Die Verwendung von hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) für das Studium der Ice Ice Keimbildung und Ausbreitung in Pflanzen

Zusammenfassung

Here we present a protocol that allows one to visualize sites of ice formation and avenues of ice propagation in plants utilizing high resolution infrared thermography (HRIT).

Zusammenfassung

Freezing events that occur when plants are actively growing can be a lethal event, particularly if the plant has no freezing tolerance. Such frost events often have devastating effects on agricultural production and can also play an important role in shaping community structure in natural populations of plants, especially in alpine, sub-arctic, and arctic ecosystems. Therefore, a better understanding of the freezing process in plants can play an important role in the development of methods of frost protection and understanding mechanisms of freeze avoidance. Here, we describe a protocol to visualize the freezing process in plants using high-resolution infrared thermography (HRIT). The use of this technology allows one to determine the primary sites of ice formation in plants, how ice propagates, and the presence of ice barriers. Furthermore, it allows one to examine the role of extrinsic and intrinsic nucleators in determining the temperature at which plants freeze and evaluate the ability of various compounds to either affect the freezing process or increase freezing tolerance. The use of HRIT allows one to visualize the many adaptations that have evolved in plants, which directly or indirectly impact the freezing process and ultimately enables plants to survive frost events.

Einleitung

Eisigen Temperaturen, die beim Pflanzen aktiv wachsenden auftreten kann tödlich sein, vor allem, wenn die Anlage hat wenig oder keine Frosttoleranz. Solche Frost Ereignisse haben oft verheerende Auswirkungen auf die landwirtschaftliche Produktion und können auch eine wichtige Rolle bei der Gestaltung der Gemeinschaftsstruktur in natürlichen Populationen von Pflanzen, vor allem im alpinen, subarktischen und arktischen Ökosysteme ^1-6. Episoden starker Frühlingsfrösten haben große Auswirkungen auf Obstproduktion in den USA und Südamerika in den letzten Jahren ^7-9 hatten und wurden von der frühen Beginn der warmen Wetter, gefolgt von mehr typische mittlere niedrigen Temperaturen verschärft. Die frühe warme Wetter induziert Knospen zu brechen, aktivieren das Wachstum der neuen Triebe, Blätter und Blumen, die alle sehr wenig bis gar keine Frosttoleranz ^1,3,10-12 haben. Solche unberechenbar Wettermuster sind berichtet worden, um eine direkte Reflexion der fortschreitenden Klimawandel und erwartet, dass sie ein gemeinsames Wettermuster für die fores seineeable Zukunft ^13. Die Bemühungen um die wirtschaftliche, effektive und umweltfreundliche Management-Techniken oder Agrochemikalien, die eine erhöhte Frosttoleranz bereitstellen kann einen begrenzten Erfolg für eine Vielzahl von Gründen, hatte aber das kann teilweise auf die Komplexität der Frosttoleranz und Gefriervermeidungsmechanismen in Pflanzen zurückgeführt werden. ¹⁴

Die adaptiven Mechanismen mit Frost Überleben in Pflanzen assoziiert sind traditionell in zwei Kategorien eingeteilt, das Einfrieren und Gefriertoleranz Vermeidung. Die erste Kategorie ist mit biochemischen Mechanismen, durch eine bestimmte Gruppe von Genen, die Pflanzen, die Spannungen mit der Gegenwart und der dehydratisierende Wirkung von Eis in seinen Geweben tolerieren ermöglichen geregelt verbunden. Während die letztere Kategorie ist typischerweise, aber nicht ausschließlich, mit strukturellen Aspekte einer Pflanze, die, wenn zu bestimmen, wann und wo sich Eis in einer Pflanze ¹⁴ verbunden. Trotz der Prävalenz von freeze Vermeidung als Ad-aptive Mechanismus hat wenig Forschung in der letzten Zeit für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen und Regulation der Gefriert Vermeidung gewidmet. Der Leser wird auf eine aktuelle Übersicht ¹⁵ für mehr Details zu diesem Thema verwiesen.

Während die Bildung von Eis bei niedrigen Temperaturen kann wie ein einfacher Prozess erscheinen, viele Faktoren tragen zur Bestimmung der Temperatur, bei der Eis Keime in Pflanzengewebe und wie es breitet sich in der Anlage. Parameter, wie die Anwesenheit von extrinsischen und intrinsischen Eiskernbildnern heterogene vs. homogene Keimbildung, thermische Hysterese (Frostschutz) Proteine, das Vorhandensein von spezifischen Zucker und anderen Osmolyten, und eine Vielzahl von strukturellen Aspekte der Anlage spielen eine bedeutende Rolle des Gefrierprozesses in Pflanzen. Gemeinsam beeinflussen diese Parameter die Temperatur, bei der eine Pflanze friert, wo Eis initiiert und wie es wächst. Sie kann auch Auswirkungen auf die Morphologie der resultierenden Eiskristallen.Verschiedene Verfahren wurden verwendet, um den Gefrierprozeß in Pflanzen, die unter Laborbedingungen, einschließlich kernmagnetischer Resonanzspektroskopie (NMR) ^16, Kernspintomographie (MRI) ^17, Kryo-Mikroskopie ^18-19 und Tieftemperatur-Rasterelektronenmikroskopie Studie (LTSEM ). ²⁰ Freezing ganzer Pflanzen im Labor- und Feldeinstellungen hat sich jedoch hauptsächlich mit Thermoelementen überwacht. Die Verwendung von Thermoelementen, um ein Einfrieren zu studieren ist an der Freisetzung von Wärme (Schmelzwärme), wenn das Wasser einen Phasenübergang von einer Flüssigkeit zu einem Feststoff basiert. Einfrieren wird dann als exotherme Ereignis aufgezeichnet. ^21-23 Obwohl Thermoelemente sind das typische Verfahren der Wahl bei der Untersuchung Gefrier in Pflanzen hat ihre Verwendung vielen Einschränkungen, die die Menge an Informationen während eines Gefrier Ereignis erhalten begrenzen. Zum Beispiel mit Thermoelementen ist es schwierig, fast unmöglich, zu bestimmen, wo das Eis in Pflanzen angezogen, wie sie ausbreitet,wenn es breitet sich mit gleichmäßiger Rate, und wenn einige Gewebe eisfrei bleiben.

Fortschritte in der hochauflösenden Infrarot-Thermografie (HRIT) ^24-27 haben jedoch deutlich erhöht die Fähigkeit, Informationen über den Gefrierprozess in ganzen Pflanzen zu erhalten, vor allem, wenn in einem Differential Imaging-Modus verwendet. ^28-33 In diesem Bericht haben wir beschreiben die Verwendung dieser Technologie, um verschiedene Aspekte des Gefrierprozesses und verschiedene Parameter, die beeinflussen, wo und bei welcher Temperatur und Eis in Pflanzen begonnen zu studieren. Ein Protokoll vorgestellt werden, die die Fähigkeit des Eis-Nukleation aktive (INA) Bakterium Pseudomonas syringae (Cit-7) als extrinsische Nukleator Einleitung Einfrieren in eine krautige Pflanze auf einem hohen, unter Null Temperatur handeln demonstrieren wird.

Hochauflösende Infrarot-Kamera

Das Protokoll und die Beispiele in diesem Bericht dokumentiert nutzen eine hochauflösende Infrarot-Video-Radiometer. Das Radiometer (1) liefert eine Kombination von Infrarot- und sichtbaren Spektrums Bilder und Temperaturdaten. Die spektrale Empfindlichkeit der Kamera ist im Bereich von 7,5 bis 13,5 um und liefert 640 x 480 Pixel Auflösung. Sichtbaren Spektrums erzeugt Bilder durch die integrierte Kamera mit IR-Bilder in Echtzeit, was die Auslegung komplexer, Wärmebilder erleichtert fusioniert werden. Eine Reihe von Linsen für die Kamera verwendet werden, um Nahaufnahmen und mikroskopische Beobachtungen zu machen. Die Kamera kann in einem Standalone-Modus verwendet werden, oder eine Schnittstelle mit einem Laptop mit propietary Software gesteuert. Die Software kann verwendet werden, um eine Vielzahl von in den aufgezeichneten Videos eingebettet thermische Daten zu erhalten. Es ist wichtig anzumerken, dass eine Vielzahl von Infrarot-Radiometer sind kommerziell verfügbar. Daher ist es wichtig, dass die Forscher über ihre vorgesehene Anwendung mit einem erfahrenen Produktingenieur und dass der Forscher testen die Fähigkeit eines spezific Radiometer, um die erforderlichen Informationen zur Verfügung stellen. Das bildgebende Radiometer in der beschriebenen Protokoll verwendet wird, in einem Acryl-Box mit Styropor i n, um die Exposition während der Erwärmung und Abkühlung Protokolle, um Kondensation abzuschrecken isoliert (Abbildung 2) platziert. Dieser Schutz wird nicht für alle Kameras oder Anwendungen benötigt.

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Protokoll

1. Herstellung von Pflanzenmaterialien

1. Verwenden Sie entweder Blätter oder ganze Pflanzen unterliegen Pflanzenmaterial (Hosta spp. Oder Phaseolus vulgaris).

2. Herstellung von Wasserlösungen, die Eisnukleation Aktiv (INA) Bacteria

1. Kultur der INA Bakterium Pseudomonas syringae (Stamm Cit-7) in Petrischalen bei 25 ° C auf Pseudomonas Agar F mit 10 g / l 100% Glycerin gemäß den Hersteller Richtung vorbereitet.
2. Nach Kulturen ausreichend, bei 4 ° C gezüchtet, bis sie benötigt aber halten Sie bei 4 ° C für zwei Tage vor der ein hohes Maß an Eiskeimbildungsaktivität gewährleisten.
3. Schaben Bakterien aus einer einzigen Platte von der Oberfläche des Agars mit einem Kunststoff, wegwerfbar oder wiederverwendbar Spatel zum Zeitpunkt der Verwendung und in 10-15 ml entionisiertem Wasser in einem 25 ml-Einwegküvette. Die Konzentration sollte im Bereich von 1 × 10 ⁷ bis 1 x 10 ⁹ be ^· Ml ^-1. Die Lösung wird trübe erscheinen. Es besteht keine Notwendigkeit, um die Konzentration unter Verwendung eines Hämozytometers oder Spektralphotometer bestätigen, wie Konzentration muss nur ungefähr sein.
4. Vortexen Küvette für ein Minimum von 10 Sekunden, um die Bakterien zu verteilen.
   Hinweis: Die spezifische Konzentration des erhaltenen INA Gemisch ist nicht wichtig, und die beschriebenen Protokoll wird mehr als ein angemessenes Niveau der Eiskeimbildungsaktivität. Diese Mischung von INA-Bakterien und Wasser wird dann in den Keim Experimente eingesetzt werden.

3. Einrichten eines Freezing Experiment

1. Legen Sie die hochauflösende Infrarotkamera (SC-660) im Inneren des Schutz Acryl-Box, so dass die Linse durch die Öffnung in der Vorderseite der Box und die Drähte der Kamera an einen Laptop oder Aufnahmegerät Ausgang Verbindung durch die hintere Öffnung der Box . Sichern Sie den Deckel der Box und legen Sie das Feld in der Klimakammer oder Gefrierschrank an einem Ort, werden alleow Gegenstand Pflanzenmaterials abzuwarten.
   1. Geben Sie einen dunklen Hintergrund rund um die Pflanze Material von den Wänden der Kammer mit schwarzem Papier, um Störungen durch reflektierte Infrarotenergie zu verhindern.
   2. Setzen Sie die Kammer mit LED-Beleuchtung, um Heizung von der Lichtquelle zu minimieren, wenn die Aufzeichnung von Bildern in sichtbaren Wellenlängen erforderlich ist. Nur ein Minimum an Licht, wie beispielsweise eine batteriebetriebene Schrank Licht oder andere kleine LED-Vorrichtung wird benötigt für die Pflanzen durch die Kamera sichtbar sind.
      1. Sobald sichtbare Bilder des Themas Pflanzenmaterial aufgenommen werden, schalten Sie die LED-Beleuchtung. Alle von externen Kabelverbindungen (FireWire-Anschluss zum Computer, Netzkabel, etc.), um die Kamera über einen Port oder eine andere Öffnung in der Kammer.
   3. Füllen Sie zusätzlichen Platz im Hafen oder die Öffnung mit isolierendem Schaummaterial zu vermeiden oder zu reduzieren Temperaturgradienten innerhalb der Kammer. Stellen Sie die Anfangstemperatur der Kammer bei 1 ° C.
2. Ausrichten Pflanzen oder Pflanzenteile, so dass das Pflanzenmaterial in der Gesichtsfeldansicht der Kamera und das Pflanzenmaterial sichtbar ist auf der Fernbetrachtungsschirm oder innerhalb des gewählten Software.
3. Erlauben Pflanzen auf 1 ° C für 30 min bis 1 Stunde vor dem Einleiten eines gesteuerten Gefrier Experiment äquilibrieren, abhängig von der Größe des Pflanzenmaterials. Dies stellt sicher, dass die Temperatur der Anlage nicht hinter Lufttemperatur liegen sie um viele Grade sobald das Einfrieren Experiment begonnen wird. Äquilibrierung wird erreicht, wenn die Temperatur des Pflanzenmaterials innerhalb von 0,5 ° C Lufttemperatur.
   1. Eine Schicht Styropor-Isolierung auf dem Boden von Topfpflanzen, wenn Topfpflanzen eingesetzt werden. Sobald die Pflanzen äquilibriert beginnen Abkühlen der Kammer.
      Anmerkung: Die Isolationsschicht auf der Bodenoberfläche des Topfes reduziert den Wärmeverlust weiter aus dem Topf zur Luft die Pflanze umgibt, und verhindert, dass die Wurzeln aus freezing, da dies in der Regel nicht während einer Frostereignis in der Natur vorkommen würde aufgrund der massiven Reservoir im Boden vorhandene Restwärme.
4. Stellen Sie die gewünschten Kameraparameter (Farbpalette, Temperaturbereich, bestimmte Bereiche von Interesse, etc.), wie in 3.4.1-3.4.4 diskutiert.
   1. Wählen Sie den Regenbogen-Palette, um die Temperaturschwankungen angezeigt, während Sie das Live-Bild.
   2. Den Temperaturspanne auf 5 ° C durch Einstellen der Temperatur Leiste unter dem Bild in der Software liegt.
   3. Wählen Sie die lineare Skala (Algorithmus) zur Umwandlung der Infrarotdaten in das Falschfarbenbild, wie durch die ausgewählte Palette (rainbow) definiert und stellen Sie den Temperaturbereich bis 5 ° C und automatisch zu verfolgen auf der Basis des Bildes. Alternativ können die eingestellten Bereich manuell einzustellen, während Durchführung des Experiments.
      1. Verwenden Sie die Temperatur einen bestimmten Punkt oder eine durchschnittliche Temperatur innerhalb des definierten interessierenden Bereich von der Softw bereitgestelltsind. Abrufen der Temperaturdaten aller Pixel aus der aufgezeichneten Videosequenz oder aus den Informationen in der Bilddatei eingebettet sind, Fig. 3 zeigt eine typische Bildschirm aus ResearchIR Software.
   4. Platzieren Sie einen Cursor auf einem Standort auf dem Pflanzengewebe, die einen bestimmten Punkt von Interesse darstellt. Definieren Sie den Bereich von Interesse als Punkte (1 -3 Pixel groß), Boxen, Linien, Ellipsen oder Kreise. Mehrere Kombinationen von Punkten oder Formen können auf das Bild befinden.
5. Aufzeichnen einer Videosequenz
   1. Stellen Sie die Kamera auf 60 Hz und für die Aufnahme manuell gestoppt werden aufzuzeichnen.
   2. Geben Sie die Stelle auf dem Computer oder einem externen Laufwerk, in dem die aufgenommene Videodatei platziert wird.
   3. Beginnt die Aufnahme.
      Hinweis: Aufnahme auf eine externe Festplatte ist sehr zu empfehlen, da große Video-Dateien generiert. Aufgenommenen Videodateien können später bearbeitet werden, um nur den Teil mit dem ne enthalten seinwendigen Informationen. Dies wird erheblich reduziert die Dateigröße.
   4. Senken Sie die Temperatur der Kammer schrittweise um 0,5 -1,0 ° C. Warten Sie, bis die Anlage Temperatur im Gleichgewicht mit Lufttemperatur und dann senken Sie die Temperatur wieder um 0,5 bis 1,0 ° C. Je nach Masse des Pflanzengewebes beobachtet und ihre Morphologie kann Äquilibrierung 10-15 min dauern. Somit geben eine Abkühlgeschwindigkeit von etwa 4 ° C / h beträgt.
   5. Fahren Sie so fort, bis die Anlage friert und Beobachtungen abgeschlossen sind. Beenden Sie die Aufnahme, wenn der Gefrierprozess abgeschlossen ist.
      Hinweis: Das Pflanzengewebe wurde mit Luft Temperatur äquilibriert, wenn das Pflanzenmaterial und den Hintergrund dieselbe Farbe haben, da sie bei der gleichen Temperatur. Da der Hintergrundtemperatur und der Temperatur des Pflanzengewebes gleich sind, kann es schwierig sein, das Pflanzenmaterial zu visualisieren, bis wieder senken die Temperatur, und es ist die Temperaturdifferenz zwischen dem Pflanzengewebe undir Temperatur.

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Ergebnisse

Ice-Keimbildungsaktivität der Ice + Bakterium Pseudomonas syringae (Stamm Cit-7)

Ein 10 ul Tropfen Wasser und 10 ul Wasser, P. syringae (Cit-7) wurden auf der Oberfläche eines abaxial Hosta Blatt gelegt (Hosta spp.) (Figur 4). Wie dargestellt, ist der Wassertropfen, die die INA Bakterien erstarrte erste und war für das Blatt zu induzieren zu frieren, während der Tropfen Wasser auf der Blattoberfläche blieb nicht gefrorenen verantwortlich.

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Diskussion

Wasser hat die Fähigkeit, auf Temperaturen von weit unter 0 ° C und der Temperatur, bei der Wasser gefriert können ziemlich variabel sein, zu unterkühlen. ³⁶ Die Temperaturgrenze für die Unterkühlung von reinem Wasser beträgt etwa -40 ° C und wird als die homogene Keimpunkt definiert. Wenn Wasser gefriert bei Temperaturen wärmer als -40 ° C wird durch die Anwesenheit von heterogenen Keimbildnern, dass gebracht ermöglichen kleinen Eis Embryonen zu bilden, die dann als Katalysator für die Bildung vo...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infrared Camera	FLIR	SC-660	Many models available depending on application
Infrared Analytical Software	FLIR	ResearchIR 4.10.2.5	$3,500
Pseudomonas syringae (strain Cit-7)			Kindly provided by Dr. Steven Lindow, University of California  Berkeley icelab@berkeley.edu
Pseudomonas Agar F	Fisher Scientific	DF0448-17-1