L'uso di ad alta risoluzione termografia a infrarossi (HRIT) per lo studio di ghiaccio nucleazione del ghiaccio e propagazione nelle piante

Riepilogo

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Abstract

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

Introduzione

Temperature di congelamento che si verificano quando le piante sono in attiva crescita può essere letale, in particolare se la pianta ha poca o nessuna tolleranza congelamento. Tali eventi gelo spesso hanno effetti devastanti sulla produzione agricola e possono svolgere un ruolo importante nel plasmare la struttura della comunità in popolazioni naturali di piante, in particolare in montagna, gli ecosistemi sub-artiche e artiche ^1-6. Gli episodi di gravi gelate primaverili hanno avuto maggiori impatti sulla produzione di frutta negli Stati Uniti e in Sud America, negli ultimi anni ^7-9 e sono stati esacerbati dalla precoce inizio della stagione calda seguita da più tipici basse temperature medie. Il clima caldo precoce induce i germogli di rompere, attivando la crescita di nuovi germogli, foglie e fiori che hanno tutti molto poco o nessun tolleranza al freddo ^1,3,10-12. Tali condizioni meteorologiche imprevedibili sono stati segnalati per essere un riflesso diretto del cambiamento climatico in corso e si prevede che essere un modello di tempo comune per Foresfuturo eeable ^13. Gli sforzi per fornire tecniche di gestione economiche, efficaci e rispettosi dell'ambiente o prodotti agrochimici in grado di fornire una maggiore tolleranza al freddo hanno avuto un successo limitato per una serie di motivi, ma questo può essere in parte attribuito alla natura complessa di congelare la tolleranza e il congelamento dei meccanismi di evitamento nelle piante. ¹⁴

I meccanismi di adattamento associata a sopravvivenza gelo nelle piante sono stati tradizionalmente divisi in due categorie, il congelamento la tolleranza e il congelamento di evitamento. La prima categoria è associata con meccanismi biochimici regolati da uno specifico set di geni che permettono alle piante di tollerare tensioni associate con la presenza e l'effetto dehydrative di ghiaccio nei suoi tessuti. Mentre quest'ultima categoria è tipicamente, ma non esclusivamente, associato ad aspetti strutturali di una pianta che determinano se, quando, e dove si forma il ghiaccio in un impianto di ^14. Nonostante la prevalenza di evasione freeze come un annuncioMeccanismo aptive, poca ricerca è stata dedicata negli ultimi tempi per la comprensione dei meccanismi e regolazione di evasione freeze sottostanti. Il lettore si riferisce a una recente revisione ¹⁵ per maggiori dettagli in merito.

Mentre la formazione di ghiaccio a basse temperature può sembrare un processo semplice, molti fattori contribuiscono a determinare la temperatura alla quale il ghiaccio nucleates in tessuti vegetali e come si diffonde all'interno della pianta. Parametri come la presenza di ghiaccio estrinseca e intrinseca nucleatori, eterogenei vs eventi nucleazione omogenea, termico-isteresi (antigelo) proteine, la presenza di zuccheri specifici e altri osmoliti, e una serie di aspetti strutturali della pianta possono tutti giocare un significativo ruolo nel processo di congelamento in impianti. Collettivamente, questi parametri influenzano la temperatura alla quale una pianta gela, in cui viene iniziata ghiaccio e come cresce. Essi possono anche influenzare la morfologia dei cristalli di ghiaccio risultanti.Vari metodi sono stati utilizzati per studiare il processo di congelamento in impianti in condizioni di laboratorio, compresa la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) ^16, la risonanza magnetica (MRI) ^17, crio-microscopia ^18-19, e bassa temperatura di microscopia elettronica a scansione (LTSEM ). ²⁰ Congelamento di piante intere in laboratorio e sul campo, però, è soprattutto stata monitorata con termocoppie. L'uso di termocoppie per studiare congelamento si basa sulla liberazione di calore (entalpia di fusione) quando l'acqua subisce una transizione di fase da liquido a solido. Congelamento viene quindi registrato come un evento esotermica. ^21-23 Sebbene termocoppie sono il tipico metodo di scelta nello studio congelamento nelle piante, il loro uso ha molte limitazioni che limitano la quantità di informazioni ottenute durante un evento di congelamento. Ad esempio, con termocoppie è difficile quasi impossibile determinare dove viene iniziata ghiaccio in piante, come si propaga,se si propaga ad una frequenza costante, e se alcuni tessuti rimangono liberi di ghiaccio.

I progressi in alta risoluzione termografia a infrarossi (HRIT) ^24-27, però, hanno aumentato significativamente la capacità di ottenere informazioni sul processo di congelamento di piante intere, specialmente se usata in modalità di imaging differenziale. ^28-33 Nella presente relazione, abbiamo descrivere l'uso di questa tecnologia per studiare vari aspetti del processo di congelamento e vari parametri che influiscono dove e ghiaccio ea quale temperatura è iniziata nelle piante. Un protocollo sarà presentato che dimostrare la capacità del batterio di ghiaccio-nucleazione-attiva (INA), Pseudomonas syringae (Cit-7) per agire come un nucleator estrinseca avvio congelamento in una pianta erbacea ad una temperatura elevata sotto zero.

Ad alta risoluzione telecamera a infrarossi

Il protocollo e gli esempi documentati in questo rapporto utilizzano una alta risoluzione infrarossiVideo radiometro. Il radiometro (figura 1) fornisce un insieme di immagini spettro all'infrarosso e nel visibile e dati di temperatura. La risposta spettrale della fotocamera è nel range di 7,5-13,5 pm e fornisce 640 x 480 pixel. Immagini spettro visibile generati dalla fotocamera incorporata può essere fuso con IR-immagini in tempo reale, che facilita l'interpretazione dei complessi, immagini termiche. Una gamma di lenti per la macchina fotografica può essere usato per fare close-up e osservazioni microscopiche. La telecamera può essere utilizzata in una modalità autonoma, o interfacciato e controllato con un computer portatile utilizzando il software propietari. Il software può essere utilizzato per ottenere una varietà di dati termici incorporati nei video registrati. E 'importante notare che una grande varietà di radiometri infrarossi sono disponibili in commercio. Pertanto, è essenziale che il ricercatore discutere l'applicazione prevista con un tecnico esperto del prodotto e che il ricercatore testare la capacità di qualsiasi specific radiometro a fornire le informazioni necessarie. Il radiometro di imaging utilizzata nel protocollo descritto è posto in una scatola di acrilico (Figura 2) isolato con Styrofoam i n fine di dissuadere l'esposizione alla condensa durante i protocolli di riscaldamento e raffreddamento. Questa protezione non è necessaria per tutte le telecamere o le applicazioni.

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Protocollo

1. Preparazione di materiali vegetali

1. Utilizzare sia foglie o piante intere di materiale vegetale soggetto (Hosta spp. O Phaseolus vulgaris).

2. Preparazione di Water Solutions contenenti ghiaccio nucleazione attivi (INA) Batteri

1. Culture batterio INA, Pseudomonas syringae (Strain Cit-7) in capsule di Petri a 25 ° C su Pseudomonas Agar F preparato con 10 g / L di 100% glicerolo per la direzione del produttore.
2. Dopo culture sono cresciuti sufficientemente, posto a 4 ° C fino al momento dell'uso, ma mantenere a 4 ° C per due giorni prima di garantire un elevato livello di attività nucleazione del ghiaccio.
3. Raschiare batteri da una singola placca dalla superficie del agar con una plastica, monouso o riutilizzabile spatola metallica al momento dell'uso e posto in 10-15 ml di acqua deionizzata in un 25 ml cuvetta monouso. La concentrazione deve essere nel range di 1 x ^07-01 Ottobre x 10 ^{9 ·} Ml ^-1. La soluzione apparirà nuvoloso. Non è necessario per confermare la concentrazione utilizzando un emocitometro o spettrofotometro, la concentrazione deve essere solo approssimativa.
4. Agitare la cuvetta per un minimo di 10 secondi per distribuire i batteri.
   Nota: la concentrazione specifica della miscela INA risultante non è importante e il protocollo descritto fornirà più di un adeguato livello di attività di nucleazione del ghiaccio. Questa miscela di batteri INA e acqua sarà utilizzato in seguito negli esperimenti di nucleazione.

3. Impostazione di un esperimento di congelamento

1. Posizionare la telecamera a infrarossi alta risoluzione (SC-660) all'interno della scatola acrilica di protezione in modo che i progetti lente attraverso l'apertura nella parte anteriore della scatola e sui cavi la fotocamera a un dispositivo di uscita laptop o la registrazione attraverso l'apertura posteriore della scatola . Fissare il coperchio della scatola e posizionare la scatola dentro la camera ambientale o congelatore in una posizione che saranno tuttiow il materiale vegetale soggetto di essere visto.
   1. Fornire un fondo scuro intorno al materiale vegetale da lungo le pareti della camera con cartoncino nero per evitare interferenze da energia infrarossa riflessa.
   2. Montare la camera con illuminazione a LED per ridurre al minimo il riscaldamento dalla fonte di luce quando è richiesta la registrazione di immagini in lunghezze d'onda visibili. Solo un minimo di illuminazione, ad esempio una luce di armadio a batteria o altro piccolo dispositivo LED, è necessaria per gli impianti siano visibili dalla telecamera.
      1. Una volta prese le immagini visibili del materiale vegetale soggetto, spegnere l'illuminazione a LED. Distribuire tutte le connessioni esterne cablate (collegamento firewire al calcolatore, cavo di alimentazione, ecc) alla fotocamera tramite un porto o altra apertura nella camera.
   3. Riempite ogni spazio nel porto o apertura con materiale isolante in schiuma per evitare o ridurre i gradienti di temperatura all'interno della camera. Impostare la temperatura iniziale della camera a 1 ° C.
2. Allineate piante o parti di piante in modo che il materiale vegetale è nel campo di vista-della telecamera e il materiale vegetale è visibile sulla schermata di visualizzazione remota o all'interno del software scelto.
3. Consentire piante equilibrare a 1 ° C per 30 minuti a 1 ora, a seconda delle dimensioni del materiale vegetale, prima di iniziare un esperimento di congelamento controllato. Questo assicura che la temperatura della pianta non ritardo temperatura dell'aria da molti gradi dopo l'inizio dell'esperimento di congelamento. Equilibrazione viene raggiunta quando la temperatura del materiale vegetale è entro 0,5 ° C di temperatura dell'aria.
   1. Posizionare uno strato di isolamento Styrofoam sulla parte superiore del terreno di piante in vaso se vengono utilizzate piante in vaso. Una volta che le piante sono equilibrati, iniziare il raffreddamento della camera.
      Nota: Lo strato di isolante sulla superficie del terreno della pentola riduce la quantità di continua perdita di calore dal piatto per l'aria circostante l'impianto, e previene le radici da freezing, in quanto ciò non si verificano in genere durante un evento gelo in natura a causa della massiccia serbatoio di calore residuo presente nel terreno.
4. Impostare i parametri della telecamera desiderati (tavolozza dei colori, range di temperatura, specifiche aree di interesse, ecc), come discusso in 3.4.1-3.4.4.
   1. Selezionare la tavolozza arcobaleno per visualizzare le variazioni di temperatura durante la visualizzazione dell'immagine live.
   2. Impostare l'intervallo di temperatura di 5 ° C regolando la barra di temperatura posta appena sotto l'immagine nel software.
   3. Scegliere la scala lineare (algoritmo) per convertire i dati infrarossi nell'immagine a falsi colori come definito dalla palette selezionata (arcobaleno) e impostare l'intervallo di temperature di 5 ° C e per monitorare automaticamente in base all'immagine. In alternativa, regolare la gamma insieme manualmente durante la conduzione dell'esperimento.
      1. Utilizzare la temperatura di un punto specifico o la temperatura media all'interno dell'area definita di interesse fornito dalla softwsono. Recuperare i dati di temperatura di tutti i pixel dalla sequenza video registrato o da informazioni incorporate nel file di immagine. La figura 3 mostra una tipica schermata dal software ResearchIR.
   4. Posizionare un cursore su una posizione sul tessuto vegetale che rappresenta un punto di interesse specifico. Definire l'area di interesse come punti (1 -3 pixel), scatole, linee, ellissi o cerchi. Molteplici combinazioni di punti e forme possono essere posizionati sopra l'immagine.
5. Registrazione di una sequenza video
   1. Impostare la fotocamera per registrare a 60 Hz e per la registrazione di essere fermato manualmente.
   2. Indicare la posizione del computer o disco esterno dove verrà posizionato il file video registrato.
   3. Iniziare la registrazione.
      Nota: La registrazione di un disco rigido esterno altamente è raccomandata in quanto verranno generati file video di grandi dimensioni. I file video registrati possono essere successivamente modificati per includere solo la parte contenente il neinformazioni sario. Questo ridurrà di molto la dimensione del file.
   4. Abbassare la temperatura della camera incrementale di 0,5 -1.0 ° C. Attendere che la temperatura dell'impianto equilibra con la temperatura dell'aria e abbassare di nuovo la temperatura di 0,5-1,0 ° C. A seconda della massa del tessuto vegetale viene osservato e la sua morfologia, equilibramento può richiedere da 10 a 15 min. Così, dando una velocità di raffreddamento di circa 4 ° C / hr.
   5. Continuare in questo modo fino a quando l'impianto si blocca e le osservazioni sono stati completati. Terminare la registrazione quando il processo di congelamento è stato completato.
      Nota: Il tessuto vegetale è equilibrata con temperatura dell'aria quando il materiale vegetale e sfondo sono dello stesso colore poiché sono alla stessa temperatura. Poiché la temperatura del fondo e la temperatura del tessuto vegetale sono gli stessi, può essere difficile visualizzare il materiale vegetale fino a nuovo abbassare la temperatura e c'è differenza di temperatura tra il tessuto vegetale etemperatura ir.

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Risultati

Attività di Ice-nucleazione del ghiaccio + batterio, Pseudomonas syringae (ceppo Cit-7)

Una goccia 10 ml di acqua e 10 ml di acqua contenente P. syringae (Cit-7) sono stati collocati sulla superficie di una foglia abassiale Hosta (Hosta spp.) (Figura 4). Come illustrato, la goccia d'acqua contenente batteri INA congelato prima ed era responsabile per indurre la foglia di congelare mentre la goccia d'acqua sulla superficie del foglio è rim...

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Discussione

L'acqua ha la capacità di Supercool a temperature inferiori a 0 ° C e la temperatura alla quale l'acqua si congela può essere molto variabile. ³⁶ Il limite di temperatura per sottoraffreddamento di acqua pura è di circa -40 ° C ed è definito come il punto di nucleazione omogenea. Quando l'acqua gela A temperature superiori a -40 ° C si è portato dalla presenza di eterogeneo nucleatori che consentono piccoli embrioni di ghiaccio di forma che poi servire come catalizzatore per la formazione ...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1