR温度。

結果

アイス+細菌の氷核形成活性を、 シュードモナスシリン （株CIT-7）

10μlの水の低下とPを含む水10μl syringaeの （CIT-7）ギボウシの葉の背軸面上に置いた（ ギボウシ属 ）（ 図4）。図示のように、INA菌を含む水の低下は最初凍結し、葉の表面に水滴が凍結されていないままフリーズする葉の誘導を担当していました。

ディスカッション

水は十分に0℃以下の温度に過冷却する能力を有しており、水が凍結する温度は非常に可変であることができる^。36純水の過冷却温度の上限は、約-40℃であり、均一な核形成点として定義されます。暖かい温度で水が凍結がより-40℃、それは次いで、氷の形成と成長のための触媒として機能する形成するために、小さな氷の胚を可能にする核不均一の存在によってもたらされた場合^...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1